Articles

benmineral :nya insikter i dess kemiska sammansättning

identifiering av HPO4 2− joner i benmineral

den direkta solid state kärnmagnetisk resonans (ssNMR) detektering av protoner lokaliserade i benmineral från ett intakt benvävnadsprov är inte möjligt. Detta beror på närvaron av den extracellulära organiska matrisen vars olika signaler dominerar 1H single pulse (SP) ssNMR-spektrumet i ett benvävnadsprov54. Möjligheten att avslöja rumsliga proximiteter i atomskala bland väte-och fosforkärnor i det tvådimensionella (2D) {1h}31P Heteronukleära korrelationen (HetCor) ssNMR-experimentet möjliggör sondering av benminerala vätemiljöer genom analys av F1-dimensionen (Fig. 1A). Tyvärr är detta experiment tidskrävande och ger upphov till en 1H-projektion av den vertikala (F1) dimensionen med ett relativt dåligt signal-brusförhållande (S/N) och en låg digital upplösning (Fig. 1B). För att övervinna dessa begränsningar använde vi det endimensionella (1D) {1h-31P}1H double cross polarization (CP) ssNMR-experimentet. Den består av en dubbel CP-överföring som utförs på ett ”där-och-tillbaka” sätt (1H 31P 1H) (Fig. S1). Först tillät detta experiment oss att erhålla 31P-filtrerade 1H ssNMR-spektra av benmineral från ett intakt, kortikalt 2-årigt fårbenvävnadsprov med en utmärkt S/N trots en relativt kort förvärvstid (dvs 9 timmar) (Fig. 1C, D). De olika 1H kemiska miljöerna från benmineral är nu lätt observerbara och kan analyseras säkert med precision. När det gäller den inre kristallina kärnan i benmineralpartiklar observeras de hydroxyljoner som finns i hydroxiapatitens kristallgitter i form av en komplex resonans centrerad vid XII(1h) = 0,0 ppm. När det gäller deras amorfa ytskikt kan strukturella vattenmolekyler och sura fosfatarter som finns i icke-apatitiska miljöer observeras i form av en enda resonans centrerad vid XII(1h) = 5.2 ppm och en bred resonans som sträcker sig från KB(1H) = 7 till 17 ppm32, respektive.

Figur 1
figure1

detektion av vätebärande arter i benmineral. 1H-31P korspolarisering (CP) baserad magisk vinkelspinnning (MAS) solid-state kärnmagnetisk resonans (ssNMR) spektra av ett torrt 2-årigt fårbenvävnadsprov. (A) tvådimensionell (2D) {1H}31P Heteronukleär korrelation (HetCor) spektrum (kontakttid, tCP = 1000 CBS). Signalintensiteten ökar från blått till rött. (B) 1H projektion av den vertikala (F1) dimensionen av 2D {1h}31P HetCor spektrum visas i (a). {1H-31P}1H dubbel CP MAS spectra registreras med följande kontakttider: (C) tCP1 = tcp2 = 1000 CBS; och, (D) tcp1 = tcp2 = 15000 CBS. Den totala experimentella tiden var densamma i varje experiment (dvs 9 timmar).

