introduktion

familjär multipel lipomatos (FML, omim% 151,900) är en sällsynt autosomal dominerande störning av hypodermis kännetecknas av utvecklingen av väl inkapslade subkutana knölar på extremiteterna och stammen.1 första rapporter om flera adipocytiska tumörer gjordes sedan 1846 av Sir Benjamin Brodie.2 senare resultat från Blaschko (1891) och Alsberg (1892) visade en familjär återfall av lesionerna och observerade en ökad förekomst bland män.1,3,4 under de följande åren publicerade många andra författare familjer med egenskaper som mycket tyder på FML,1,5,6 och slutligen 1970 klassificerade Das Gupta lipomatösa tumörer i tre kategorier: ensam eller sporadisk, FML och multipel symmetrisk lipomatos (MSL).7,8

ensamma lipom anses vara den vanligaste godartade neoplasmen av mjuka vävnader hos vuxna, men flera lipom förekommer hos 5% av individerna.9,10 den exakta förekomsten av FML är okänd, men den har uppskattats vara 0,002%.8,11,12 åldersuppkomsten av knölar är mellan 30 och 40 år och når maximal topp på 50-talet.6,8,13,14 det har allmänt hållits att denna störning uppvisar en preferens för män, men ett stort antal verk visar att båda könen påverkas lika.15-17 även om det anses vara en godartad sjukdom, kan kosmetiska problem förekomma hos vissa individer, vilket försämrar deras livskvalitet. Dessutom är det också vanligt hos överviktiga individer.9

hittills har tillgänglig forskning i FML uttryckligen fokuserat på kliniska aspekter, och molekylära problem undersöks vanligtvis inte. Litteraturen tyder på att minst 70% av sporadiska lipom är resultatet av cytogenetiska omarrangemang som involverar 12q13-15-bandet, vilket kan leda till ett avreglerat uttryck av HMGA2 (high Mobility Group AT-hook 2) – genen. Denna gen kodar för icke-histoner kromatinproteiner som är ansvariga för DNA-konformationella förändringar, avvikande cellproliferation och utveckling av godartade mesenkymala tumörer.18-20

att erkänna den molekylära basen av genetiska tillstånd och genomförandet av sekvenseringstekniker med hög genomströmning har gjort det möjligt att utforska och belysa andra mekanismer som är involverade i etiologin för flera genodermatos. Därför syftade denna studie till att utföra en klinisk och molekylär karakterisering av sju individer med FML för att detektera varianter i sex kandidatgener relaterade till lipomatos med hjälp av Sanger-och nästa generations sekvenseringstekniker (NGS).

material och metoder

patienter och etiska aspekter

denna forskning genomfördes i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen. Godkännande erhölls från Institutional Review Board före studien (Research Ethics Committee vid FCM-UNICAMP, fil n kubi 1.313.164) och alla deltagare gav skriftligt informerat samtycke. Vi genomförde studien i polikliniken för medicinsk genetik service på kliniska sjukhuset vid University of Campinas (HC-UNICAMP) i S Bijo Paulo, Brasilien. Totalt sju personer som tillhör fem icke-närstående familjer (namngivna från A till E) var berättigade. Primära inklusionskriterier för val av försökspersoner var följande: i) ålder över 18 år, ii) klinisk och histopatologisk diagnos av lipom eller angiolipom och iii) familjär återfall som tyder på autosomalt dominerande arv. Huvudsakliga kliniska aspekter samlades in från medicinska journaler med hjälp av en strukturerad form. Fysisk bedömning involverade deltagande av både hudläkare och genetiker specialiteter. Patologiavdelningen vid HC-UNICAMP tillhandahöll de histopatologiska proverna. Kliniska fynd beskrivs i Tabell 1.

Sanger-sekvensering av HMGA2-genen

genomiskt DNA extraherades från perifera EDTA-blodprover av sju patienter enligt det konventionella fenolkloroformförfarandet som användes av sambrook et al21

en polymeraskedjereaktion (PCR) utfördes för att förstärka fem kodande exoner och intron-exon korsningar regioner i HMGA2 gen. Med hjälp av två bioinformatiska verktyg online, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) och OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) designade vi det specifika paret primers, som sammanfattas i Tabell 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies i enlighet med tillverkarens instruktioner. Kromatogram undersöktes med användning av Kromas v. 2.6.5. Resultaten jämfördes med HMGA2 Ensembl transkriptnummer ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Vi kontrollerade de nya varianterna i tre offentliga dataset: i) Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) och iii) online arkiv av brasilianska mutationer (http://abraom.ib.usp.br/). För att utvärdera patogenicitetspoäng och skadeeffekter av nya varianter i kandidat HMGA2-genen använde vi olika i silico prediktionsmodeller som VEP (Variant Effect Predictor), 22 FATHMM (funktionell analys genom dolda Markov-modeller), 23 UMD-prediktor,24 SIFT (sortering Intolerant från Tolerant), 25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), 26 och Mutation Taster.27

