Introdução

Familiares de Vários Lipomatosis (FML, OMIM% 151,900) é uma rara desordem autossômica dominante da hipoderme, caracterizada pelo desenvolvimento do bem-encapsulado nódulos subcutâneos nas extremidades e tronco.1 primeiros relatos de múltiplos tumores adipocíticos foram feitos desde 1846 por Sir Benjamin Brodie.2 resultados posteriores de Blaschko (1891), e Alsberg (1892) demonstraram uma recorrência familiar das lesões e observaram um aumento da incidência entre os homens.1,3,4 Nos anos seguintes, muitos outros autores publicados famílias com características altamente sugestivos da FML,1,5,6 e, finalmente, em 1970, Das Gupta classificados lipomatous tumores em três categorias: solitário ou esporádica, FML e Vários Simétrica Lipomatosis (MSL).Os lipomas Solitários são considerados a neoplasia benigna mais comum dos tecidos moles em adultos, mas múltiplos lipomas ocorrem em 5% dos indivíduos.9, 10 a prevalência exata de LML é desconhecida, mas foi estimada em 0,002%.8,11,12 Idade de início dos nódulos é entre 30 e 40 anos, atingindo o pico máximo na década de 50.6,8,13,14 tem sido amplamente difundida de que este transtorno exibem uma preferência para o sexo masculino, no entanto, um grande número de trabalhos demonstram que ambos os sexos são igualmente afetados.15-17 embora seja considerada uma doença benigna, preocupações cosméticas podem aparecer em alguns indivíduos, prejudicando a sua qualidade de vida. Além disso, é também prevalente em indivíduos obesos.9

até agora, a pesquisa Disponível em FML tem sido explicitamente focada em aspectos clínicos, e questões moleculares geralmente não são investigadas. A literatura sugere que pelo menos 70% dos lipomas esporádicos resultam de rearranjos citogenéticos envolvendo a faixa 12q13-15, o que poderia levar a uma expressão desregulada do gene HMGA2 (grupo de alta mobilidade AT-hook 2). Este gene codifica proteínas cromatínicas não-histonas responsáveis por alterações conformacionais do ADN, proliferação celular aberrante e desenvolvimento de tumores mesencimais benignos.18-20

reconhecendo a base molecular das condições genéticas e a implementação de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento permitiu explorar e elucidar outros mecanismos envolvidos na etiologia de várias genodermatoses. Portanto, este estudo teve como objetivo realizar uma caracterização clínica e molecular de sete indivíduos com LMF para detectar variantes em seis genes candidatos relacionados à lipomatose usando técnicas de Sanger e sequenciamento de próxima geração (NGS).esta investigação foi realizada em conformidade com os princípios da Declaração de Helsínquia. A aprovação foi obtida do Conselho de revisão Institucional antes do estudo (o Comitê de Ética em pesquisa da FCM-UNICAMP, arquivo n ° 1.313.164) e todos os participantes deram consentimento informado por escrito. Realizamos o estudo na clínica ambulatorial do serviço de Genética Médica no Hospital Clínico da Universidade de Campinas (HC-UNICAMP), em São Paulo, Brasil. Um total de sete indivíduos pertencentes a cinco famílias não relacionadas (nomeados de A A E) eram elegíveis. Os critérios primários de inclusão para a seleção dos indivíduos foram os seguintes: i) idade acima de 18 anos, ii) diagnóstico clínico e histopatológico de lipoma ou angiolipoma e iii) recorrência familiar sugerindo herança autossómica dominante. Os principais aspectos clínicos foram recolhidos a partir de registros médicos usando uma forma estruturada. A avaliação física envolveu a participação de especialistas dermatologistas e geneticistas. O Departamento de patologia da HC-UNICAMP forneceu os espécimes histopatológicos. Os resultados clínicos estão detalhados na Tabela 1.

