Bevezetés

familiáris többszörös Lipomatosis (FML, OMIM% 151,900) egy ritka autoszomális domináns rendellenesség hypodermis jellemzi a fejlesztés jól kapszulázott szubkután csomók a végtagok és a törzs.1 első jelentések több adipocitikus tumorok 1846 óta Sir Benjamin Brodie.A blaschko (1891) és az Alsberg (1892) későbbi eredményei a sérülések családi kiújulását igazolták, és a hímek körében gyakoribb előfordulást figyeltek meg.1,3,4 az ezt követő években, sok más szerzők megjelent családok jellemzői erősen szuggesztív FML,1, 5, 6 végül 1970-ben Das Gupta minősített lipomatous tumorok három kategóriában: magányos vagy szórványos, FML és többszörös szimmetrikus Lipomatosis (MSL).7,8

A magányos lipomákat a lágy szövetek leggyakoribb jóindulatú daganatának tekintik felnőtteknél, de az egyének 5% – ában több lipoma fordul elő.9,10 az FML pontos prevalenciája nem ismert, de becslések szerint 0,002%.8,11,12 a csomók kora 30-40 év között van, elérve a maximális csúcsot az 50-es években.6,8,13,14 széles körben elterjedt, hogy ez a rendellenesség előnyben részesíti a férfiakat, azonban számos mű bizonyítja, hogy mindkét nem egyformán érintett.15-17 bár jóindulatú betegségnek tekintik, egyes egyéneknél kozmetikai aggályok jelentkezhetnek, amelyek rontják életminőségüket. Sőt, az elhízott egyénekben is elterjedt.9

eddig az FML-ben rendelkezésre álló kutatások kifejezetten a klinikai szempontokra összpontosítottak,a molekuláris kérdéseket általában nem vizsgálják. A szakirodalom azt sugallja, hogy a sporadikus lipomák legalább 70%-a A 12q13-15 sávot érintő citogenetikai átrendeződésekből származik, ami a HMGA2 (High Mobility Group AT-hook 2) gén deregulált expressziójához vezethet. Ez a gén kódolja a DNS konformációs változásokért, aberráns sejtproliferációért és a jóindulatú mezenchimális daganatok kialakulásáért felelős nem hiszton kromatin fehérjéket.18-20

Felismerve a molekuláris alapja genetikai feltételek, a végrehajtás a nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák lehetővé tette, hogy vizsgálja meg a forgatás más mechanizmusainak etiológiájú több genodermatosis. Ezért ez a tanulmány hét FML-ben szenvedő személy klinikai és molekuláris jellemzését célozta meg, hogy hat, a lipomatózishoz kapcsolódó jelölt gén variánsait Sanger és a következő generációs szekvenálási (NGS) technikák alkalmazásával lehessen kimutatni.

anyagok és módszerek

betegek és etikai szempontok

ezt a kutatást a Helsinki Nyilatkozat elveinek megfelelően végezték. A jóváhagyást a vizsgálat előtt az intézményi felülvizsgálati testület (az FCM-UNICAMP kutatási Etikai Bizottsága, az 1.313.164. sz. fájl) nyújtotta be, és minden résztvevő írásos beleegyezését adta. A tanulmányt az orvosi genetikai szolgálat ambuláns klinikájában, a Campinas Egyetem Klinikai Kórházában (HC-UNICAMP), São Paulóban, Brazíliában végeztük. Összesen hét, öt független családhoz tartozó személy (A-tól E-ig) volt jogosult. Az alanyok kiválasztásának elsődleges befogadási kritériumai a következők voltak: i) 18 év feletti életkor, ii) a lipoma vagy angiolipoma klinikai és kórszövettani diagnózisa és iii) az autoszomális domináns öröklődésre utaló családi kiújulás. A fő klinikai szempontokat strukturált formában gyűjtötték össze az orvosi nyilvántartásokból. A fizikai értékelés magában foglalta mind a bőrgyógyász, mind a genetikus specialitások részvételét. A HC-UNICAMP patológiai Osztálya biztosította a kórszövettani mintákat. A klinikai eredményeket az 1. táblázat részletezi.

