はじめに

リアルタイムPCRを使用してマルチプレックスリアルタイムPCRのためのFRET-TaqManプローブの設計は、閉じた管形式でPCR産物の生成中にフルオロフォア蛍光の継続的なモニタリングを可能にする。 現在、利用可能な方法は、ＰＣＲ産物の増幅をモニターするために標識されたプローブまたはＤＮＡインターカレート色素のいずれかを利用する。 TaqManプローブは、フルオロフォアとクエンチャーを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、10-30塩基離れて配置されている。 TaqManプローブは、蛍光増加の結果、クエンチャーからフルオロフォアを分離Taqポリメラーゼの5′-3’二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ活性のために増幅中に加水分解 リアルタイムPCR機器には、蛍光検出器が装備されており、陽性反応のために、蛍光が背景蛍光よりも大きいサイクルであるサイクル閾値（Ct）を推定する しかしながら、この技術は、ＰＣＲが増幅阻害剤によって影響される場合には、真の陰性結果を偽陰性と区別することができない。 核酸抽出後、阻害剤は、臨床試料（例えば、ヘモグロビン）、環境試料（例えば、フミン酸およびフルボ酸）、および核酸抽出中に使用される化学物質（例えば、エタノール、洗剤、またはカオトロピック剤）から依然として存在し得ることが報告されている。 診断アッセイの信頼性は、PCR阻害剤の存在および影響を示すことができる内部対照核酸を含めることによって増加する（1,2）。 内部陽性対照（IPC）は、ターゲット配列アッセイに使用されるフルオロフォアとは異なる波長で光を放射する標識されたフルオロフォアを使用して、標的配列の存在下で同時に増幅され、リアルタイムPCR装置によって異なるチャネルで検出された二つのフルオロフォアを使用する。 PCRのために一般的に使用される内部対照は、プローブ領域を除いてアッセイ標的の配列と同様の配列を含むプラスミドである。 限られた数のIPC分子が個々のアッセイ標的に添加され、標的核酸と共増幅される。; 従って、正のＩＰＣシグナルは、増幅反応が非常に少量の標的核酸から正のシグナルを生成するのに十分に進行した証拠である。 この特徴は、ＩＰＣおよび標的核酸の同等の増幅を確実にするために重要である（３−９）。 ２およびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ２（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、Ｒｕｇｇｅｄｉｚｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｒ．）器械（アイダホの技術、ソルトレイクシティ、UT、米国）、および手持ち型の実時間PCRの器械は-一つの光源および準の放出チャネルがだけ装備されています。 これらのタイプの器械の多重型になることは複数の分類されたオリゴヌクレオチドおよび蛍光性共鳴エネルギー移動(FRET)の概念の使用を要求する。 しかし、ＦＲＥＴプローブは設計が困難であり、超可変領域および最適でない増幅条件が存在する場合にはロバスト性を欠く可能性がある。 FRETプローブを使用するには、2つのプローブに対して2つの領域を識別する必要があります。 ＦＲＥＴプローブシステムは，アクセプター色素の蛍光が第二プローブに付着したフルオロフォアの励起によって検出されるような方法で，二つの単一標識プローブのオリゴヌクレオチドの隣接ハイブリダイゼーションに依存している。 FRETプローブの主な欠点は、2-5ヌクレオチドのギャップを持つ二つの隣接するプローブを収容するために必要なより大きな配列領域の要件です。 Ｍｅｇａｓｔｏｋｅｓ ｄｙｅ（ＤＹＸＬ；Ｄｙｏｍｉｃｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＰｕｌｓａｒ６ ５ ０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．,Novato,CA,USA)が、これらのラベリングシステムは、チャネルのクロストークを補償するためにスペクトル情報を必要とし、広く利用可能ではありません。 しかし、本研究で開発されたFRET-TaqManプローブは、色補正ソフトウェアを必要とせず、広く利用可能なfluorophores（FAM、Cy5.5）を使用しています。 本報告書は、唯一の青色発光ダイオード（LED）励起源（470nm）と関連する三つの対応する検出チャネル（例えば、530nm、640nm、および705nm）を備えた機器で多重化を可能にするために三重標識プローブの設計に焦点を当てている。