Tabela 1 Clínico Resumo dos Pacientes com FML

Sanger Seqüenciamento do Gene HMGA2

o DNA Genômico foi extraído a partir de periférico em EDTA amostras de sangue de sete pacientes de acordo com o convencional fenol-clorofórmio procedimento utilizado por Sambrook et al21

Uma reação em cadeia de polimerase (PCR) foi realizada para amplificar cinco éxons codificantes e intron-junções éxon regiões do HMGA2 gene. Usando duas ferramentas bioinformáticas online, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm), e OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), nós projetamos o par específico de iniciadores, como resumido na Tabela 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) seguindo as instruções do fabricante. Os cromatogramas foram examinados utilizando cromatos v. 2. 6. 5. Os resultados foram comparados com o Hmga2 Ensembl número ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Nós verificamos o romance variantes em três conjuntos de dados públicos: i) A Aliança Global para a Genômica e Saúde (GA4GH) Farol de rede (https://beacon-network.org/#/), ii) O Exome Agregação de Consórcio (http://exac.broadinstitute.org/) e, iii) Arquivo Online Brasileiro Mutações (http://abraom.ib.usp.br/). Para avaliar as pontuações de patogenicidade e os efeitos de danos de novas variantes no gene candidato HMGA2, utilizamos diferentes modelos de previsão sílica como VEP (preditor de efeito variante),22 FATHMM (Análise Funcional através de modelos ocultos Markov),23 UMD-preditor,24 SIFT (triagem intolerante à tolerância),25 PROVEAN (Analisador de Efeito de variação proteica),26 e provador de mutação.Foi realizado um painel personalizado para avaliar os genes envolvidos na lipomatose sindrómica. Para realizar esta técnica, obtivemos ADN genómico a partir de amostras de saliva de cinco doentes (a, B, C, D e e) utilizando o kit de auto-colecção de ADN Oragene® (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontário, Canadá). As amostras foram então enriquecidas e hibridizadas contra sequências específicas do alvo. A captura foi feita usando o sequenciador Illumina® MiSeq (captura de TruSeq) de próxima geração em modo emparelhado 150bp de acordo com o protocolo padrão para esta plataforma. A profundidade de cobertura das regiões-alvo foi superior a 50x. o enriquecimento e a análise centraram-se nas sequências de codificação de cinco transcrições (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038. 5, MEN1 NM_130799. 2, PIK3CA NM_006218.2, and PTEN NM_000314.4), 10bp de sequências intrónicas e outras regiões presumivelmente causadoras de doença. Durante o inquérito, foram igualmente consideradas supressões exónicas, duplicações e variações no local de fusão. As leituras foram alinhadas e comparadas com a referência do genoma humano (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) was chosen to validate variants as mentioned by Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

disponibilidade de dados

sequências foram submetidas ao GenBank (número de adesão: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Os conjuntos de dados relacionados com este artigo estão disponíveis no Instituto Europeu de Bioinformática EMBL-EBI através do repositório ENA com o número de adesão ao estudo PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

resultados

análise clínica

sete indivíduos de cinco famílias não relacionadas (A, B1, B2, C, D1, D2 e E) foram incluídos, como representado na Figura 1. Não identificamos a consanguinidade parental entre os participantes. A origem étnica foi auto-relatada como misturada por cada proband. Numa perspectiva geral, observou-se que as famílias a e B tinham três gerações sucessivas ou mais envolvidas. A relação entre homens e mulheres foi estimada em 1:6. A Idade Média na inclusão foi de 42 anos (DP 11, 8), enquanto que a idade média de início das lesões foi de 28 anos (DP 11, 8). As fêmeas relataram uma incidência máxima de nódulos após a gravidez. As características clínicas clássicas da LME incluíram nódulos moles altamente variáveis em número e tamanho, localizados na gordura subcutânea e confinados ao tronco e extremidades, como descrito na Figura 2. O desconforto e a sensibilidade marcada à palpação foram observados apenas em indivíduos A. distúrbios gastrointestinais Co-mórbidos estavam presentes em doentes a, C e D2. Relataram diverticulite e pólipos, obstipação crónica grave e cancro colorectal, respectivamente. Quatro doentes apresentaram avaliação histológica das lesões subcutâneas. A presença de adipócitos maduros arredondados por numerosos Capilares confirmou o diagnóstico de angiolipoma, tal como referenciado por Bancroft e Fletcher et al10,28 (Figura 2). O quadro 1 apresenta outras conclusões relevantes.