mål Multigenpanel

en anpassad panel utfördes för att bedöma generna involverade i syndromisk lipomatos. För att utföra denna teknik erhöll vi genomiskt DNA från salivprover av fem patienter (a, B, C, d och E) med hjälp av Oragene Javi DNA self-collection kit (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Kanada). Prover berikades sedan och hybridiserades mot målspecifika sekvenser. Infångningen gjordes med hjälp av nästa generations Illumina Kubi MiSeq (TruSeq Capture) sequencer i 150bp parat slutläge enligt standardprotokollet för denna plattform. Täckningsdjupet för målregioner var högre än 50x. berikning och analys fokuserades på kodande sekvenser av fem transkript (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038. 5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 och PTEN NM_000314.4), 10bp av introniska sekvenser och andra regioner förmodligen orsakande av sjukdom. Exoniska strykningar, dubbleringar och skarvplatsvariationer beaktades också under undersökningen. Läsningar anpassades och jämfördes med humant genomreferens (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) valdes för att validera varianter som nämnts av Invitae Xiaomi Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

datatillgänglighet

sekvenser skickades till GenBank (anslutningsnummer: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Datauppsättningar relaterade till denna artikel finns tillgängliga på European Bioinformatics Institute EMBL-EBI genom ENA repository med studieanslutningsnummer PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

resultat

klinisk analys

sju individer från fem icke-närstående familjer (A, B1, B2, C, D1, D2 och E) inkluderades, som avbildas i Figur 1. Vi identifierade inte föräldrarnas konsanguinitet mellan deltagarna. Etniskt ursprung rapporterades själv som Blandat av varje proband. I en allmän översikt observerades familjer a och B ha tre på varandra följande eller flera generationer inblandade. Förhållandet mellan man och kvinna beräknades i 1:6. Medelåldern vid inkludering var 42 år (SD 11,8), medan medelåldern för lesionsuppkomsten var 28 år (SD 11,8). Kvinnor rapporterade en toppincidens av knölar efter deras graviditeter. Klassiska kliniska egenskaper hos FML inkluderade mjuka knölar som är mycket varierande i antal och storlek, belägna i subkutant fett och begränsade till stammen och extremiteterna, som avbildas i Figur 2. Obehag och markant ömhet till palpation noterades endast hos enskilda A. comorbida gastrointestinala störningar var närvarande hos patienter A, C och D2. De rapporterade divertikulit och polyper, svår kronisk förstoppning respektive kolorektal cancer. Fyra patienter hade histologisk utvärdering av subkutana lesioner. Närvaron av mogna adipocyter avrundade av många kapillärer bekräftade angiolipomdiagnostik, som refereras av Bancroft och Fletcher et al10,28 (Figur 2). Andra relevanta resultat beskrivs i Tabell 1.

figur 2 kliniska egenskaper hos FML och histopatologiska aspekter av lipom (he-fläck (10 kg). Primära fynd inkluderar mjuka, mobila och omskriva smärtfria knölar, belägna i subkutant fett. Den vanligaste topografiska fördelningen innefattar de övre extremiteterna (A, B och D), främre bukväggen, rygg och lår (C). Lipom presenterar vanligtvis ett lobulerat mönster av vita adipocyter med enhetliga kärnor och en tunn fibrös kapsel (E). Angiolipomas består av moget fett i samband med många små blodkärl, som övervägande är kapillärer. Fibrintrombi (pilar) är mycket vanligt (F). Bilder med tillstånd av Institutionen för patologi och medicinsk genetik, School of Medical Sciences, UNICAMP.

