introduktion

Halofiler är intressant grupp av organismer som blomstrar vid hög salthalt. Dessa organismer kan i stort sett klassificeras baserat på deras optimala salthalt för tillväxt till milda halofiler (1-6%, w/v NaCl), måttliga halofiler (7-15%) och extrema halofiler (15-30%) (Madigan och Martinko, 2006). Omfattande forskning har visat att halofiler inte är begränsade till någon av livsdomänerna, de kan vara eukaryoter (Gonde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), eller prokaryoter som tillhör domänerna bakterier och Archaea. Alger släktet Dunaliella och saltlake räkor Artemia (Boetius och Joye, 2009) är exempel på halofila eukaryoter, medan Halobacterium och Salinibacter är exempel på halofila prokaryoter. Framgång för halofiler att överleva i mycket salta miljöer beror på unika fysiologiska anpassningar, som jonpumpningsstrategi och ackumulering av organiska lösta ämnen (Oren, 2006; Madigan och Martinko, 2006). Vid de genomiska och proteomiska nivåerna kännetecknas halofiler av högt GC-innehåll och proteiner som kännetecknas av låg hydrofobicitet, överrepresentation av sura rester, lägre benägenheter för helixbildning och högre benägenheter för spiralstruktur (Paul et al., 2008).Halofiler får nu mer tillgång till industriell mikrobiologi och bioteknik eftersom halofiler växer vid hög saltkoncentration och detta minimerar risken för kontaminering under odling (Oren, 2006). Få exempel på biotekniska tillämpningar är användningen av Micrococcus varians för att producera nukleas H (Kamekura el al., 1982) och användningen av halofila Tetragenokockstammar vid produktion av sojasås och produktion av vissa enzymer inklusive hydrolaser (amylaser, nukleaser, fosfataser och proteaser) (Oren, 2006). Halofiler är också viktiga vid biologisk nedbrytning och bioremediering eftersom många halofiler kan bryta ned kolväten och andra giftiga föreningar (Ventosa et al., 1998). Halofiler kan också producera polymerer som används som förstärkare av oljeåtervinning på grund av deras ytaktiva aktivitet och bioemulsifying egenskaper (Oren, 2006).

Halofiler blomstrar i miljöer där salthalten når höga nivåer, såsom hav, solsaltrar och naturliga saltsjöar (Oren, 2007). Döda havet i Jordanien är en av världens största riktigt hypersalina insaltsjöar (Boetius och Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan och Martinko, 2006). Förutom hög salthalt; salt, koncentration på över 340 g L – 1 (Oren, 2007), Döda havet är unikt med sitt höga barometertryck (800 mmHg) på grund av mycket låg höjd under havsnivån, partiellt syretryck (PIO2) på 8% mer än vid havsnivån, unik UV-strålning, låg luftfuktighet (under 40%) och brist på regn (Avriel et al., 2011).

denna studie genomfördes för att klassificera de halofila heterotrofa bakteriearterna som blomstrar i kustzonen i Döda havet i Jordanien. Mikrobiell klassificering är baserad på kolonial och cellmorfologi, liksom likhet i 16S rRNA-gen.

material och metoder

provtagning: döda havsvattenprover samlades in från fyra kustzoner (Fig. 1) i mars, juni och oktober, 2011. Geografiska koordinater och höjd för provtagningsplatserna visas i Tabell 1. Geografiska koordinater och höjd bestämdes för varje plats av (eTrex Legend C, Taiwan). Döda Havsvattenprover samlades i 1 L ren steril glasflaska som lämnade tillräckligt med huvudutrymme i flaskan och transporterades omedelbart till labbet.