a Figura 1 Visão geral da linhagem das famílias estudadas (A–E). Observe como as fêmeas e os machos estão igualmente envolvidos e o padrão hereditário dominante autossômico com quase duas gerações sucessivas afetadas. A família a teve o maior número de gerações desenvolvendo vários lipomas (a). O proband a (III 2) foi o único dentro de seu grupo familiar e na casuística em referir a dor quando foi examinado (a). As setas indicam as varandas.

Figura 2 características Clínicas da FML e histopatológica aspectos de lipomas (ELE mancha (10×). Os achados primários incluem nódulos moles, móveis e circunscritos indolor, localizados na gordura subcutânea. A distribuição topográfica mais comum compreende os membros superiores (a, B E D), parede abdominal anterior, costas e coxas (C). Lipoma geralmente apresenta um padrão lobulado de adipócitos brancos com núcleos uniformes e uma cápsula fibrosa fina (E). Angiolipomas são compostos de gordura madura em associação com numerosos vasos sanguíneos pequenos, que são predominantemente Capilares. Trombos fibrina (flechas) é muito comum (F). Imagens cortesia do Departamento de patologia e Genética Médica, Escola de Ciências Médicas, UNICAMP.

Molecular

Sanger seqüenciamento revelou dois novela variantes no éxon 5 do gene HMGA2. Ambas as variantes foram identificadas nos doentes A E B1. O primeiro foi uma variante heterozigótica sinônimo C. 327C>t p.(Asp=) considerado como um impacto baixo ou neutro, baseado em várias ferramentas de previsão (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). Em contraste, a segunda alteração foi um absurdo alterar heterozigotos variante c.328T>C (p.*110Glnext*16) o que faz com que um codão stop substituição por glutamina, aminoácido e o subsequente alargamento do final de proteína (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). A figura 3 esquematiza a estrutura do gene HMGA2, os domínios de ligação às proteínas e as novas variantes.

Figura 3 Estrutura do ser humano gene HMGA2. A) Localizado em 12q14. 3, o gene HMGA2 abrange mais de 140 kb e abrange cinco exons. Exon 1, 2 e 3 (caixas azuis) codificam para um domínio em gancho (círculos azuis). O quarto exon (lilás) codifica para uma região de espaçador. Exon 5 (caixa rosa)codifica o domínio C-terminal da proteína de 109 aminoácidos. B) Electroferograma dos doentes A, B1 e referência. Duas variantes novas idênticas foram encontradas nestes pacientes. Um sinônimo de heterozigotos variante c.327C>T (p.Asp=) e um sem parar de alterar heterozigotos variante c.328T>C (p.*110Glnext*16).

A variante c.328T>C (p.*110Glnext*16) foi definido como 100% de patogênicos ou de alto impacto, de acordo com a mencionada in silico algoritmos. No entanto, o sistema de predição do provador de mutação demonstrou uma discrepância entre as duas variantes descritas, como mostrado na Tabela 3. O painel multi-gene alvo de AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA e PTEN nas famílias a, B, C, D E E, não detectou alterações deletérias nas sequências avaliadas.

