experimentellt design-och studiesystem

under 2012 erhölls 300 frön av snabbcykling Brassica rapa-växter (Wisconsin Fast Plants Standard Seed, med hög genetisk variation) från Carolina biologiska förnödenheter och odlades i en fytotron under standardiserade Mark -, ljus-och vattningsförhållanden. Dessa växter är helt outcrossing (själv oförenliga) och hamnen tillräckligt stående genetisk variation att lätt svara på selection58,59. Från dessa 300 växter genererades 108 fulla sibfröfamiljer av konstgjorda korsningar (endast fröfamiljer från kors där båda föräldrarna producerade frukter användes). Dessa 108 fullständiga sib-fröfamiljer användes som startpopulation för experimentet.

för den första generationen av experimentet etablerades tre behandlingsgrupper med hjälp av de 108 familjerna så att varje familj representerades i varje behandling för att kontrollera för genotyp bland behandlingar (kompletterande Fig. 1). Varje behandling bestod därför av 108 växter (som representerar 108 fröfamiljer), som vi delade in i tre replikat (A,B,C) som var och en innehöll 36 växter. Replikaten inom behandlingarna hölls som isolerade linjer under 9 generationer (inga kors mellan replikaten gjordes) för att kunna bedöma oberoende, repeterbara evolutionära förändringar. Växterna av alla replikat i alla behandlingar odlades i fytotronen under standardiserad jord (Einheitserde classic), ljus (24 h ljus) och vattningsförhållanden. Alla växter fenotypades varannan generation som började med generation 1. Blommiga doftdata från generationer 1 och 3 förlorades på grund av tekniska problem; istället samlades doft från generation 4. Blommiga doftdata från generation 1 erhölls efter experimentets slut genom att odla växter från startgenerationen och samla doft från en växt från var och en av de 108 fröfamiljerna. Således samplades från den första generationen totalt 108 växter (36 Från varje replikat) för blommig doft samtidigt som växter av generation 9.

experimentell evolution och pollinering behandlingar

i vår studie använde vi tre pollinator behandlingar: humlor (’BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Schweiz), hoverflies (’HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Tyskland), och hand pollinering. Båda insekterna besöker lätt blommor av många Brassicaceae-arter i naturen, men representerar olika funktionella pollinatorkategorier och har visat sig variera i överflöd i naturliga livsmiljöer46. Användningen av enstaka pollinatorarter efterliknar pollinatormiljöer där de vanligaste pollinatorerna är funktionellt olika. Vid kontrollbehandlingen korsbestämdes slumpmässigt utvalda växter för hand.

pollinering utfördes 23 dagar efter sådd i en flygbur (2,5 m 1,8 m 1,2 m) i växthuset under standardiserade ljusförhållanden med humlor och svävar. Experiment utfördes mellan 0900 timmar och 1500 timmar. Humlor hölls i en separat flygbur i växthuset. Hoverflies köptes som puppor och uppföddes tills kläckning varefter manliga och kvinnliga flugor separerades. Pollinatorer fick foder på snabb cykling B. rapa-växter (växter från kontrollgruppen för respektive generation) och matades med ytterligare pollen fram till 3 dagar före pollineringsbehandlingen; efteråt tillhandahölls endast pollen och sockerlösning; 16 h. före pollinering svältades pollinatorer.

för pollinering placerades alla växter av en replikat slumpmässigt i en kvadrat av 6 ml 6 växter med ett avstånd av 20 cm från varandra i flygburet. Fem pollinatorer tillsattes individuellt och sekventiellt och varje insekt fick besöka högst tre olika växter och avlägsnades sedan från buren; varje insekt användes endast en gång. Totalt fick 12-15 växter per replikat ett eller flera besök av pollinatorer. Det totala genomsnittliga (s.d.) antalet besök (i besökta växter) var 1,35 0,63 0,63 för humlebestämda växter och 1,28 0,53 0,53 för svävande pollinerade växter. För de växter som besöktes registrerades antalet besök och antal besökta blommor. I kontrollgruppen valdes 12 växter slumpmässigt per replikat och 5 blommor av varje växt pollinerades av en slumpmässigt vald faderväxt; fäder valdes bland samma 12 växter. Varje växt kan vara pollengivare till mer än en växt men fick bara pollen från en växt. Efter pollinering märktes besökta blommor och växter hölls i en bur i ytterligare 30 dagar tills frukterna samlades in. Frön räknades och relativ fröuppsättning beräknades för varje växt genom att dividera det enskilda fröuppsättningen med medelfröuppsättningen i replikatet. Dessutom beräknades antalet frön per frukt för varje besökt växt. För varje växt beräknades manlig kondition som förutsagt faderskap (antal pollenexporthändelser).

