| mag vs resolution | working distance | monocular parts | care of the microscopes |
| monocular focusing | oil immersion | measuring field diameter | binocular parts | binocular focusing | PDF version| Microscopy Exercises |

A. Inledning

det typiska sammansatta ljusmikroskopet (Fig.1) kan öka vår förmåga att se detaljer Med 1000 gånger så att objekt så små som 0,1 mikrometer (um) eller 100 nanometer (nm) kan ses. Elektronmikroskop utökar detta intervall ytterligare så att vi kan se objekt så små som 0,5 nm i diameter eller ungefär 1/200 000 TH den storlek vi kan se med blotta ögat. Naturligtvis har utveckling och användning av Mikroskop väsentligt förbättrat vår förståelse av celler och deras struktur och funktion.

Figur 1. Binokulärt sammansatt mikroskop.

B. förstoring, upplösning och Arbetsavstånd

förstoring är helt enkelt en funktion för att få ett objekt att se större ut, till exempel när vi använder en handlins för att förstora det tryckta ordet. Att bara förstora ett objekt utan en samtidig ökning av mängden detaljer som ses kommer inte att ge tittaren en bra bild. Förmågan hos ett mikroskop (eller öga) att se detaljer är en funktion av dess upplösningskraft. Upplösningskraft definieras som det minsta avståndet mellan två objekt där objekten bara kan särskiljas som separata och är en funktion av ljusets våglängd och optikens kvalitet. I allmänhet är ju kortare våglängden hos ljuskällan desto högre upplösning av mikroskopet.

arbetsavstånd är avståndet mellan objektivlinsen och provet. Vid låg förstoring är arbetsavståndet relativt långt. När du ökar förstoringen minskar arbetsavståndet dramatiskt. Oljedämpningslinser berör paktiskt provet. Var medveten om denna förändring i Arbetsavstånd med ökande förstoring för att förhindra skador på dina prover.

överst på sidan

C. delar av det monokulära sammansatta ljusmikroskopet:

ta dig tid att bekanta dig med ditt mikroskop och dess korrekta användning. Kontrollerna av de två fabrikerna av Mikroskop som vi använder i våra kurser visas nedan (Fig. 2).

Figur 2. Kontroller på Leica och Olympus binokulära sammansatta mikroskop.

1. Okulär lins eller okular: vår är 10x förstoring. Räckvidden vi kommer att använda är monokulära(endast ett okular.)

2. Kroppsrör: innehåller speglar och prismor som leder bilden till ögonlinsen.

3. Nosepiece: håller objektivlinserna, roterar, notera de positiva stoppen för varje lins.

4. Objektiv: vanligtvis 3-4 på våra omfattningar, 4x, 10x, 43x, 100x oljedämpning (röd banding). Total förstoring = okulär effekt x objektiv effekt.

5. Steg: plattform på vilken glidbanor är monterade för visning; vissa omfattningar har mekaniska steg. Lär dig hur du klipper bilden på rätt sätt.

6. Membran: membranet styr mängden ljus som passerar till provet och kan drastiskt påverka bildens fokus. LÄR DIG ATT ANVÄNDA MEMBRANET SÅ SNABBT SOM MÖJLIGT. DE FLESTA PROBLEM DU KOMMER ATT FOKUSERA BEROR PÅ FELAKTIG JUSTERING AV LJUS.

Vi har två typer:

• irismembran: leta efter en spak precis under scenen nära framsidan.
• dial type: strax under scenen är en roterande ratt med olika storlek öppningar (hål); denna typ är användbar för att skapa en pseudo mörk fälteffekt.

7. Fokuseringsknappar: ligger på sidan av mikroskopet; yttersta är det fina fokuset och innersta är det grova fokuset.
8. Ljuskälla: våra omfattningar har inbyggda ljuskällor. Tryckknappsbrytaren är placerad (oftast) bakom ljuslinsen på basen.

överst på sidan

D. Skötsel och hantering av Föreningsmikroskopet

det finns bara några absoluta regler att observera när du tar hand om mikroskopen du ska använda. Tas om hand, dessa instrument kommer att pågå i många decennier och fortsätta att fungera bra. Rapportera eventuella fel omedelbart till din instruktör.

1. Använd alltid två händer för att bära räckvidden-en på armen och en under basen-inga undantag! Bär aldrig räckvidden upp och ner, för den okulära burken och kommer att falla ut.