Tabela 3 Variantes Encontradas em Indivíduos A e B1, e uma Comparação Entre a Previsão de Ferramentas

Discussão

O atual estudo pretendeu identificar as bases moleculares da FML, através da integração das modernas técnicas de sequenciamento, como o sequenciamento Sanger e NGS, combinadas com a tradicional clínica abordagens.após estudos anteriores, a presente pesquisa mostra algumas divergências em relação aos dados epidemiológicos. Observamos que há um equívoco comum sobre a classificação e diagnóstico de diferentes tipos de lipomatose.7,10,15 vários autores enfatizam que os homens têm uma alta tendência para apresentar múltiplos lipomas,11,29,30 no entanto, nossos resultados mostram uma aparente alta frequência de FML nas mulheres. É possível que este achado apenas reflete um viés de seleção devido ao pequeno tamanho da amostra, ou também pode ser explicado pelo fato de que as mulheres são mais propensos a procurar cuidados médicos de saúde por causa de preocupações cosméticas.31 no Entanto, a linhagem indicam que a proporção de indivíduos afetados em ambos os sexos foi semelhante, levando a uma proporção de cerca de 1:1 (10 homens vs 13 mulheres), o que pode subestimar a verdadeira prevalência da FML.6,8,16 curiosamente, o número total de lipomas observados nas mulheres foi maior em comparação com o único homem examinado.Factores como o excesso de peso e o crescimento exacerbado dos nódulos durante e após a gravidez sugerem que factores exógenos (dieta), alterações metabólicas (dislipidemia ou alterações na desaturação de ácidos gordos) e mecanismos hormonais podem estar envolvidos na hiperplasia dos adipócitos.32,33 Yee et al compararam as diferenças na desaturação enzimática do estearoil-CoA entre indivíduos com doenças raras da adipose (RAD) e grupo de controlo obeso e concluíram que os indivíduos com LML e obesidade apresentaram as maiores taxas de desaturação, aumentando assim o processo de lipogénese.32,34

um achado inesperado foi que o paciente A foi o único dentro do grupo casuístico e de sua família a manifestar dor, fraqueza diária, fadiga e comorbidade psiquiátrica (depressão crônica e transtorno de ansiedade). Estes sintomas estão fortemente associados com a doença de Dercum, que é considerado um diagnóstico diferencial ou uma variante de FML.35 com base na nova classificação da doença de Dercum proposta por Hansson et al,36 identificamos neste paciente a forma nodular generalizada, caracterizada por dor intensa na superfície do tecido adiposo e em torno de lipomas. Outro estudo que apoia esta hipótese foi publicado por Campen et al37 que descreveram uma família de nove membros diagnosticados com múltiplos lipomas que apresentaram sintomas variáveis variou de incapacidade total a nódulos assintomáticos. It can, therefore, be assumed that the segregation follows an autosomal dominant pattern with variable expressivity and possibly represents an extreme manifestation of FML.no que se refere ao diagnóstico histopatológico, foram evidenciados dois tipos principais: lipoma e angiolipoma. Microscopicamente, a característica mais comum do angiolipoma é a proliferação de vasos sanguíneos finos que contêm microtrombi fibrina em associação com adipócitos maduros.10. 28 Angiolipomas parecem ter uma elevada incidência em homens adultos jovens que ocasionalmente manifestam dor ou ternura ligeira. Este tipo de tumor também está relacionado com a história de trauma local ou o uso de terapia com esteróides.13,38 embora muitos autores reconheçam ambos os diagnósticos como diferentes entidades patológicas, alguns relatórios de casos não fazem essa distinção devido a diferenças muito sutis entre eles.39 neste contexto, nossa análise confirma que é possível ter angiolipomas com recorrência familiar e este diagnóstico pode ser parte do amplo espectro de FML.40-43 além disso, vários lipomas de células Fuso, outro tipo de lipoma, também foi relatado em várias famílias.Embora existam vários estudos centrados na expressão e análise citogenética directa em lipomas esporádicos, poucos estudos têm estado preocupados com as causas constitucionais da LML.2 extensas séries de lipomas em adultos confirmam rearranjos estruturais múltiplos com frequências que variam de 50 a 75%.Entre as alterações cromossômicas equilibradas, a translocação t(3; 12)(q27-28; q13-15) é observada em quase 25% dos tumores.9 na maioria dos casos, o ponto de paragem afecta o gene HMGA2, que é composto por 5 exões e gera uma proteína de 109 aminoácidos (Figura 3).18,46,47 Ligon et al relataram o caso de um menino de oito anos com um rearranjo constitucional afetando a banda 12q14.3 (inversão pericêntrica de novo) assim, envolvendo o gene HMGA2. No entanto, o fenótipo clínico caracterizado pelo crescimento somático, o avanço da idade óssea e Dentária, tumor cerebelar,e múltiplos lipomas, 48 difere da nossa casuística.