fysikalisk-kemisk analys av proverna: Temperatur, pH, totalt upplösta fasta ämnen (TDS) och biologiskt syrebehov (BOD) av vattenprover bestämdes. Vattentemperatur, pH och salthalt mättes in situ. Vattentemperatur och pH mättes med en bärbar pH-mätare (mikrodator pH-mätare T19000, Transinstrument). Salthalt mättes med en handhållen salthalt refraktometer. BOD mättes i (forskningscenter för vatten, miljö och torra regioner vid Al al-Bayt University, Jordanien). Vattenprover överfördes till en ny glasflaska, sedan tillsattes 1 mL fosfatbuffert, magnesiumsulfat, kalciumklorid, järnkloridlösningar per liter vattenprov. Provet bringades sedan till temperatur 20 C 3 c c och mättades med organisk fri filtrerad luft. Provets pH kontrollerades. Om provet inte låg i intervallet 6,5-7,5 tillsattes svavelsyra eller natriumhydroxid för att bringa provet till det erforderliga pH-området (6,5-7,5) och den tillsatta koncentrationen spädde inte provet mer än 0,5%. Provet bringades till temperatur 20 c c innan utspädningar gjordes. Lämplig volym av provet överfördes sedan till BOD-flaskor. Flaskan fylldes med tillräckligt med utspädningsvatten för att förskjuta all luft och lämnade inga bubblor. Upplöst syre (DO) bestämdes med hjälp av en DO-analysator och eventuellt förskjutet innehåll ersattes med utspädningsvatten och stoppades tätt. Flaskan inkuberades i 5 dagar vid 20 kg C. Därefter bestämdes DO och BOD beräknades enligt skillnaden mellan initial och slutlig DO-volym.

berikning, isolering och gramfärgning: För att berika vattenprover överfördes döda havsvattnet (10 mL) till 90 mL flytande medium med hög salthalt och inkuberades vid 30 CCC i mörker med skakning (100 rpm). Efter ca 12 h, en loopful av anrikningskultur strimmades på modifierat fast mineralsaltmedium och de separerade kolonierna subkulturerades sedan. Glycerolbestånden av isolaten bereddes och lagrades också vid -20 CCC för vidare analys. Cellerna var Gramfärgade och undersöktes under mikroskopet.

16S rRNA-gensekvensering och analys: 16S rRNA-gensekvensförstärkning och sekvensering utfördes av Macrogen Inc., Seoul, Korea, enligt följande metod: unga kolonier av bakteriestammarna suspenderades i ett 1,5 mL centrifugrör innehållande 0,5 mL steril saltlösning och centrifugerades sedan vid 10 000 rpm i 10 min supernatanten avlägsnades och pelleten suspenderades i 0,5 mL Instagenmatris (Bio-Rad, USA) och inkuberades vid 56 CCR i 30 min och upphettades sedan till 100 CCR i 10 min. Efter uppvärmning användes supernatant för PCR. PCR utfördes genom att blanda 1 CGL mall-DNA med 20 CGR PCR – reaktionslösning. 27F / 1492R grundfärger (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5’-Tac GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) användes för amplifiering och sedan utfördes 35 förstärkningscykler vid 94 cc i 45 sek, 55 cc i 60 SEK och 72 cc i 60 SEK. Oinkorporerade PCR-primers och dNTPs avlägsnades från PCR-produkter genom Montage PCR Clean up kit (Millipore). De renade PCR-produkterna på cirka 1400 bp sekvenserades av 518f/800R primers (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Sekvensering utfördes med hjälp av Big Dye terminator cycle sequencing kit v. 3. 1 (Applied BioSystems, USA). Sekvenseringsprodukter löstes på ett Applied Biosystems model 3730xl automatiserat DNA-sekvenseringssystem (Applied BioSystems, USA) vid Macrogen, Inc., Seoul, Korea.

sekvenserna analyserades och jämfördes med den offentliga nukleotiddatabasen med hjälp av NCBI BLAST-webbplatsen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sekvenser av närmaste släktingar hämtades sedan från databasen och användes för att konstruera ett fylogenetiskt träd med MEGA5 (Tamura et al., 2011). GC-innehåll sekvenserna beräknades med Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

resultat

fysikalisk-kemiska egenskaper hos proverna: döda Havsvattenprover var mycket saltlösning från (36-38%). PH-värdena för proverna var låga och varierade från 5,6 till 6,3. Detta indikerar den svagt sura egenskapen hos havsvatten. BOD-värdet var mycket lågt (1-2 mg O2 L-1) vilket indikerar mycket lågt organiskt materialinnehåll i provet. De fysikalisk-kemiska egenskaperna visas i Tabell 2.

