experimentell design och provsamling

experimentet inrättades 1982 i Mengcheng county, Anhui-provinsen, Kina (33 kg 13′ N, 116 kg 35′ E, 42 m höjd) med typisk kalkkoncretion svart jord. Årstemperaturen är 14,8 C och den årliga nederbörden är 872 mm. Fem befruktningsbehandlingar med vete-sojabönor växtrotation jämfördes i en helt randomiserad blockdesign med fyra replikat (varje tomt är 70 m2) : (1) kontroll, icke-befruktning; (2) NPK, NPK kemiska gödningsmedel innefattande urea (180 kg n ha−1 år−1), superfosfat (90 kg P2O5 ha−1 år−1) och kaliumklorid (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK kemiska gödningsmedel plus 7500 kg vete halm ha−1 år−1; (4) NPK + PM, NPK kemiska gödningsmedel plus 15 000 kg färsk grisgödsel ha−1 år−1; (5) NPK + CM, NPK kemiska gödningsmedel plus 30 000 kg färsk kogödsel ha−1 år−1. I NPK + WS-behandlingen återfördes allt vetehalm till fältet, grisgödseln i NPK + PM-behandlingen och kogödseln i NPK + CM hade samma mängd organiskt kol med det tillsatta vetehalmen. Dessutom har dessa kontrasterande typer av gödselmedel som ingår i våra befruktningsbehandlingar olika nivåer av tillgänglighet för växter och mikrober, t.ex. från mer labil (grisgödsel) till mer motstridiga (vetehalm och kogödsel). Vi använde ett brett utbud av befruktningsbehandlingar som syftar till att göra våra resultat representativa och tillämpliga på kontrasterande hanteringsmetoder.

vi grävde runt vetegruppen (innehållande 30 till 40 veteväxter under vetefyllningssteget den 20 April 2017) för att hålla rotsystemet så intakt som möjligt. Rhizosfärjorden som var tätt vidhäftad vid rötterna borstades sedan. Samtidigt samlades matjorden (0-15 cm djup) som bulkjord med hjälp av en skruvkorare (cirka 20 cm från växterna). Den uppsamlade jorden siktades genom ett 2 mm nät för att avlägsna föroreningar som rötter och stenar. En del av jorden lagrades vid 4 c c för kemiska analyser, och resten lagrades vid − 40 c c för DNA-extraktion.

Jordfysikokemisk analys

en pH-mätare (FE20 Fiveeasy Kubi, Mettler Toledo, Tyskland) användes för att mäta jordens pH vid ett förhållande mellan jord och destillerat vatten på 1:5 (vikt/volym). Markfuktigheten bestämdes gravimetriskt genom att torka 5 g färsk jord vid ungefär 105-108 c c för att nå en konstant vikt och sedan beräkna viktförhållandet (förångat vatten till torkad jord). Jordens totala kolinnehåll (TC) och totala kväveinnehåll (TN) bestämdes genom förbränning av lufttorkad jord med hjälp av en CNS-2000-analysator (LECO, St.Joseph, MI, USA), efter siktning av jorden genom ett 0,15 mm nät. Jordens totala fosfor (TP) och totala kalium (TK) innehåll extraherades efter HF-HClO4-digestion och mättes med molybdenblå metod och flamspektrofotometrimetod (FP640, INASA, Kina). Upplöst organiskt kol (DOC) extraherades genom tillsats av 50 mL destillerat vatten till 5 g färsk jord, skakning i 1 h och vakuumfiltrering genom ett G4-glasfiberfilter med ett porutrymme på 1,2 CGM (Fisher), och sedan bestämdes kolinnehållet i extrakten av en total organisk kolanalysator (multi N/C 3000, Analytik Jena, Tyskland). Nitrat (NO3–N), ammonium (NH4+-N) och upplöst totalt kväve (DTN) extraherades i ett förhållande av 5 g färsk jord till 50 mL 2 m KCl. Efter shacking i 1 h filtrerades extrakten genom ett G4-glasfiberfilter med ett porutrymme på 1,2 kvm (Fisher), och sedan användes ett kontinuerligt flödesanalytiskt system (San++-system, Skalar, Holland) för att analysera innehållet i NO3–n, NH4+ – n och DTN. Löst organiskt kväve (DON) beräknades med följande formel: DON = DTN − NH4+-n − NO3–N. den tillgängliga fosforen (AP) i jorden extraherades med 0.5 M NaHCO3 och bestäms genom användning av molybden blå metod. Tillgängligt kalium (ak) extraherades med 1 M ammoniumacetat och bestämdes med flamfotometer (FP640, Inasa, Kina) (ytterligare fil 3: bilaga 1).

