実験設計とサンプル収集

1982年に中国の安徽省孟城県(北緯33度13分、東経116度35分、標高42m)で、典型的な石灰コンクリートの黒色土を用いて実験が行われた。 年間気温は14.8℃、年間降水量は872mmである。 (1)コントロール、非施肥;(2)npk、尿素(180kg N ha-1年-1)、過リン酸塩(90kg P2O5ha−1年−1)および塩化カリウム(86kg K2O ha−1y−1)を含むNPK化学肥料;(3)NPK+WS、NPK化学肥料プラス7500kg小麦わらha−1年−1;（4）npk+pm、npk化学肥料プラス15,000キロ新鮮な豚の肥料ha−1年−1; （5）NPK+CM、NPK化学肥料プラス30,000キロ新鮮な牛の肥料ha−1年−1。 ＮＰＫ＋ＷＳ処理では，すべての小麦わらを圃場に戻し，ｎｐｋ＋ＰＭ処理での豚糞尿とｎｐｋ＋ＣＭでの牛糞尿は，添加した小麦わらと同様の有機炭素量を有していた。 さらに、私達の受精の処置に含まれているこれらの対照的なタイプの肥料に不安定な（ブタの肥料）からのより反抗的な（ムギのわらおよび牛肥料）への植物 私達は私達の結果を代表し、対照的な管理慣行に適当にさせることを向けて受精の処置の広い範囲を使用しました。

根系をできるだけ無傷に保つために、小麦群（2017年4月20日の小麦充填段階で30-40個の小麦植物を含む）の周りを掘りました。 根にしっかりと付着した根圏土壌をブラシした。 同時に、表土（深さ0-15cm）は、オージェコラー（植物から約20cm離れた）を使用してバルク土壌として収集された。 収集した土壌を2mmのメッシュで篩い分けし、根や石などの不純物を除去しました。 土壌の一部は化学分析のために4℃で貯蔵され、残りはDNA抽出のために−40℃で貯蔵された。土壌物理化学分析

pH計（FE20FiveEasy™、Mettler Toledo、Germany）を使用して、土壌と蒸留水の比1：5（重量/体積）で土壌のpHを測定しました。

土壌物理化学分析

土壌物理化学分析

土壌物理化学分析

土壌物理化学分析

土壌物理化学分析 土壌水分は、約105〜108℃で新鮮な土壌5gを乾燥させて一定の重量に達するようにし、次いで重量比（蒸発水と乾燥土壌）を計算することによって重量測定 土壌の全炭素（Ｔ ｃ）および全窒素（Ｔ ｎ）含有量を、ＣＮＳ−２ ０ ０ ０分析装置（ＬＥＣＯ，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＩ，ＵＳＡ）を使用して空気乾燥した土壌の燃焼によって、土壌を０． 土壌の総リン（TP）および総カリウム（TK）含量は、HF-Hclo4消化後に抽出され、それぞれモリブデンブルー法および火炎分光光度法（FP640、INASA、中国）を用いて測定された。 ２μ ｍの細孔空間を有するＧ４ガラス繊維フィルター（Ｆｉｓｈｅｒ）を介して真空濾過し、抽出物中の炭素含有量をｔｏｔａｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｒｂｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（ｍｕｌｔｉ Ｎ／Ｃ３ ０ ０ ０，Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。 硝酸塩（ＮＯ３−Ｎ）、アンモニウム（Ｎ Ｈ４＋−Ｎ）、および溶解した全窒素（ＤＴ Ｎ）を、新鮮な土壌５ｇと２Ｍ Ｋｃｌ５ ０ｍｌとの比で抽出した。 ２μ ｍ（Ｆｉｓｈｅｒ）の細孔空間を有するＧ４ガラス繊維フィルターを通して抽出物を濾過し、次いで、連続流分析システム（Ｓａｎ＋＋ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｋａｌａｒ、Ｈｏｌｌａｎｄ）を使用して、ＮＯ３−Ｎ、Ｎ Ｈ４＋−Ｎ、およ 溶解した有機窒素（ＤＯＮ）は、以下の式：ＤＯＮ＝ＤＴＮ−Ｎ Ｈ４＋−Ｎ−ＮＯ３−Ｎを使用して計算した。5M Nahco3をモリブデンブルー法を用いて測定した。 入手可能なカリウム（Ａ Ｋ）を、１Ｍ酢酸アンモニウムにより抽出し、火炎光度計（ＦＰ６ ４ ０、ＩＮＡＳＡ、Ｃｈｉｎａ）により測定した（追加ファイル３：付録１）。