1. Táblázat Klinikai Összefoglaló a Betegek FML

Sanger Szekvenálás a HMGA2 Gén

Genomiális DNS-t kivonták a perifériás EDTA vérmintákat a hét betegek szerint a hagyományos fenol-kloroform eljárás által használt Sambrook et al21

A polimeráz láncreakció (PCR) került sor, hogy felerősítse öt kódolás exons, valamint intron-exonban csomópontok régiók a HMGA2 gene. Két online bioinformatikai eszköz, a Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) és az OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) segítségével megterveztük a primerek meghatározott párját, a 2.táblázatban foglaltak szerint.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) a gyártó utasításait követve. A kromatogramokat V. 2.6.5-ös Chromákkal vizsgáltuk. Az eredményeket összehasonlították a HMGA2 Ensembl átirat száma ENST0000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Az új változatokat három nyilvános adatkészletben ellenőriztük: i) a genomika és egészség globális Szövetsége (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) az Exome aggregációs konzorcium (http://exac.broadinstitute.org/) és iii) A Brazil mutációk online archívuma (http://abraom.ib.usp.br/). Hogy értékelje a patogenitási pontszámok, illetve károsodás hatása a regény változatai a jelölt HMGA2 gén, régen más silico előrejelző modellek, mint a VEP (Változat Hatása Predictor),22 FATHMM (Funkcionális Elemzés Keresztül Rejtett Markov Modellek),23 UMD-predictor,24 SZITÁL (Válogatás Intoleráns a Toleráns),25 PROVEAN (Fehérje Változás Hatása Analyzer),26 Mutáció Kóstoló.27

cél Multi-Gene Panel

egyéni panelt végeztünk a szindrómás lipomatózisban részt vevő gének értékelésére. Ennek a technikának a végrehajtásához öt beteg nyálmintájából (a, B, C, D és E) nyertünk genomikus DNS-t az Oragene® DNS öngyűjtő készlet (DNS Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Kanada). A mintákat ezután célspecifikus szekvenciákkal dúsították és hibridizálták. A rögzítés a következő generációs Illumina® MiSeq (TruSeq Capture) szekvencerrel történt 150bp párosított végű módban, a platform szabványos protokolljának megfelelően. A célrégiók lefedettségének mélysége 50x-nél nagyobb volt. 2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2, és PTEN NM_000314.4), 10bp intronikus szekvenciák és más, feltehetően betegséget okozó régiók. A vizsgálat során az Exonic deleitions, duplications és splice-site variációkat is figyelembe vették. Az olvasást összehangolták és összehasonlították a humán genom referenciával (GRCh37). Multiplex Ligációfüggő szonda amplifikáció (MLPA) választották érvényesíteni változatok által említett Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

az adatok rendelkezésre állása

szekvenciákat nyújtottak be a Genbanknak (csatlakozási szám: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Az ehhez a cikkhez kapcsolódó adathalmazok az Európai bioinformatikai Intézetben, az EMBL-EBI-n keresztül érhetők el az ENA adattáron keresztül, prjeb28960 tanulmányi csatlakozási számmal (https://www.ebi.ac.uk/ena).

eredmények

klinikai analízis

öt független családból (a, B1, B2, C, D1, D2 és E) hét személy vett részt az 1.ábrán látható módon. Nem azonosítottuk a résztvevők közötti szülői egyetértést. Az etnikai származást az egyes probandok vegyesen jelentették. Az Általános áttekintésben megfigyelték, hogy az A és B családokban három egymást követő vagy több generáció vesz részt. A férfiak és nők nemi arányát 1:6-ra becsülték. Átlagos életkor a befogadás 42 év (SD 11.8), míg az átlagos életkor az elváltozások kialakulását 28 év (SD 11.8). A nőstények terhességük után a csomók csúcs előfordulási gyakoriságáról számoltak be. Klasszikus klinikai jellemzői FML tartalmazza puha csomók nagyon változó a szám, méret, elhelyezkedés a bőr alatti zsír pedig csak a csomagtartóban, illetve végtagok, mint látható a 2. Ábra. A, C és D2 betegeken csak egyéni A. komorbid emésztőrendszeri rendellenességek esetén észleltek kellemetlen érzést és tapintásos érzékenységet. Beszámoltak diverticulitisről és polipokról, súlyos krónikus székrekedésről,illetve colorectalis rákról. Négy betegnél a bőr alatti elváltozások szövettani értékelése történt. Az érett adipociták jelenléte, amelyeket számos kapilláris kerekített, megerősítette az angiolipoma diagnosztikát,amint azt Bancroft and Fletcher et al10, 28 (2.ábra). Az egyéb lényeges megállapításokat az 1. táblázat ismerteti.