Molekylär

Sanger-sekvensering avslöjade två nya varianter i exon 5 av HMGA2-genen. Båda varianterna identifierades i patient A och B1. Den första var en synonymt heterozygot variant c. 327C >T p.(Asp=) betraktas som låg påverkan eller neutral, baserat på flera prediktionsverktyg (VEP, FATHMM, UMD-prediktor, sikt, PROVEAN). Däremot var den andra förändringen en nonsensändring heterozygot variant c.328T>C (s.*110glnext*16) som orsakar en stoppkodonsubstitution med glutaminaminosyra och efterföljande förlängning av slutprotein (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Figur 3 schematiserar strukturen hos HMGA2-genen, proteinbindningsdomänerna och de nya varianterna.

varianten c.328t>C (s.*110glnext*16) definierades som 100% patogen eller hög påverkan enligt nämnda i silico-algoritmer. Mutation Taster prediction system visade emellertid en skillnad mellan de två beskrivna varianterna, som visas i tabell 3. Den riktade multigenpanelen AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA och PTEN i familjerna a, B, C, d och E upptäckte inte skadliga förändringar i utvärderade sekvenser.

diskussion

den aktuella studien syftade till att identifiera molekylära baser av FML genom integration av moderna sekvenseringstekniker såsom Sanger-sekvensering och ngs kombinerat med traditionella kliniska tillvägagångssätt.

Efter tidigare studier visar föreliggande forskning vissa skillnader beträffande epidemiologiska data. Vi observerade att det finns en vanlig missuppfattning om klassificering och diagnos av olika typer av lipomatos.7,10,15 flera författare betonar att män har en hög tendens att presentera flera lipom,11,29,30 men våra resultat visar en uppenbar hög frekvens av FML hos kvinnor. Det är möjligt att detta resultat bara återspeglar en urvalsförspänning på grund av liten provstorlek, eller kan också förklaras av det faktum att kvinnor är mer benägna att söka hälsovård på grund av kosmetiska problem.31 stamtavlorna indikerar dock att andelen individer som drabbats av båda könen var liknande, vilket ledde till ett könsförhållande nära 1:1 (10 män mot 13 kvinnor) vilket kan underskatta den verkliga förekomsten av FML.6,8,16 intressant var det totala antalet lipom som noterades hos kvinnor högre jämfört med den unika hanen som undersöktes.1,14

faktorer som övervikt och förvärrad tillväxt av knölar under och efter graviditeter tyder på att exogena faktorer (diet), metaboliska förändringar (dyslipidemi eller förändringar i fettsyradesaturation) och hormonella mekanismer kan vara involverade i adipocythyperplasi.32,33 Yee et al jämförde skillnader i enzymatisk desaturering av stearoyl-CoA mellan individer med sällsynta fettstörningar (RAD) och överviktiga kontrollgrupp och drog slutsatsen att individer med FML och fetma visade de högsta graden av desaturering, vilket ökade lipogenesprocessen.32,34

en oväntad upptäckt var att patient a var den enda inom den casuistiska och hennes familjegrupp som manifesterade smärta, daglig svaghet, trötthet och psykiatrisk comorbiditet (kronisk depression och ångestsyndrom). Dessa symtom är starkt förknippade med Dercums sjukdom, vilket anses vara en differentiell diagnos eller en variant av FML.35 baserat på den nya Dercums sjukdomsklassificering som föreslagits av Hansson et al,identifierade vi i denna patient den generaliserade nodulära formen, kännetecknad av intensiv smärta på fettvävnadens yta och runt lipom. En annan studie som stöder denna hypotes publicerades av Campen et al37 de beskrev en familj med nio medlemmar diagnostiserade med flera lipom som visade variabla symtom varierade från total funktionshinder till asymptomatiska knölar. Det kan därför antas att segregationen följer ett autosomalt dominerande mönster med variabel uttrycksförmåga och möjligen representerar en extrem manifestation av FML.

När det gäller den histopatologiska diagnosen visade vi två huvudtyper: lipom och angiolipom. Mikroskopiskt är den vanligaste märkbara egenskapen hos angiolipom spridningen av fina blodkärl som innehåller fibrinmikrotrombi i samband med mogna adipocyter.10,28 Angiolipom verkar ha en hög förekomst hos unga vuxna män som ibland uppvisar mild smärta eller ömhet. Denna typ av tumör är också relaterad till historien om lokalt trauma eller användningen av steroidterapi.13,38 även om många författare känner igen båda diagnoserna som olika patologiska enheter, gör vissa fallrapporter inte denna skillnad på grund av mycket subtila skillnader mellan dem.39 i detta sammanhang bekräftar vår analys att det är möjligt att få angiolipom med familjär återfall och dessa diagnoser kan vara en del av FML: s breda spektrum.40-43 dessutom har flera spindelcellslipom, en annan typ av lipom, också rapporterats i flera familjer.44