窒素固定速度の測定

15N2標識法は、N固定速度を測定するために使用される最も一般的で広く適用されている方法の一つです。 五グラムの土壌を18×150mm Balchチューブに入れ、ヘッドスペースを80％の15N2および20％のO2を含む合成空気に置き換えた。 対照は、標識されていないＮ２ガスで満たされ、並行して処理された。 チューブを暗所で２ ２日間室温で水平にインキュベートした。 土壌試料の原子％１ ５Ｎを、安定同位体比質量分析計（Ｆｌａｓｈ２ ０ ０ ０Ｈ Ｔ／Ｃｏｎｆｌｏ ＩＶ／Ｄｅｌｔａ Ｖ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。 次に、対照に対する15N2を受けている土壌における総15Nの差を比較することによって、正味電位N固定率を計算した。

ハイスループットシーケンシングとバイオインフォマティクス分析

DNA抽出のために、0。５ｇの新鮮な土壌を、Ｆａｓｔ ＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）と共に使用した。 プライマー対ＮＩＦＨ−Ｆ／ＮＩＦＨ−Ｒ（５’−Ａ Ａ Ａ ＧＧＹＧＧＷＡＴＣＧＧＹＡＡＲＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’）／（５’−ＴＴＧＴＴＳＧＣＳＧＣＲＴＡＣＡＴＳＧＣＣＡＴＣＡＴ−３’）を使用して、ＮＩＦＨ遺伝子を増幅した。 ＰＣＲ反応は、４μ ｌの５×ＦＡＳＴＰＦＵ緩衝液、２μ ｌの２.５ｍ Ｍ ｄＮＴＰ、０.８μ ｌの５μ Ｍ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０.８μ ｌの５μ Ｍ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、０.４μ ｌのＦＡＳＴＰＦＵ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１ ０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および二重蒸留水（ＤＤＨ２Ｏ）を含む２ ０μ ｌの反応で行った。 増幅は、９ ５℃で３分間、９ ５℃で３ ０秒、５ ５℃で３ ０秒、および７ ２℃で４ ５秒の３ ５サイクル、および７ ２℃で１ ０分間延長して、９ ５℃で３分間実施した。 ＰＣＲアンプリコンを、Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）により精製し、各試料について三重ＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物としてプールした後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ ＰＥ３ ０ ０（Ｍａｊｏｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｈａｎｇｈｉａｎ，Ｃｈｉｎａ））のプラットフォー 配列決定後、ＮＩＦＨヌクレオチド配列を、ＱＩＩＭＥ−１.９.１パイプライン（<20を持つもの）を除去し、残りの配列をさらにリボソームデータベースプロジェクトのFunGeneパイプラインを使用してアミノ酸配列に変換した。 NifHタンパク質配列と一致しなかったか、または終端コドンを含むタンパク質をコードする配列は廃棄された。 残りの配列は、失敗したキメラ配列とキメラ配列の両方を除去し、nifH遺伝子データベースに対して整列させた。 残りの高品質の配列は、de novoモードで実行されているUCLUSTと95％の類似性で操作分類単位（Otu）にクラスタ化され、すべてのシングルトンOtuが削除されました。

共発生ネットワーク解析

我々は、すべてのサンプル（根圏とバルク土壌）と共発生ネットワークを構築し、強く関連するOTUsの主な生態学的クラスター コミュニティ全体の相対的な豊富さの80％以上を占めるトップOtuが選択されました。 Otu間のすべてのペアwisedスピアマン相関が計算され、0.65未満のスピアマン係数と0.01以上のP値との相関が削除されました。 これにより、私たちは強く共起し、互いに相互作用する可能性が高いOtuにのみ焦点を当てることができました。 ネットワーク内の主なモジュール（生態学的クラスター）は、Gephi（https://gephi.org/）を使用して視覚化されました。 各生態学的クラスターの相対的存在量は、それに属する種の標準化された相対的存在量（zスコア）を平均化することによって計算された（追加ファイル3: 付録3）。