1.ábra a vizsgált családok törzskönyveinek áttekintése (A–E). Figyeljük meg, hogy a nőstények és a hímek egyaránt részt vesznek, és az autoszomális domináns öröklési minta majdnem két egymást követő generáció érintett. Az a család volt a legtöbb generáció, amely több lipomát (a) fejlesztett ki. A proband A (III 2) volt az egyetlen a családi csoportjában, és az a) pontban említett fájdalom eseteiben. A nyilak jelzik a szondákat.

molekuláris

Sanger szekvenálás a HMGA2 gén exon 5-ben két új variánst tárt fel. Mindkét variánst az A és B1 betegben azonosították. Az első egy szinonim heterozigóta változat volt, c.327c>T p. (Asp=) alacsony ütközésnek vagy semlegesnek tekinthető, több előrejelző eszköz (VEP, FATHMM, UMD-prediktor, szitál, PROVEAN) alapján. Ezzel szemben a második módosítás egy nonszensz változás volt, a C.328t>C (p.*110glnext*16), amely a glutamin aminosav stop kodon szubsztitúcióját és a végfehérje későbbi kiterjesztését okozza (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). A 3. ábra vázolja a HMGA2 gén szerkezetét, a proteinkötő doméneket és az új variánsokat.

az emberi HMGA2 gén 3.ábra szerinti szerkezete. A) A 12Q14.3-on található HMGA2 gén több mint 140 kb-ra terjed ki, és öt exont tartalmaz. Exon 1, 2 és 3 (Kék dobozok) kódolni egy At-hook domain (kék körök). A negyedik exon (lila) kódolja a távtartó régiót. Az Exon 5 (rózsaszín doboz)kódolja a 109 aminosav fehérje C-terminális tartományát. B) az A, B1 és Referencia betegek Elektroferogramja. Ezeknél a betegeknél két azonos új változatot találtak. Egy szinonim heterozigóta változat c. 327c>T (P. Asp=) és egy No-stop változás heterozigóta variáns C.328t>C (p.*110glnext*16).

A C.328t>C (p.*110glnext*16) variáns 100% – os patogén vagy nagy hatású volt a silico algoritmusokban említettek szerint. A mutációs kóstoló előrejelző rendszer azonban eltérést mutatott a leírt két változat között, amint azt a 3.táblázat mutatja. Az AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA és PTEN célzott multi-gén panelje az A, B, C, D és E családokban nem észlelt káros változásokat az értékelt szekvenciákban.

3. Táblázat Változatok Talált Egyének, illetve B1 -, illetve Összehasonlító Között Előrejelző Eszközök

a Vita

A jelenlegi tanulmány meghatározott azonosítani a molekuláris alapjai FML keresztül az integráció a modern szekvenálás technikák, mint a Sanger szekvenálás, valamint NGS kombinálva a hagyományos klinikai megközelítések.

korábbi vizsgálatok után a jelenlegi kutatás néhány eltérést mutat az epidemiológiai adatokkal kapcsolatban. Megfigyeltük, hogy van egy közös tévhit a besorolás, diagnózis, a különböző típusú lipomatosis.7,10,15 több szerző hangsúlyozza, hogy a férfiak nagy hajlandóságot mutatnak többszörös lipomák bemutatására,11,29, 30 azonban eredményeink az FML látszólagos magas gyakoriságát mutatják nőknél. Lehetséges, hogy ez a megállapítás pusztán a kis mintaméret miatti kiválasztási torzítást tükrözi, vagy azzal is magyarázható, hogy a nők kozmetikai aggályok miatt nagyobb valószínűséggel keresnek egészségügyi orvosi ellátást.31 Mindazonáltal a törzskönyvek azt mutatják, hogy a mindkét nemben érintett egyének aránya hasonló volt, ami 1:1 (10 férfiak vs 13 nők) közeli nemi arányhoz vezetett, ami alábecsülheti az FML valódi prevalenciáját.6,8,16 érdekes módon a nőknél megfigyelt lipomák száma magasabb volt, mint a vizsgált egyedülálló férfi.1,14