Även om det finns flera studier fokuserade på uttryck och direkt cytogenetisk analys på sporadiska lipom, har få studier varit oroade över konstitutionella orsaker till FML.2 omfattande lipomserier hos vuxna bekräftar flera strukturella omarrangemang med frekvenser från 50 till 75%.10,28,45 bland de balanserade kromosomala förändringarna observeras translokation t(3; 12) (q27-28; q13-15) i nästan 25% av tumörerna.9 i de flesta fall påverkar brytpunkten HMGA2-genen som består av 5 exoner och genererar ett protein av 109 aminosyror (Figur 3).18,46,47 Ligon et al rapporterade fallet med en åttaårig pojke med en konstitutionell omläggning som påverkar bandet 12q14.3 (de novo pericentrisk inversion) sålunda, med HMGA2-gen. Men den kliniska fenotypen som kännetecknas av somatisk överväxt, framsteg av ben-och tandålder, cerebellär tumör och flera lipom, 48 skiljer sig från vår casuistiska.

vi analyserade de heterozygota varianterna c. 327C >T p.(Asp=) och c.328t>C (s.*110glnext*16) av exon 5 av HMGA2-genen i olika prediktionsprogram. Den synonyma eller tysta förändringen tolkades som godartad, medan förändringen i översättningsstoppkodonet ansågs vara 100% patogen eller hög påverkan. På detta sätt kan det tyda på att förändringar som involverar 3-UTR-regionen (otranslated) skulle utlösa den neoplastiska transformationen av HMGA2-genen.49 Fusco et al lyfte fram den avgörande rollen för HMGA2-genen i mesenkymala tumörer. De föreslog att i HMGA2-genen tystas utr-regionen i allmänhet av Let-7 miRNA och varje förändring på denna nivå, antingen trunkering eller fusion med ektopiska sekvenser, driver till dess uppreglering och följaktligen till en onormal replikation av celler.46

det är något överraskande att vi i familj B hade upptäckt båda nya varianterna endast i modern (B1). Det kan indikera att de inte segregerar med FML-fenotyp och kasseras åtminstone i denna familj som en etiologisk orsak. Å andra sidan presenterade patient A samma två nya varianter men visade en fenotyp som mycket tyder på Dercums sjukdom. Trots dessa lovande resultat är de något svåra att tolka eftersom det inte var möjligt att bedöma andra släktingar som drabbats av FML.

fokal fettinfiltration och flera lipom kan förekomma i flera syndrom. Proteus syndrom och kryddnejlika (medfödd Lipomatös asymmetrisk överväxt, vaskulära missbildningar, Epidermal nevi, skelett-och ryggradsanomalier) är exempel på somatiska mutationer där lipomatos är närvarande.50,51 å andra sidan är Bannayan-Riley-Rubacalva syndrom, multipel endokrin neoplasi typ 1, Cowden syndrom och Gardner syndrom tillstånd som härrör från germlinmutationer som har samtidig lipomatos.52-55 även vissa mutationer som involverar mitokondriell funktion är relaterade till onormal fettvävnadstillväxt mestadels i överkroppen och nacken och det bästa exemplet är Madelung-sjukdomen.56 den negativa panelen AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA och PTEN utesluter emellertid att de är ansvariga för FML-fenotypen, åtminstone i denna forskning.

slutsats

FML är en sällsynt och heterogen sjukdom som kan överlappa med andra dermatologiska syndrom såsom Dercums sjukdom. FML: s naturhistoria i denna serie avslöjade att utvecklingen av lesioner var progressiv och nådde sin högsta förekomst hos medelålders individer. FML påverkade båda könen och presenterade en topografisk fördelning med övervägande i extremiteter och bagage. Könsförhållandet bland utvärderade patienter visade en kvinnlig prevalens, men stamtavla data visade en mer balanserad fördelning. Diagnosen Dercums sjukdom erkändes också hos en individ (patient a).

det molekylära tillvägagångssättet har gett en mer djupgående inblick i den genetiska grunden för FML och har försökt att grundligt undersöka det största antalet kandidatgener kopplade till det. Vi lyfte fram nyttan av NGS förutom Sanger-metoden i förståelsen av hela spektrumet av FML, på grund av att det kan erbjuda ett alternativ för etiologiidentifiering och karakterisering av sällsynta genetiska tillstånd i kliniska miljöer. Varianter i exon 5 av HMGA2-genen har inte beskrivits, och hittills har de en osäker betydelse i uppkomsten av FML. Ytterligare studier, inklusive ett mer signifikant antal drabbade individer och funktionell analys av de nya varianterna av hgma2-genen, bör genomföras för att bestämma dess biologiska funktion i FML bättre.