bestämning av kvävefixeringshastigheter

15n2-märkningsmetoden är en av de vanligaste och mest använda metoderna för mätning av n-fixeringshastigheter . Fem gram jord placerades i 18 150 mm balchrör, och huvudutrymmet ersattes med syntetisk luft innehållande 80% 15n2 och 20% O2. Kontrollerna fylldes med omärkt N2-gas och bearbetades parallellt. Rören inkuberades horisontellt i mörkret vid rumstemperatur i 22 dagar. Atomen % 15N av jordprover bestämdes med användning av en stabil isotopförhållande masspektrometer (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Tyskland). Sedan beräknade vi nettopotentialen n fixeringshastighet genom att jämföra skillnaden mellan totalt 15N i jordar som fick 15n2 i förhållande till kontrollen.

sekvensering med hög genomströmning och bioinformatikanalys

för DNA-extraktionen, 0.5 g färsk jord användes med Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). NifH-generna förstärktes med användning av primerpar nifH-F / nifH-R (5 ’-AAAGGYGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’) . PCR-reaktioner utfördes i ett 20 µL reaktion som innehåller 4 µL av 5 × FastPfu buffert, 2 µL 2,5 mM dntp, 0.8 µL av 5 µM fram primer, 0.8 µL av 5 µM omvänd primer, 0.4 µL av fastPfu-Polymeras, 10 ng av mall-DNA, och dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Amplifiering utfördes vid 95 kg C i 3 minuter, med 35 cykler av 95 kg C i 30 sekunder, 55 kg C i 30 sekunder och 72 kg C i 45 sekunder och förlängning vid 72 kg C i 10 minuter. PCR-amplikoner renades med Agarose gel DNA purification kit (TaKaRa Bio), och tredubbla PCR-amplifieringar för varje prov utfördes och poolades som en PCR-produkt och sekvenserades sedan på plattformen av Illumina MiSeq PE300 (Majorbio Company i Shanghai, Kina). Efter sekvensering analyserades nifh-nukleotidsekvenserna med användning av QIIME-1.9.1-rörledningen (http://qiime.sourceforge.net/) . För det första avlägsnades sekvenserna av låg kvalitet (de med ett kvalitetsresultat < 20, innehållande tvetydiga nukleotider eller inte matchande primer och streckkod) och de återstående sekvenserna omvandlades vidare till aminosyrasekvenser med användning av Fungenrörledningen i Ribosomal databasprojekt . Sekvenserna som kodade proteiner som inte matchade nifh-proteinsekvensen eller som innehöll termineringskodoner kastades. De återstående sekvenserna var inriktade mot nifh-gendatabasen och tog bort både de misslyckade och chimära sekvenserna. De återstående högkvalitativa sekvenserna grupperades i operativa taxonomiska enheter (OTUs) vid 95% likhet med UCLUST som körs i de novo-läge, och alla singleton OTUs raderades.

Co-förekomst nätverksanalys

Vi konstruerade en co-förekomst nätverk med alla prover (rhizosphere och bulk jord) och identifierade de viktigaste ekologiska kluster av starkt associerade OTUs. De bästa otu: erna, som står för mer än 80% av det relativa överflödet i det totala samhället, valdes . Alla parviserade Spearman-korrelationer mellan OTUs beräknades och korrelationerna med en Spearmans koefficient på mindre än 0,65 och ett P-värde på mer än 0,01 avlägsnades. Detta gjorde det möjligt för oss att bara fokusera på OTUs som starkt samverkade och var mer benägna att interagera med varandra. Huvudmodulerna (ekologiska kluster) i nätverket visualiserades med Gephi (https://gephi.org/). Det relativa överflödet av varje ekologiskt kluster beräknades genom att medelvärdet av de standardiserade relativa överflöd (z-poäng) av de arter som tillhörde den (ytterligare fil 3: Bilaga 3).