från alla frön som produceras av de pollinerade blommorna användes en delmängd frön som representerar fröproduktionen för varje individ för att odla nästa generation. Ju fler frön en växt producerade desto fler frön bidrog den till nästa generation, som återigen bestod av 36 växter för varje replikat. Fröbidraget för varje besökt växt till nästa generation beräknades för varje replikat som: 36/(replikera summan av frön / individuell fröuppsättning). Värden under 0,5 avrundades upp till 1.

inavelsdepression

inavelsdepression under hela experimentet kvantifierades genom mätning av frövikt och groddhastighet, den senare i procent av frön grodda per replikat. För att kontrollera för drag-ändringar på grund av inavel depression, frön som produceras av växter i 9: e generationen har vuxit (som representerar den 10: e generationen) och manuellt korsade mellan replikat inom behandlingar, så som växter av varje replikera var pollen givare och pollen mottagare för växter av två olika replikat (♀En-♂C, ♀B-♂En, ♀C-♂B). Korsningar inom dessa kombinationer av replikat var slumpmässiga. Av de resulterande fröna (den elfte generationen) odlades en individ per fröfamilj (36 växter per replikat) under samma förhållanden som under experimentet. Av dessa inter-replikerade korsningar mättes egenskaper igen och användes för den slutliga jämförelsen av egenskaper mellan behandlingsgrupper.

växtegenskaper

de flesta egenskaper, inklusive blommig doft mättes före pollinering, 19-21 dagar efter sådd. Kronbladets bredd, längd,pistillängd och Blomdiameter på tre slumpmässigt valda blommor per växt mättes med en elektronisk bromsok (Digital bromsok 0-150 mm, TOOLCRAFT). Nektar från tre blommor uppsamlades med 1 UCL mikrokapillärrör (Blaubrand, Wertheim, Tyskland) och volymen bestämdes genom att mäta längden på nektarkolonnen i mikropipetten med en tjocklek. För kvantifieringen användes medelvärdet av tre blommor. För 157 växter jämnt fördelade över behandlingarna bestämdes sockerhalten i nektar med hjälp av derivatisering och gaskromatografisk analys. För att göra det överfördes nektar till filterpapper lagrat i silikagel. Sektorn på filterpapperet innehållande nektar skars från resten av filterpapperet och nektar eluerades i 1 ml Mili-Q-vatten med hög renhet genom att skaka utspädningen i 90 minuter med 400 r.p.m. vid 60 kg C på en laboratorieskakare. Därefter torkades 50 CGR av lösningen vid 60 CGR och derivatiserades med 100 CGR av en blandning av vattenfri pyridin (Fisher Scientific, Geel, belgien), hexametylsilazan (Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) och trimetylklorosilan (Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) (10:5:3). Därefter kördes prover av GC-MS som beskrivs i ref. 32. Vi beräknade totala sockermängder per blomma och blomställning som summan av alla olika sockerarter (fruktos, glukos, sackaros och sorbitol). Korrelationen mellan nektarsockerhalten och nektarvolymen var positiv och hög (r156=0,732, P<0,001), så för de återstående växterna bestämdes endast nektarvolymen. Blommig doftkollektion gjordes före bioassays på ett oförstörande sätt från alla växtblomställningar så snart minst fem blommor var öppna. Vi använde headspace sorption med ett push-pull-system59, 60. Blomställningarna av växterna var inneslutna i glascylindrar som tidigare var belagda med sigmacote (Sigma-Aldrich) och stängdes med en Teflonplatta. Antalet öppna blommor räknades för varje växt. Luft från omgivningen pressades med en flödeshastighet på 100 ml min−1 tråg aktivt kolfilter in i glascylindern. Samtidigt drogs luft från glascylindern med en flödeshastighet på 150 ml min−1 genom ett glasrör fyllt med 30 mg tenax ta (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Luft från tomma glascylindrar uppsamlades som luftkontroller. Blommiga flyktiga ämnen samlades i två timmar i en fytotron under standardiserade ljus-och temperaturförhållanden. Kvantifiering av flyktiga ämnen utfördes genom gaskromatografi med massselektiv detektion (GC–MSD). Prover injicerades i en GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) av en MultiPurpose Sampler (MPS; Gerstel, m Bicllheim, Tyskland) med användning av en Gerstel termisk desorptionsenhet (TDU; Gerstel) med ett kallt injektionssystem (CIS; Gerstel). För termodesorption upphettades TDU från 30 till 240 C C med en hastighet av 60 c c min−1 och hölls vid en slutlig temperatur i 1 min. CIS sattes till -150 C i C under fångsten av eluerande föreningar från TDU. För injektion upphettades CIS till 250 c c med en hastighet av 12 c c s−1, och den slutliga temperaturen hölls i 3 min. GC var utrustad med en HP-5−kolonn (0,25 mm diameter, 0,25 mm filmtjocklek, 15 m längd) och helium användes som bärgas vid en flödeshastighet av 2 ml min-1. Föreningsidentifiering och kvantifiering gjordes följande60 med Agilent MSD ChemStation-programmet. Kvantifiering av föreningar erhölls genom mätning av toppområden av utvalda måljoner specifika för de enskilda doftföreningarna. Specifika måljoner erhölls från syntetiska standarder för alla föreningar; toppområden omvandlades till absoluta mängder med hjälp av kalibreringskurvor som tidigare erhållits för varje förening med användning av syntetiska föreningar i tre olika koncentrationer. Endast doftföreningar som var närvarande i betydligt högre mängder än i luftkontrollen inkluderades i analysen (totalt 14 doftföreningar). Alla mängder flyktiga ämnen beräknades i pg per blomma L-1 samplad luft.