olyan tényezők, mint a túlsúly és a csomók fokozott növekedése a terhesség alatt és után, arra utalnak, hogy az adipocita hiperpláziában exogén tényezők (étrend), metabolikus változások (diszlipidémia vagy a zsírsav deszaturáció megváltozása) és hormonális mechanizmusok is szerepet játszhatnak.32,33 Yee et al szemben különbségek enzimatikus halványság a stearoyl-CoA az egyének között a ritka zsírszövet betegségek (RAD), illetve elhízott kontroll csoport arra a következtetésre jutott, hogy az egyének FML, valamint az elhízás mutatta a legmagasabb árak a halványság, így növelve a lipogenesis folyamat.32,34

az egyik váratlan megállapítás az volt, hogy az A beteg volt az egyetlen a casuistic és családja csoportjában, amely fájdalmat, napi gyengeséget, fáradtságot és pszichiátriai komorbiditást (krónikus depresszió és szorongásos zavar) mutatott ki. Ezek a tünetek erősen kapcsolódnak a Dercum-betegséghez, amelyet differenciáldiagnózisnak vagy az FML változatának tekintünk.35 a Hansson et al által javasolt új Dercum-Kórbesorolás alapján 36 ebben a betegben azonosítottuk a generalizált noduláris formát, amelyet a zsírszövet felületén, valamint a lipomák körül intenzív fájdalom jellemez. Egy másik tanulmány, amely támogatja ezt a hipotézist megjelent Campen et al37 leírtak egy család kilenc tag diagnosztizált több lipomák, akik megjelenített változó tünetek között mozgott teljes fogyatékosság tünetmentes csomók. Ezért feltételezhető, hogy a szegregáció egy autoszomális domináns mintát követ, változó expresszivitással, és valószínűleg az FML szélsőséges megnyilvánulását képviseli.

a kórszövettani diagnózis tekintetében két fő típust bizonyítottunk: a lipomát és az angiolipómát. Mikroszkóposan az angiolipoma leggyakoribb észrevehető jellemzője a finom erek proliferációja, amelyek fibrin mikrotrombit tartalmaznak Érett adipocitákkal együtt.Úgy tűnik, hogy 10,28 angiolipoma előfordulása magas fiatal felnőtt férfiaknál, akik alkalmanként enyhe fájdalmat vagy érzékenységet mutatnak. Ez a fajta daganat a helyi trauma történetéhez vagy a szteroid terápia alkalmazásához is kapcsolódik.13,38 bár sok szerző mindkét diagnózist különböző kóros entitásként ismeri fel, egyes esettanulmányok nem teszik ezt a különbséget a köztük lévő nagyon finom különbségek miatt.39 ebben az összefüggésben elemzésünk megerősíti, hogy lehetséges a familiáris kiújulással járó angiolipómák kialakulása, és ez a diagnózis az FML széles spektrumának része lehet.40-43 ezenkívül több orsó sejtes lipomákat, egy másik típusú lipomát is jelentettek több családban.44

bár számos tanulmány foglalkozik a szórványos lipomák expressziójával és közvetlen citogenetikai elemzésével, kevés tanulmány foglalkozott az FML alkotmányos okaival.2 kiterjedt lipoma sorozat felnőtteknél erősítse meg a többszörös szerkezeti átrendeződéseket 50-75% – os gyakorisággal.10,28,45 a kiegyensúlyozott kromoszómális változások közül a T(3; 12) transzlokációt(q27-28; q13-15) a daganatok Közel 25% – ában figyelték meg.9 a legtöbb esetben a töréspont befolyásolja a HMGA2 gént, amely 5 exonból áll, és 109 aminosavból álló fehérjét termel (3.ábra).18,46,47 Ligon et al számolt be az eset egy nyolc éves fiú alkotmányos átrendeződés érintő sáv 12q14.3 (de novo pericentrikus inverzió) így bevonásával HMGA2 gén. A szomatikus túlnövekedéssel, a csont-és fogkor előrehaladásával, a cerebelláris tumorral és a többszörös lipomákkal jellemzett klinikai fenotípus azonban eltér a casuisticától.