För det andra tillåter detta experiment undersökningen av den 1H-upptäckta CP-dynamiken för att selektivt avslöja naturen hos 1H-kärnorna i närheten av 31P-kärnor. För detta ändamål hölls kontakttiden 1 (tCP1) fastställd till 1000 CBS, medan kontakttiden 2 (tCP2) varierades från 75 CBS upp till 1000 CBS (Fig. 2). En likformig ökning av magnetiseringen observeras för både resonanserna centrerade vid XII(1h) = 0,0 och XII (1h) = 5,2 ppm (se de svarta streckade linjerna), som tidigare tillskrivits OH− joner och strukturella H2o-molekyler enligt deras respektive 1H NMR kemiska skift. Däremot visar utvecklingen av den breda signalen i intervallet av megapixlar(1H) = 7-17 ppm initialt en snabb ökning av dess magnetisering (upp till tcp2 = 300 cu) och följs av närvaron av ett oscillerande beteende (upp till tcp2 = 1250 Cu – Se den svarta streckade linjen). Detta oscillatoriska beteende är karakteristiskt för 1H-31P dipolära (DP-H) oscillationer55,56. Monteringen av motsvarande {1h-31P}1H ssNMR-spektra vid olika tCP2 är inte enkel på grund av överlappningen av olika resonanser. Syntetiska HA-prover uppvisar vanligtvis en symmetrisk OH-resonans32; vi visar här att OH-resonansen hos benmineral är särskilt komplex och kan monteras på följande sätt: en huvudtopp vid 6h(1H) = 0,0 ppm omgiven av två axeltoppar vid 1H(1H) = -0,7 och 0,9 ppm (Fig. S3). Den återstående strukturella vattenresonansen kan utrustas korrekt med en enda topp centrerad vid KB(1H) = 5,2 ppm (Fig. S4). Däremot kan den breda signalen från de sura fosfatarterna som kan observeras i intervallet Kubi (1h) = 7-17 ppm inte på ett tillfredsställande sätt förses med en enda topp med fast position och linjebredd, särskilt vid korta kontakttider (se de bästa passande resultaten för de olika tcp2-värdena i Fig. S4-vänster kolumn). Passningsresultaten är dock korrekta när två olika toppar används med fasta positioner och fasta linjebredder (6,2 0,1 respektive 5,0 0,1 ppm) (Fig. S4-höger kolumn). Vi kan inte hävda att denna breda signal endast består av två toppar som motsvarar två distinkta protonmiljöer, men den består förmodligen av en bred fördelning av kemiska miljöer som leder till en fördelning av NMR-kemiska skift. Följaktligen Fig. 3A visar de fyra topparna som användes för att analysera de 31P-filtrerade 1H ssnmr-spektra av benmineral för varje tcp2-värden: (i) en sammansatt topp centrerad vid Kubi (1h) = 0,0(lila) och en enda topp centrerad vid Kubi (1h) = 5,2 (grå) ppm som båda kännetecknas av en relativt långsam och enhetlig tillväxt av deras magnetiseringar; och(ii) två toppar vid Kubi (1h) = 9,8 (blå) och 14,0 (grön) ppm båda visar dipolära svängningar (Fig. 3B). När det gäller dessa två senare toppar, den exakta matchningen av Hartmann-Hahn (H-H) profil (Fig. S2) möjliggör numerisk modellering av CP-uppbyggnadskurvorna enligt single spin pair-modellen som redovisar dipolära svängningar som härrör från koherent polarisationsöverföring och effekten av 1H spin diffusion57:

$${\rm{m}}({\rm{t}})={{\rm{m}}}_{0}.\exp ( – \, {{\rm{t}}} _ {{\rm{CP}}}/{{\rm{t}}} _ {1{\rm{\rho }}}({}^{{\rm{1}}}{\rm{H}})). och hydroxyljoner position i F1 har summerats. (C) 1D 31P CP mas ssnmr-spektrum (tCP = 1000 CBS) av ett syntetiskt oktakalciumfosfat (OCP) prov. P1 till P6 motsvarar de sex olika fosfatgrupperna som finns i OCP-kristallgitteret enligt Davies et al.60. Den röda streckade linjen markerar den mest intensiva resonansen i OCP-signalen som inte detekteras i benmineral (B).

kvantifiering av HPO4 2− joner i benmineral

kvantifieringen av de HPO42− joner som finns i benmineral genomfördes. För detta ändamål lineshape och linewidth av de individuella 31P NMR-signalerna från OH-och PO43-innehållande intern kristallin kärna och H2O och HPO42-innehållande icke-apatitiska miljöer (amorft ytskikt) som avslöjades i Fig. 4B, användes vid montering av det kvantitativa 31P single pulse (SP) mas ssNMR-spektrumet av ett nytt 2-årigt fårbenvävnadsprov (Fig. 5A). Den molära procentandelen av HPO42 – och PO43− joner i benmineral befanns vara cirka 50/50 ml 5%. Som föreslagits av våra observationer i Fig S9 och S10 gjordes denna beräkning förutsatt att den molära andelen HPO42− joner i partiklarnas inre kristallina kärna var nära 0%. En sådan hög molar andel HPO42-joner närvarande i det amorfa ytskiktet återspeglar den lilla storleken på benmineralpartiklar: 1-5 nm i tjocklek, 10-40 nm i bredd och 20-100 nm i längd1, 61,62,63. Eftersom vi visade att HPO42-jonerna är koncentrerade i det amorfa ytskiktet, kan vi nu uppskatta den genomsnittliga tjockleken på detta lager för ett 2-årigt fårbenvävnadsprov. Här betraktar vi en nanosiserad blodplätt med en tjocklek av 4,0 nm, och vi antar att densiteterna hos fosfatatomer närvarande i hydroxiapatitens kristallgitter och i det amorfa ytskiktet är ekvivalenta. I ett sådant scenario är tjockleken på den inre kristallina kärnan cirka 2,4 nm (dvs., vilket är ungefär dubbelt så stor som den hexagonala enhetscellen av hydroxiapatit64 längs de kristallografiska axlarna A och b; A = b = 0,94 nm); medan tjockleken på det yttre amorfa ytskiktet kan uppskattas vara cirka 0,8 nm (dvs vilket motsvarar storleken på den hexagonala enhetscellen av hydroxiapatit längs a och b, och därmed motsvarar staplingen av endast två fosfatjoner). Man bör vara medveten om att dessa är medelvärden som motsvarar summan av bidragen från alla oorganiska fosfatjoner som finns i vårt 2-åriga fårbenvävnadsprov. Dessa resultat kan vara olika för äldre exemplar där andelen icke-apatitiska miljöer kan vara mindre65 på grund av benmineralmognad: den progressiva omvandlingen av det amorfa ytskiktet till apatitiska miljöer15. Ändå är tjockleken på ytskiktet som bestäms här (0,8 nm) i god överensstämmelse med de uppskattade storlekarna som föreslagits i vissa tidigare studier: ungefär storleken på en fosfatenhet i fluorapatit-gelatin mesokristaller66; och cirka 1-2 nm i syntetiska hydroxiapatiter32,67,68.