2. Använd linspapper för att rengöra alla linser före varje labbsession och efter användning av oljedämpningslinsen. ANVÄND ALDRIG NÅGONSIN, INTE NU, INTE NÅGONSIN, ANNAT ÄN LINSPAPPER FÖR ATT RENGÖRA LINSERNA. Andra papper är för orena och kommer att repa den optiska beläggningen på linserna. Använd inte heller några vätskor vid rengöring av linserna-endast LINSPAPPER!

3. Använd alltid rätt fokuseringsteknik för att undvika att ramma objektivlinsen i en bild – Detta kan bryta objektivlinsen och/eller förstöra en dyr bild.

4. Stäng alltid av lampan när du inte använder räckvidden.

5. Placera alltid kabeln försiktigt ur skadans sätt. Ledningar loopade i benutrymmena bjuder in en stor mikroskopkatastrof. Försök skjuta tråden ner genom lådan handtag bside din bänk utrymme.

6. Byt alltid ut locket på mikroskopet när du lägger bort det

överst på sidan

E. Fokuseringsförfarande: monokulära sammansatta Mikroskop

1. Slå på ljuskällan.

2. Byt till 10x objektivlins.

3. Backa på det grova fokuset för att höja nässtycket.

4. Placera provglaset på scenen och säkra i rätt läge. Titta på bilden och placera den så att provet är över ljusöppningen i scenen.

5. Lägre objektivlins till lägre gräns (nära glid). Lyft linsen med den grova fokusratten tills du ser bilden komma i fokus och sedan gå ut igen, fokusera sedan tillbaka tills du hittar mittfokus. Justera fin fokus på samma sätt.

6. Centrera bilden och justera ljuset med membranet.

7. Sentera och justera fokus, först grovt, sedan fint fokus som i steg 5.

8. Justera membranet efter behov.

9. Byt nu mål till 43x om en högre förstoring behövs. Justera fint fokus och ljus (membran) efter behov.

våra omfattningar är parfokala vilket innebär att när du byter från låg (100x) till hög (430x) effekt, kommer en fokuserad bild med låg effekt att förbli mer eller mindre i fokus vid högre effekt. Troligtvis måste du justera det fina fokuset och membranet något.

överst på sidan

F. Oil Immersion Procedure

på några av våra monokulära och alla binokulära sammansatta mikroskop har vi 100x oil immersion linser. Dessa kan identifieras med ett rött band runt linshuset. Vid förstoringar större än ca 500x bryts ljus för mycket när det passerar genom luft för att ge god upplösningskraft. Således är optik för dessa högre förstoringar gjorda för att användas med en högkvalitativ mineralolja som medium för överföring av ljus. Det är absolut nödvändigt att du endast använder nedsänkningsolja och att du rengör linsen noggrant med linspapper efter varje användning.

1. Leta reda på regionen av intresse på din bild och centrera den på 430x.

2. Höj objektivlinsen till dess gräns (dvs., maximera avståndet mellan scen och mål) och sväng linsen ur vägen ungefär halvvägs till nästa position.

3. Placera försiktigt en liten droppe nedsänkningsolja direkt på bilden över mitten av regionen av intresse.

4. Vrid oljedämpningsmålet på plats och försiktigt, medan du tittar från sidan, sänk det med den grova fokusratten tills linsen bara kommer i kontakt med oljedroppen. Du kommer att se droppen hoppa upp i en kolumn när kontakten görs.

5. Sänk linsen en smidgen mer och fokusera sedan på provet med det fina fokuset och titta igenom ögonlinsen.

6. När du är klar, rengör linsen med linspapper tills ingen mer olja lossnar och rengör glid om den ska sparas.

överst på sidan

G. bestämning av Visningsfältets Diameter

Du kanske vill uppskatta storleken på proverna (t.ex. celler) som du kommer att se i lab. Det bästa sättet att göra detta är med en okulär mikrometer, en precision okulär linsinsats som har en linjal etsad i glas. De monokulära omfattningarna vi använder i introduktionskurserna är inte så utrustade, så vi kommer att använda en alternativ metod baserad på att känna till synfältets diameter för just ditt mikroskop. För att göra detta måste du bestämma:

• den ungefärliga diametern för ditt synfält med låg förstoring för just ditt mikroskop.
• den totala förstoringen för var och en av dina andra objektiv.

genom att veta detta för varje objektiv kan du jämföra provets storlek mot den kända fältdiametern och göra ett rimligt esimat av storlek. Denna teknik fungerar för alla mikroskop.

1. Skaffa en glidskala och placera den på ditt räckvidd. En transparent metrisk linjal fungerar också.

2. Ta det i fokus med 10x-målet (100x totalt). Skalstängerna är steg om 1 mm som visas i figuren nedan. Således, en svart bar = 0,5 mm som gör ett utrymme.