elemeztük a heterozigóta variánsokat c.327c>T p.(Asp=) és C.328T>C (P.*110glnext*16) a HMGA2 gén exon 5-je különböző előrejelzési programokban. A szinonim vagy csendes változást jóindulatúnak értelmezték, míg a fordítási stop kodon változását 100% – ban patogén vagy nagy hatásnak tekintették. Ily módon azt jelezheti, hogy a 3ʹ UTR (le nem fordított) régiót érintő változások kiváltják a HMGA2 gén neoplasztikus átalakulását.49 Fusco et al kiemelte a hmga2 gén döntő szerepét a mezenchymális daganatokban. Azt javasolták, hogy a HMGA2 gén, a 3ʹ UTR régióban általában hallgattatni által Hagyja-7 miRNA, valamint bármely változtatást ezen a szinten, vagy csonkolása vagy a fúziós a méhen kívüli sorozatok, vezet a fel-rendelet, következésképpen egy abnormális replikációs a sejtek.46

kissé meglepő, hogy a B családban mindkét új változatot csak az anyában (B1) észleltük. Ez azt jelezheti,hogy nem elkülönülnek az FML fenotípussal, legalábbis ebben a családban etiológiai okként. Másrészt az a beteg ugyanazt a két új változatot mutatta be, de fenotípust mutatott, amely erősen utal a Dercum-betegségre. Ezeknek az ígéretes eredményeknek ellenére kissé nehéz értelmezni őket, mert nem lehetett értékelni az FML-vel érintett többi rokonot.

fokális zsíros infiltráció és több lipoma is jelen lehet több szindrómában. A Proteus-szindróma és a szegfűszeg (veleszületett lipomatózus aszimmetrikus túlnövekedés, érrendszeri rendellenességek, epidermális nevi, csontváz-és gerinc anomáliák) a szomatikus mutációk példái, ahol lipomatózis van jelen.50,51 másrészt a Bannayan-Riley-Rubacalva-szindróma, az 1-es típusú többszörös endokrin Neoplasia, a Cowden-szindróma és a Gardner-szindróma olyan állapotok, amelyek egyidejűleg lipomatosisban szenvedő germline mutációkból származnak.52-55 még a mitokondriális funkciót érintő mutációk is összefüggenek a kóros zsírszövet-növekedéssel, főleg a felső törzsben és a nyakban, és a legjobb példa erre a Madelung-betegség.56 Az AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA és PTEN negatív panelje azonban kizárja, hogy ők felelősek az FML fenotípusáért, legalábbis ebben a kutatásban.

következtetés

az FML ritka és heterogén betegség, amely átfedésben lehet más bőrgyógyászati szindrómákkal, például a Dercum-kórral. Az FML természetes története ebben a sorozatban kimutatta, hogy a léziók kialakulása progresszív volt, és elérte a legmagasabb előfordulási gyakoriságát a középkorú egyéneknél. Az FML mindkét nemre hatással volt, és topográfiai eloszlást mutatott, amely túlnyomórészt a végtagokban és a törzsben volt jelen. Az értékelt betegek nemi aránya női prevalenciát mutatott, de a törzskönyvi adatok kiegyensúlyozottabb eloszlást mutattak. A Dercum-betegség diagnózisát egy személyben (a beteg) is felismerték.

a molekuláris megközelítés alaposabb betekintést nyújtott az FML genetikai alapjaiba, és megpróbálta alaposan megvizsgálni a hozzá kapcsolódó legtöbb jelöltgént. Kiemeltük az NGS hasznosságát a Sanger módszer mellett az FML teljes spektrumának megértésében, mivel ez alternatívát kínálhat a ritka genetikai állapotok etiológiájának azonosítására és jellemzésére a klinikai környezetben. A HMGA2 gén exon 5 variánsait nem írták le, és eddig bizonytalan jelentőségük volt az FML kialakulásában. További vizsgálatokat kell végezni, beleértve az érintett személyek jelentősebb számát, valamint a HGMA2 gén új változatainak funkcionális elemzését, annak biológiai funkciójának jobb meghatározása érdekében az FML-ben.