Figur 5
figure5

kvantifiering av Hpo42− och CO32− joner närvarande i benmineral. (A) kvantitativt 31P single pulse (SP) magic angle spinning (MAS) solid-state kärnmagnetisk resonans (ssNMR) spektrum av ett nytt 2-årigt fårbenvävnadsprov (blå linje) och dess motsvarande montering (röd streckad linje) med två toppar. Dessa två toppar, vars linjeform och linjebredd avslöjades i Fig. 4B, motsvarar PO43-innehållande inre kristallin kärna i form av hydroxiapatit (orange topp) och HPO42-innehållande icke-apatitiska miljöer i form av ett amorft ytskikt (lila topp). (B) Fourier Transform-infrarött(FT-IR) spektrum av vibrationsläget för vibrationsläget för vibrationsläget för en 2-årig fårbenvävnadsprov (blå linje) och dess motsvarande montering (röd streckad linje). Typ B CO32-joner upptar PO43-platserna inom hydroxiapatitens kristallgitter; typ A CO32-joner upptar OH-platserna inom hydroxiapatitens kristallgitter; medan icke-apatitisk CO32-finns i det amorfa ytskiktet som täcker benmineralpartiklar.

uppdatering av benmineralkemisk sammansättning

resultaten som presenteras här och annat45 tyder på att den genomsnittliga kemiska sammansättningen av moget kortikalt benmineral som föreslagits av Legros et al.27, CA8.3 1,7(PO4)4,3(HPO4 eller CO3)1,7(OH eller CO3)0,3 1,7, måste omprövas. Faktum är att denna formel inte bara ignorerar närvaron av det amorfa ytskiktet vars kemiska sammansättning varierar kraftigt med avseende på de apatitiska miljöer som finns i partiklarnas inre kristallina kärna, men underskattar också den molära andelen HPO42− joner. För att föreslå en uppdaterad formel för vårt 2-åriga fårbenvävnadsprov behövde vi först bestämma viktandelen CO32-joner. Ett värde på 4,8% med ett stort bidrag i karbonater av B-typ hittades genom FT-IR-analyser49 (Fig. 5B), vilket överensstämmer med de värden som finns för andra benmineralprover3. Dessutom beaktades följande parametrar: (i) partiklarna måste förbli elektriskt neutrala (både den inre kristallina kärnan och det amorfa ytskiktet); (ii) den molära andelen HPO42− joner i förhållande till den totala mängden oorganiska fosfatjoner begränsas nära 50% enligt föreliggande studie; (iii) graden av karbonering bör vara nära experimentvärdet (4,8% w/w); (iv) det totala Ca/(P + C) molära förhållandet bör förbli acceptabelt för ett benvävnadsprov, i.e.i intervallet 1,2–1,53 och, sist, (v) andelen A-typ, B-typ och icke-apatitiska karbonatjoner som finns i det amorfa ytskiktet bör förbli i enlighet med FT-IR-data. När alla dessa begränsningar har sammanslagits kan den genomsnittliga kemiska sammansättningen av det mogna kortikala benmineralet från vårt 2-åriga fårbenvävnadsprov approximeras enligt följande: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Man bör notera att denna genomsnittliga kemiska sammansättning endast motsvarar vårt specifika benvävnadsprov enligt våra egna experimentella resultat. Därför är denna formel inte universell eftersom variabilitet förekommer bland benprover beroende på arten, åldern, matförsörjningen och deras mognadsgrad.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras. Obligatoriska fält är märkta *