heterotrofisk livskraftig bakterieantal: resultat av livskraftigt plattantal avslöjade mycket lågt antal kolonibildande enheter i varje prov (200-6000 CFU mL-1). CFU-räkningen visas i mer detaljer i tabell 3.

isolering och klassificering av halofila heterotrofa bakterier: i denna studie har vi isolerat 44 halofila heterotrofa bakteriestammar. Elva bakteriestammar av 44 ansågs olika baserat på kolonial morfologi, Gramfärgning och cellmorfologi. Sju av elva olika stammar var Gram-positiva och 4 av 7 var Gram-negativa. Bakteriestammarna identifierades baserat på 16S rRNA-genanalys och de befanns tillhöra bakteriens domän. Den närmaste släktingen för varje isolerad bakteriestam visas i Tabell 4 och Fig. 2. Alla sekvenser visade ett relativt högt GC-innehåll (upp till 58%).

diskussion

de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos döda havsvattenprover bestämdes och analyserades. Salthalten visade sig vara mycket hög (upp till 38%). Detta är ett typiskt kännetecken för döda havsvattnet, vilket gör det till en av de berömda “athalassohaline” brines (Oren, 2007). PH i döda havsvattnet visade sig vara något surt (5,6-6,3) jämfört med pH (7,5-8) i thalassohaline brines (Oren, 2007). BOD av proverna var mycket låga (1-2 mg O2 L-1) reflekterande lågt organiskt material i vatten som kunde utnyttjas av heterotrofa bakterier. Dessa fysikalisk-kemiska förhållanden påverkar utan tvekan den mikrobiella mångfalden negativt. Därför var antalet livskraftiga celler i de testade proverna mycket lågt (högst 6×102 CFU mL-1) jämfört med öppet havsvatten. Räkningar av heterotrofa bakterier i marina vatten är vanligtvis i storleksordningen 105 till 106 bakterier mL-1 (Zweifel och Hagström, 1995; Madigan och Martinko, 2006). Dessa siffror härrör från ospecifika fluorescerande färgningstekniker (Zweifel och Hagström, 1995) som vanligtvis ger högre siffror än livskraftig plattantalsmetod. De första publikationerna om bakterieantal i Döda havet gjordes genom mikroskopi. Cellnumret var ungefär 1.9×106 celler mL1 och under en blomning av röda halobakterier nådde befolkningstätheten 1, 9×107 men minskade efter malar till 5×106 (Oren, 1983).

forskning om halofila organismer som bor i Döda havet började mycket tidigt 1892 när bakterier isolerades från släktet Clostridium från lera (Oren, 2002). Senare, i en kort artikel publicerad 1936, gav den första beskrivningen av ett inhemskt mikrobiellt samhälle anpassat till de extremt hårda förhållandena i Döda havet (Oren och Ventosa, 1999). Sedan dess har vår kunskap om de biologiska aspekterna av Döda havet expanderat och ackumulerats. Vi genomförde denna forskning för att utöka vår kunskap om de halofila heterotrofa bakterierna som blomstrar i kustzonen i Jordanska Döda havet. Vi har isolerat olika bakteriearter. Därefter isolerade och identifierade vi 11 olika arter av halofila bakterier. De flesta isolat var Gram-positiva (7 av 11). Även om Gram-positiva bakterier har viktiga anpassningar gör det möjligt för dem att kupa med miljöstress som hög salthalt (Battistuzzi and Hedges, 2009). Det är inte klart i litteraturen om Gram-positiva bakterier eller Gram-negativa bakterier dominerar i hypersalinmiljöer. I en studie på prokaryota halofiler återhämtade sig från sediment från den grunda el-Djerid Salt lake i Tunisien, Hedi et al. (2009) fann att den dominerande bakteriepopulationen tillhör Gram-positiva sporbildande bakterier.