材料と方法

プローブ設計原理

すべての実験は、アイダホテクノロジのR.A.P.I.D.システム、励起用の青色LED（470nm）とモノカラーアッセイ用の530、640、および705nmで蛍光を測定する関連する三つの蛍光検出チャネルを備えた32サンプルのポータブルリアルタイムPCR装置で行われた。 プライマー ＪＶＡＦおよびＪＶＡＲ（１ ０）ならびにプローブ５’−ＦＡＭ／ＢＨＱ−１を、ＣＤＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇ Ａ，ＵＳＡ）で合成し、プローブ５’ＦＡＭ−Ｃｙ５． 二重鎖Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲを可能にするために、１つのプローブを５’−ＦＡＭ／ＢＨＱ−１（５ ２ ０ｎｍの蛍光波長）で標識し、別のプローブを５’−Ｆａｍ−Ｃｙ５.５／３’ＢＨＱ−３（７ ０ ５ｎｍの蛍光波長）で標識した。 溶液中で、5’FAM-Cy5.5/3’BHQ-3で標識されたプローブは、配列へのハイブリダイゼーション時にクエンチされたままであり、酵素プライマー伸長によるプローブのその後の切断時に、クエンチャーは排除される。 これはR.A.P.I.D.の器械の光源によってFAMの刺激によって焦燥で起因する。 励起エネルギーは、アクセプタ蛍光体Cy5に伝達される。図5に示すように、放出された蛍光は、第二の蛍光チャネル（R.A.P.I.D.機器の蛍光チャネルF3）で測定される。 Ｃｙ５．５蛍光の放出は、ＦＲＥＴおよびＴａｑｍａｎプローブ技術の組み合わせの結果であるので、これらの三重標識プローブは、「ＦＲＥＴ−Ｔａｑｍａｎ」プローブと呼ぶことができる。

プライマー、プローブ、およびプラスミド

フレット-TaqManデザインの多重化能力を実証するために、我々は18S rRNA遺伝子（159bpの部分を増幅するために属特 フォワードプライマー（ＪＶＡＦ）は５’−ＡＴＧＡＣＧＧＧＴＡＡＣＧＧＧＧＡＡＴ−３’であり、リバースプライマー（ＪＶＡＲ）は５’−ＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＣ−ＣＡＡＡＡＡＡＧＴＣＣ−３’であり、Ｔａｑｍａｎプローブ（ＪＶＡＰ）は５’−ＦＡＭ−ＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴ−ＧＣＣＴＴＣＣＴＴＡＧＡＴＧ−ＢＨＱ１−３’であり、ヌクレオチド１ ０ ０−１ １ ８、２ ５ ８−２ ３ ６および１ ８ ４−１ ６ １に対応した。それぞれ、genbank ACCESSION no. 458612 Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ＩＰＣの構築のためのプライマーは，Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐの増幅のために報告されたプライマー配列と同じセットを含んでいた。 標的ＤＮＡのプローブ結合領域を除いて、人工配列５’−ＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＧＴＣＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴ−３’（ＪＰＩＰＣ）に置換した。 このプローブシーケンスは69℃のアニーリング温度を有し、二次構造を持たないように設計された。 内部プローブの理論的特異性は、完全に一致する任意のCryptosporidium配列と発見されなかったプローブとプライマー配列のBLAST（11）検索によって確認されました。 ＩＰＣ断片を合成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉ Ａ，ＵＳＡ）によってプラスミドにクローニングした。 既知の濃度のプラスミドＤＮＡ（１ ０ ０コピー／反応）を、陰性対照を除く全ての反応のマスター混合物に添加した。 ＩＰＣに特異的な三重標識プローブ（ＪＰＩＰＣ）を、図１に示すように、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって合成した。 FAM/Cy5.5/BHQ3オリゴヌクレオチドプローブは、非蛍光ブラックホールクエンチャー（BHQ-3）制御細孔ガラス（CPG）と3’末端に開始して合成されました。 次いで、5’末端をCy5.5ホスホラミダイトと結合させ、続いて末端5’フルオレセイン(6-FAM)ホスホラミダイトと結合させた。