foram analisados os heterozigotos variantes c.327C>T, p.(Asp=) e c.328T>C (p.*110Glnext*16) do éxon 5 do gene HMGA2 em diversas previsão de programas. A alteração sinónima ou silenciosa foi interpretada como benigna, enquanto que a alteração no codão de paragem de tradução foi considerada como 100% patogênica ou de alto impacto. Desta forma, pode indicar que alterações envolvendo a região 3ʹ UTR (não traduzida) desencadeariam a transformação neoplásica do gene HMGA2.49 Fusco et al destacou o papel crucial do gene HMGA2 em tumores mesencimais. Eles propuseram que no gene HMGA2, a região 3ʹ UTR é geralmente silenciada por Let-7 miRNA e qualquer alteração a este nível, seja truncação ou fusão com sequências ectópicas, conduz à sua regulação e, consequentemente, a uma replicação anormal de células.46

é um pouco surpreendente que na família B tenhamos detectado ambas as novas variantes apenas na mãe (B1). Pode indicar que eles não se segregam com fenótipo FML, sendo descartados pelo menos nesta família como uma causa etiológica. Por outro lado, o paciente a apresentou as mesmas duas novas variantes, mas demonstrou um fenótipo altamente sugestivo da doença de Dercum. Apesar destes resultados promissores, eles são um pouco difíceis de interpretar, porque não foi possível avaliar outros parentes afetados com FML.infiltração focal de gordura e múltiplos lipomas podem estar presentes em várias síndromes. Síndrome de Proteus e cravo-da-Índia (crescimento assimétrico Lipomatoso congénito, malformações vasculares, nevi epidérmica, anomalias esqueléticas e espinal) são exemplos de mutações somáticas em que a lipomatose está presente.50,51 por outro lado, síndrome de Bannayan-Riley-Rubacalva, Neoplasia endócrina Múltipla Tipo 1, síndrome de Cowden e síndrome de Gardner são Condições resultantes de mutações germinais que têm lipomatose concomitante.52-55 mesmo algumas mutações envolvendo a função mitocondrial estão relacionadas com o crescimento anormal do tecido adiposo principalmente no tronco e pescoço superiores e o melhor exemplo é a doença Madelung.56 No entanto, o painel negativo de AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA e PTEN exclui que eles são responsáveis pelo fenótipo FML, pelo menos nesta pesquisa.

conclusão

FML é uma doença rara e heterogénea que pode estar a sobrepor-se a outras síndromes dermatológicas como a doença de Dercum. A história natural da FML nesta série revelou que o desenvolvimento de lesões foi progressivo e atingiu a sua maior incidência em indivíduos de meia-idade. FML afetou ambos os sexos e apresentou uma distribuição topográfica com predominância nas extremidades e tronco. A relação sexual entre os pacientes avaliados mostrou uma prevalência feminina, mas os dados genealógicos mostraram uma distribuição mais equilibrada. O diagnóstico da doença de Dercum também foi reconhecido em um indivíduo (paciente a).

a abordagem molecular tem proporcionado uma visão mais aprofundada sobre a base genética da FML e tem tentado investigar cuidadosamente o maior número de genes candidatos ligados a ela. Destacamos a utilidade da NGS, além do método Sanger na compreensão de todo o espectro de FML, pois pode oferecer uma alternativa para a identificação etiologia e caracterização de raras condições genéticas em ambientes clínicos. Variantes em exon 5 do gene HMGA2 não foram descritas, e até agora, eles têm um significado incerto na gênese do FML. Outros estudos, incluindo um número mais significativo de indivíduos afetados e análise funcional das novas variantes do gene HGMA2, devem ser realizados para determinar sua função biológica em FML melhor.