tjugotre dagar efter sådd, samma dag som pollinering gjordes, registrerades antalet öppna blommor och höjden på varje växt. Efter pollinering (men samma dag) registrerades färgreflektansspektra av tre kronblad från olika oförorenade (när det är möjligt) blommor per växt med en fiberoptisk spektrofotometer (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Nederländerna) och en Xenonpulserad ljuskälla (Avaljus-XE; avantes). Ett kronblad i taget placerades under spektrofotometern (specifikt med fokus på kronbladets distala del) och den procentuella reflektansen (i förhållande till en vit standard) mellan 200 och 900 nm var 0,6 nm registrerades i överföringsläge. Av det uppmätta spektrumet användes endast medelvärdet av reflektansvärdena var 10 nm från 260 till 650 nm från de tre kronbladen i analysen. I växter av elfte generationen analyserades en delmängd av ca 20 växter per replikat för färg, eftersom ingen av Färgdatorerna befanns vara under urval under hela experimentet. Området för den ultravioletta absorberande och reflekterande kronbladets yta mättes endast i växt av generation 11 med en ultraviolett känslig digitalkamera med kvartslins. Bilder av blommor togs och ultraviolett absorberande område kvantifierades med hjälp av mjukvarupaketet ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Pollinatorpreferensanalyser

analyser för pollinatorpreferenser utfördes för varje replikat med båda typerna av pollinatorer. För varje replikat utfördes två beteendeanalyser (en för varje pollinatorbehandling). Bumblebee – och hoverfly-pollinerade växter (generation 11) av varje replikat parades slumpmässigt och placerades sida vid sida (ca 30 cm avstånd) i en flygbur (2,5 m 1,8 m 1,2 m). En pollinator placerades i buret och fick besöka en växt. Pollinatorer fångades omedelbart efter att de gjorde sitt val. Varje växtpar analyserades med en pollinator.

Självkompatibilitet och autonom selfing

för att testa för självkompatibilitet växte vi växter från den första (15 växter per replikat) och den elfte generationen (30 växter per replikat). Ett frö per fröfamilj (från slumpmässigt utvalda familjer) odlades och två blommor per växt selfed vid anthesis. Det genomsnittliga antalet frön som produceras per selfed blomma för varje enskild växt användes som ett mått på självkompatibilitet.

för att testa för autonom selfing växte vi ca 12 växter (ett frö per familj) per replikat från varje behandling av generation 11 och 1 (totalt 162 växter). Efter 30 dagar när ca 20 blommor hade öppnats klipptes de återstående knopparna i varje växt noggrant och antalet öppnade blommor registrerades. Växten fick sedan utveckla frukter utan att några insekter fick tillgång till växterna. Efter mogning av frukterna samlades frön och antalet frön räknades och vägdes för varje växt. Antalet frukter per öppen blomma och frö per frukt användes som ett mått för autonom selfing. Eftersom några växter hade ett mycket stort antal frukter per öppna blommor, tog vi bort dessa avvikare för den slutliga jämförelsen av autonom selfing. Följande antal avvikande värden togs bort: 1 i generation 1; i G11: 2 i BB, 3 i HF, 2 I CO.