統計分析

ANOVAおよびペアワイズt検定を使用して、土壌変数、支配的な微生物分類群、および異なる受精処理間の微生物アルファ多様性を比較 これらのテストはSPSS21を使用して実装されました。 マンテル試験は、ジアゾトロフィーコミュニティと物理化学的性質との間の相関を分析するために使用された（追加ファイル3：付録2）。 これは、R×32(3.2.2)の「vegan」パッケージを使用して実行しました。 主座標解析（PCoA）は、サンプリンググループ（追加ファイル3：付録2）間のジアゾトロフィーコミュニティの有意な違いを見つけるために使用されました。 PCoAは、”labdsv”パッケージR×32(3.2.2)(http://cran.stat.sfu.ca/)を使用して実行しました。

系統解析

nifH遺伝子は、生態学的研究において十分な系統発生分解能を提供する。 生態学的クラスターにおける481支配的なジアゾトロフィーフィロタイプの系統樹は、FastTreeを使用して構築され、GraPhlAnを使用して可視化されました。 系統発生サンプリング理論を解析的に用いて（系統樹からのランダムサンプリングを地域社会における予測された系統発生多様性と仮定し、観測された系統発生多様性をそれらの予測と比較する）、ジアゾトロフィーコミュニティがランダム（−2と+2の間）、過剰分散（+2の上）、またはクラスター化（-2の下）に現れる程度を決定することができる。 系統発生サンプリング理論はＲパッケージ”ｐｉｃａｎｔｅ”を用いて行った。 地域系統樹を無作為にサンプリングする利点は、二項サンプリングモデルに基づいて不等サイズのサンプルを比較するために使用できることです。 観察された系統発生の多様性と予想される系統発生の多様性の違いは、各生態学的クラスターのzスコアを計算し、比較することによって決定された。 観察された系統発生の多様性が予想される多様性（以下−2）よりも小さい場合、生態学的クラスター内の微生物群集は系統発生的にクラスター化されていると考えられ、密接に関連する分類群が環境によってサンプリングされ、積極的に選択される可能性が高いことを意味する。ＳＥＭは、ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ａｍｏｓ２ １（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ：Ａｍｏｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施した。 Ｎ固定率に及ぼす土壌物理化学的性質と主要な生態学的クラスターの相対的存在量の直接的および間接的影響を評価するために使用した。 土壌の物理化学的性質は土壌ｐ ｈ，全炭素，全窒素および全りんを含んでいた。 モデルでは、処置（対照、ＮＰＫ、ＮＰＫ＋ＷＳ、ＮＰＫ＋ＰＭ、およびＮＰＫ＋ＣＭ）は、２つのレベル：１（特定の処置）および０（残りの考慮された処置）を有するカテゴリー変数であった。 さらに、ブートストラップを使用して、いくつかの変数が正規分布していないため、パス係数がゼロと異なる確率をテストしました。 また，ｓｅｍの解釈を助けるために，土壌特性，施肥処理，根圏効果の標準化された総効果（Ｓｔｅｓ）をＮ固定率に計算した。

ランダムフォレストモデリング解析

ランダムフォレスト回帰（Rパッケージ”randomForest”）は、異なる処理で正規化されたOtuを回帰するために使用されました。 10倍交差検証法は、N固定率に相関Otuの最適なセットを決定するために使用されました。 特徴の重要性スコアを報告したランダムな森林の順にOtuのランク付けされたリストは、アルゴリズムの100回の反復にわたって予測された窒素固定率の平均二乗誤差の増加に基づいて達成された。 50マーカー Otuは、10倍交差検証の五つの試行から得られた最小平均交差検証平均二乗誤差に基づいて選択されました。