3. Flytta bilden så att kanten på en yttre svart stapel bara är tangent till det tända fältet (se punkt ”A” ovan).

4. Börja vid den kanten och uppskatta hur många staplar och mellanslag det tar att korsa synfältet. Du måste förmodligen uppskatta den sista fraktionen av ett mellanslag eller stapel. För de flesta av våra mikroskop är den ungefär 1,8 -2,0 mm bred. Du måste kontrollera detta på alla mikroskop du använder som inte har en okulär mikrometer.

5. Spela in ditt scope ID-nummer och fältdiameter på 100x i din labbanteckningsbok för framtida referens.

6. Beräkna sedan fältbredden vid 430X Total förstoring med följande formel (vi hänvisar till 100x mag som ”låg effekt” och 430x som ”hög effekt”):

(låg effekt mag/ hög effekt mag) X låg effektfältdiameter (i mm)

anta till exempel att du bestämmer att 100x fältdiameter är 1,8 mm, vid 430x skulle fältdiametern vara:

(100 / 430) x 1,8 mm = 0,418 mm = 418 um (mikrometer)

Observera att fältdiametern vid hög effekt är proportionell mot förhållandet mellan målen med låg och hög effekt. Det vill säga, när du ökar förstoringen blir det faktiska synfältet proportionellt mindre.

överst på sidan

H. binokulära sammansatta ljusmikroskop
delar av ljusmikroskopet

1. Okulär lins eller okular: vår är 10x förstoring. De omfattningar vi kommer att använda är kikare (två okular).

2. Kroppsrör: innehåller speglar och prismor som leder bilden till ögonlinserna.

3. Nosepiece: håller objektivlinserna, roterar

4. Objektiv: vanligtvis 3-4 på våra omfattningar, 4x, 10x, 43x, 100x oljedämpning (röd banding). Total förstoring = okulär effekt x objektiv effekt. De flesta av våra kikare har fasta positionslinser-scenen rör sig upp och ner snarare än linsen.

5. Steg: rörlig plattform på vilken glidbanor är monterade för visning; alla våra omfattningar har mekaniska steg med X,Y vernier skalor. Fokus knoppar flytta scenen upp och ner.

6. Kondensor: en substage lins som fokuserar ljuset på provet. Våra kikare har Kondensorer som rör sig upp och ner för att fokusera ljusstrålen.

7. Iris Membran: membranet ligger strax under scenen och styr mängden ljus som passerar till provet och kan drastiskt påverka bildens fokus.

8. Fokuseringsknappar: yttersta är det fina fokuset och innersta är det grova fokuset. På kikaren styr dessa knoppar upp / ner rörelsen på scenen.

9. Ljuskälla: våra omfattningar har inbyggda ljuskällor. Reostat ON / OFF-omkopplaren är placerad antingen på räckvidden eller på den externa strömförsörjningen och används för att reglera ljusintensiteten.

överst på sidan

I. Fokuseringsförfarande: Binokulära sammansatta Mikroskop

1. Slå på ljuskällan. Binoc scopes har antingen en inbyggd enhet eller en extern strömförsörjning.

2. Byt till 10x objektivlins.

3. Justera det grova fokuset för att höja nässtycket (eller sänka scenen).

4. Klipp provsliden på scenen i rätt läge.

5. Titta på de okulära linserna i ditt omfång. En lins är fast och den andra har en fokuseringsring (som en kikare). Ta linsen så nära bilden som möjligt och titta bara genom den fasta okulära linsen, sätt tillbaka tills provet bara kommer i fokus. Justera finfokus på samma sätt för den fasta linsen.

6. Nu, titta bara genom det justerbara okularet, justera dess fokus med fokusringen runt linsen. Titta med båda ögonen (justera för interpupillärt avstånd för att se ett enda runt upplyst fält) och gör några mindre justeringar för att fokusera.

7. Centrera bilden och justera ljuset med hjälp av kondensorlinsen, irismembranet och ljuskällans reostat.

8. Sentera och justera fokus, först grovt, sedan fint fokus som i 5.

9. Justera membranet efter behov.

10.Byt nu mål till en högre effekt. Justera fint fokus och ljus (membran) efter behov.

våra omfattningar är parfokala vilket innebär att när du byter från låg till hög effekt kommer en fokuserad bild med låg effekt att förbli mer eller mindre i fokus vid högre effekt. Troligtvis måste du justera det fina fokuset och membranet något (öka ljuset vid högre krafter.

Modified 11-6-15 gja

Department of Biology, Bates College, Lewiston, ME 04240