alla isolerade stammar i denna studie tillhör bakteriens domän. De tillhör 7 olika släktingar i domänen. Fem av sju Gram-positiva bakterieisolat tillhör släktet Bacillus. Detta släkt grundades 1872 för att inkludera tre arter, men nu finns det 142 namngivna bacillusarter listade i Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Logan och de Vos, 2009). Bacillusstammar är vanligtvis jordstammar. Bacillusstammar isolerade i denna studie tillhör följande arter B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis och B. cereus. Dessa stammar påträffades i olika salta miljöer (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Till exempel B. licheniformis återhämtades tidigare från marina sediment av Miranda et al. (2008), medan B. pumilus isolerades från marina organismer som ostron, krabba och fisk förutom sediment av Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis återhämtades från havsvatten i östra havet och Gula havet i Korea (Yoon et al., 2004). Och slutligen B. cereus, en vanlig jordbakterie, påträffades i avloppsvatten men med halofila egenskaper (Al-ZaZaee et al., 2011). Tjock cellvägg, högt peptidoglykaninnehåll (mer än 90% av cellväggen) (Madigan och Martinko, 2006), högt GC-innehåll och resistent sporbildning är de främsta orsakerna till bacillusöverlevnad under svåra förhållanden som hög salthalt. Det bör noteras att Stam DSD32 (identifierad som B. cereus) har den mycket låga likheten med sin närmaste släkting B. cereus. Denna stam kan representera en ny art i släktet Bacillus baserat på 16S rRNA-gen.

de andra två grampositiva bakterierna är stammar av Arthrobacter sp. och Kocuria rosea. Arthrobacter arter är utbredda i naturen, särskilt i jord (Funke et al., 1996) men är inte särskilt vanligt i hypersalinmiljöer. Kocuria rosea anses vara måttligt halofila arter och det återhämtades från olika saltlösningsmiljöer som saltlösning Öppet grunt vatten och vissa stammar av Kocuria rosea växer optimalt vid NaCl-koncentration på 30% (Wright och Tanaka, 2002).

gramnegativa bakterier var mindre frekventa i våra prover (4 av 11). Ändå visar publicerad litteratur att dessa isolat inte är ovanliga i Salta miljöer. En av de isolerade stammarna identifierades som Vibrio alginolyticus. Den senare arten är faktiskt vanlig i Marina prover (Molitoris et al., 1985) och påträffades i marint havsvatten. Stammen har medicinsk betydelse eftersom det kan orsaka komplicerad hud-och mjukvävnadsinfektion (Sganga et al., 2009). Ännu viktigare, vissa stammar av Vibrio alginolyticus befanns producera tetrodotoxin, ett starkt neurotoxin (Noguchi et al., 1987). En annan gramnegativ bakterie som identifierats i denna studie är Chromohalobacter salexigens. Denna art isolerades först och beskrivs som den måttligt halofila arten Halomonas elongata och föreslogs sedan som nya arter av Kromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli är en annan art som identifierats i denna studie. Denna stam är inte heller ovanlig för saltlösningar. Det isolerades nyligen från tidvatten Platt av Gula havet i Korea och det beskrevs som halofila arter av Yoon et al. (2005). Den sista stammen tillhör Salinivibrio costicola. Denna art beskrevs först som Vibrio costicola men dess fenotypiska och genotypiska egenskaper skilde den från arter av släktet vibrio. Därför placerades stammen i ett nytt separat släkt som heter Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola är måttligt halofil och isolerades ursprungligen från saltad mat och växer optimalt i media innehållande 10% salter (Mellado et al., 1996). En medlem av släktet Salinibacter, S. ruber, är en intressant modell för studier av anpassning av mikroorganismer till liv vid höga saltkoncentrationer (Oren, 2007).

slutsats

döda havsvattnet från kustzonen kännetecknas av hög salthalt, lågt pH, lågt organiskt materialinnehåll (lågt BOD) och hindrar olika arter av heterotrofa bakterier som tillhör både Gram-positiva och gramnegativa släkten inklusive Artrobakterier, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Kromohalobacter, Bacillus och Erythrobacter.

bekräftelse

denna studie stöddes av deanship of academic research vid Al al-Bayt University, Jordanien, beslut av Scientific Research Council i möte nummer 2/2010/2011. Således vill författaren uppskatta det ekonomiska stödet från Universitetet.