statistisk analys

för att analysera fenotypiskt urval beräknades urvalsdifferenser och gradienter genom att regressera växternas kondition på traits61. Denna analys gjordes separat för behandlingarna, men för alla replikat och generationer kombinerade. Som en fitnessuppskattning användes ’antal besök’, vilket var en räkningsvariabel och följde en Poisson-distribution. En annan fitnessvariabel, ’relativ fröuppsättning’ hade en distibution partisk av de många nollvärdena; dessutom missade fröuppsättningen den enda manliga fitnesskomponenten i den första växten som besöktes, vilket inte satte frö från detta besök (eftersom pollinatorer ursprungligen inte Bar Brassica pollen). Antalet besök var dock starkt korrelerat med relativ fröuppsättning (BB: r626=0,694, P<0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Generaliserade linjära modeller (med Poisson-distribution) användes för att beräkna selektionsgradienter (multivariat) och differentialer (univariat) för varje behandling med antal besök som beroende variabel och egenskaper som kovariater. Dessutom beräknades kvadratiska urvalsgradienter med alla egenskaper och den kvadrerade termen för varje egenskap tillagd till modellen, och därefter fördubblades gradienter 62. För att kontrollera skillnader i urvalet mellan humlor och svävarflugor utfördes en generaliserad linjär modell (med Poisson-distribution) med antal besök som beroende variabel, behandling som fast faktor, växtegenskaper som kovariater och interaktionsbehandlingen*växtegenskap. Före urvalsanalysen standardiserades alla variabler till mean=0 och S. d.=1 (Z-värden) på replikatnivå. En generaliserad linjär modell användes också för att jämföra besöksgrader mellan humla – och svävarfluga-pollinerade växter över alla generationer. Blommiga färgspektrofotometervärden reducerades genom huvudkomponentanalys (PC) med varimax-rotation. Endast datorer med en egenvärde över en användes i analysen.

evolutionära förändringar i växtegenskaper bedömdes i växter av den 11: e generationen med hjälp av multivariat linjär diskriminerande funktionsanalys och univariata allmänna linjära modeller (GLM). För GLM användes varje drag som den beroende variabeln, replikera som slumpmässig faktor och behandling som fast faktor med LSD post-hoc-test. För att diskriminera effekterna av naturligt urval från drift bedömde vi om dragskillnader var konsekventa bland replikat av en given pollineringsbehandling. I GLM-analysen indikerar en signifikant behandlingseffekt egenskapsskillnad mellan olika pollinatorgrupper över alla replikat och diskriminerar därmed pollinatorspecifik utveckling från drift. Drift skulle endast indikeras av evolutionära förändringar i vissa (slumpmässiga) replikat, vilket indikeras av en betydelse i faktorn ’replikera’ eller interaktion mellan ’replikera’ och ’behandling’. SJÄLVKOMPATIBILITET och autonom selfing bedömdes också av GLM, men värden för första generationens växter inkluderades i analysen. För analyser av flyktiga ämnen och nektarvolym transformerades data ln(1+x) för att närma sig normalfördelning. För GLM med färgvariablerna utfördes en PC-analys som beskrivits ovan men utan föregående standardisering av variablerna. PC-analysen utfördes för alla behandlingar, replikat och alla generationer tillsammans vilket resulterade i fyra datorer som förklarade 96,9% av den totala variansen. Frekvensen av nektarfria blommor analyserades separat för varje generation, genom att använda generaliserade linjära modeller med bimodal fördelning, med ’närvaro av nektar’ (ja/nej) som den beroende variabeln, och behandling och replikera som faktorer. Egenskaper i nektariferösa och nektarlösa blommor jämfördes för nionde och elfte generationen tillsammans, genom att använda allmänna linjära modeller med egenskapen som den beroende variabeln, och ’närvaro av nektar’ och behandling som fasta faktorer. De första val preferenser humlor och svävar analyserades genom binomial test (test-prop=0,5; alla replikerar poolade). Korrelationer mellan nektar och växtegenskaper beräknades för alla generationer kombinerade med Pearson produktmoment korrelationer med LN-transformerade värden. Statistik utfördes med IMB SPSS Statistik (Version 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

datatillgänglighet