statistisk analys

ANOVA och parvis t-test användes för att jämföra jordvariablerna, dominerande mikrobiella taxa och den mikrobiella alfa-mångfalden mellan olika befruktningsbehandlingar (ytterligare fil 3: bilaga 1). Dessa tester genomfördes med användning av SPSS 21. Manteltest användes för att analysera korrelationerna mellan den diazotrofa gemenskapen och fysikalisk-kemiska egenskaper (ytterligare fil 3: bilaga 2). Detta utfördes med hjälp av ”vegan” – paketet i rmic 32 (3.2.2). En principiell koordinatanalys (PCoA) användes för att hitta signifikanta skillnader i diazotrofa samhällen mellan provtagningsgrupper (ytterligare fil 3: bilaga 2). PCoA utfördes med hjälp av” labdsv” – paketet r kubi 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

fylogenetiska analyser

nifh-genen ger tillräcklig fylogenetisk upplösning i ekologiska studier. Det fylogenetiska trädet för de 481 dominerande diazotrofa fylotyperna i de ekologiska klustren byggdes med FastTree och visualiserades med GraPhlAn . Fylogenetisk provtagningsteori kan analytiskt användas (förutsatt att slumpmässig provtagning från det fylogenetiska trädet som den förutspådda fylogenetiska mångfalden i ett lokalsamhälle och sedan jämföra den observerade fylogenetiska mångfalden med dessa förutsägelser) för att bestämma i vilken grad diazotrofisk gemenskap verkar slumpmässig (mellan − 2 och + 2), överdispergerad (över + 2) eller grupperad (under-2). Fylogenetisk provtagningsteori utfördes med användning av r-paketet” picante”. En fördel med slumpmässigt provtagning det regionala fylogenetiska trädet är att det kan användas för att jämföra prover av ojämna storlekar baserat på binomialprovtagningsmodellen . Skillnaderna mellan observerad och förväntad fylogenetisk mångfald bestämdes genom att beräkna och jämföra z-poäng för varje ekologiskt kluster. När den observerade fylogenetiska mångfalden är mindre än den förväntade mångfalden (under − 2) anses den mikrobiella gemenskapen i det ekologiska klustret vara fylogenetiskt grupperad, vilket innebär att närbesläktade taxa är mer benägna att samplas och aktivt väljas av miljön .

strukturell ekvationsmodelleringsanalys

SEM utfördes med IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Det användes för att utvärdera de direkta och indirekta effekterna av jordens fysikalisk-kemiska egenskaper och det relativa överflödet av de viktigaste ekologiska klustren på N-fixeringshastigheterna. Jordens fysiokemiska egenskaper inkluderade jordens pH, totalt kol, totalt kväve och totalt fosfor. I modellen var behandlingarna (kontroll, NPK, NPK + WS, NPK + PM och NPK + CM) kategoriska variabler med två nivåer: 1 (en viss behandling) och 0 (återstående betraktade behandlingar). Dessutom användes bootstrapping för att testa sannolikheten för att vägkoefficienter skilde sig från noll, eftersom några av variablerna normalt inte fördelades. Vi beräknade också de standardiserade totala effekterna (STEs) av markegenskaperna, befruktningsbehandlingarna och rhizosphere-effekten på N-fixeringshastigheten för att underlätta tolkningen av SEM.

Random Forest modeling analysis

Random Forest regression (r-paketet” randomForest”) användes för att regressera den normaliserade OTUs i olika behandlingar. Den 10-faldiga korsvalideringsmetoden användes för att bestämma den optimala uppsättningen OTUs korrelerade med n-fixeringshastigheterna . Rankade listor över OTUs i ordning med slumpmässiga skogar rapporterade funktions betydelse poäng uppnåddes baserat på ökningen i medelkvadratfel av kvävefixeringshastigheter förutsagda över 100 iterationer av algoritmen. De 50 markörernas otu: er valdes baserat på minsta genomsnittliga korsvalideringsmedelkvadratfel, som erhölls från fem försök med 10-faldig korsvalidering.