Morfologia e tasso di sviluppo della mosca del colpo, Hemipyrellia ligurriens (Diptera: Calliphoridae): Applicazioni di entomologia forense
Abstract
Hemipyrellia ligurriens (Diptera: Calliphoridae) è una specie di mosca del colpo forense importante presentata in molti paesi. In questo studio, abbiamo determinato la morfologia di tutte le fasi e il tasso di sviluppo di H. ligurriens allevati in condizioni ambientali naturali nella provincia di Phitsanulok, nel nord della Thailandia. Le caratteristiche morfologiche di tutte le fasi basate sull’osservazione al microscopio ottico sono state descritte e dimostrate per essere utilizzate a scopo di identificazione. Inoltre, è stato dato il tempo di sviluppo in ogni fase. Il tempo di sviluppo di H. ligurriens per completare la metamorfosi; da uovo, larva, pupa ad adulto, ha richiesto 270,71 h per 1 ciclo di sviluppo. I risultati di questo studio possono essere utili non solo per l’applicazione nelle indagini forensi, ma anche per lo studio nella sua biologia in futuro.
1. Introduzione
Esemplari di mosche di colpo (Diptera: Calliphoridae), in particolare le larve di mosca trovate nei cadaveri e / o nelle scene di morte, possono essere utilizzate come prove entomologiche nelle indagini forensi, cioè stimando l’intervallo postmortem (PMI) e determinando sostanze tossiche, traumi antemortem e se si fosse verificato il trasferimento dei resti, come già documentato . L’identificazione morfologica precisa dei campioni di insetti è uno dei fattori molto importanti dal punto di vista applicativo perché forniscono evidenze rilevanti per le indagini forensi .
Di blow fly specie, Hemipyrellia ligurriens (Wiedemann) è un forense importante blow fly specie, come riportato in precedenza da casi in Thailandia e Malesia . Questa specie di mosca è ampiamente distribuita, coprendo Corea, Taiwan, Laos, Singapore, Papua Nuova Guinea, Australia, India, Cina, Filippine, Sri Lanka, Malesia, Indonesia e Thailandia . Oltre alla sua importanza forense, H. ligurriens può essere un fastidio nei mercati e nei giardini, e gli adulti sono anche vettori meccanici di agenti patogeni, a causa della loro attrazione per gli escrementi umani vicino agli ambienti occupati dall’uomo . In precedenza, la morfologia di alcuni stadi immaturi (uovo, larve di 3 ° stadio e pupario) di H. ligurriens è stata studiata solo osservando sotto un microscopio elettronico a scansione e un microscopio ottico . Per questo motivo, le informazioni disponibili di H. ligurriens sono incomplete per identificare tutte le prove immature che possono essere trovate nelle scene della morte. Inoltre, il tasso di sviluppo di questa specie che è dati importanti per la stima del PMI non è stato trovato nelle letterature citate. Inoltre, i dati di sviluppo specifici della popolazione locale sono molto importanti per stimare l’età larvale per determinare il PMI . Per aumentare l’accuratezza e la precisione quando si applicano queste informazioni nelle indagini forensi, lo studio di tutti i suoi stadi immaturi e il tasso di sviluppo è di grande interesse perché la morfologia di ciascuno potrebbe fornire caratteristiche specifiche che diventeranno importanti per una corretta identificazione e i dati di crescita in condizioni particolari potrebbero fornire dati essenziali per la stima Pertanto, questo studio mirava a indagare le caratteristiche distintive di tutti i suoi stadi immaturi osservando al microscopio ottico, per fornire alcuni dettagli importanti per l’identificazione e per determinare il suo tasso di sviluppo, in particolare nella provincia di Phitsanulok, nel nord della Thailandia.
2. Materiali e metodi
2.1. Mantenimento di H. ligurriens in Laboratorio
La colonia di H. ligurriens utilizzato in questo studio è stato ottenuto originariamente raccogliendo mosche adulte con una rete di spazzamento nelle aree del villaggio di Sao Hin, distretto di Muang Phitsanulok, provincia di Phitsanulok, Thailandia (16°44’18N; 100°13’44E). Tutti gli adulti di H. ligurriens sono stati raccolti sul campo e identificati in base alla loro morfologia, utilizzando la chiave tassonomica di Tumrasvin et al. , prima di essere allevato ulteriormente in laboratorio. Le mosche sono state allevate in condizioni ambientali naturali nella stanza di allevamento a sistema aperto, secondo il metodo di Sukontason et al. . In breve, gli adulti sono stati mantenuti in una gabbia di allevamento (30 × 30 × 30 cm) e nutriti con 2 tipi di cibo: (i) una miscela di 10% (w/v) soluzione di zucchero e 1,5% (v/v) soluzione di sciroppo multivitaminico (SEVEN SEA, Inghilterra) e (ii) fegato di maiale fresco. Il fegato di maiale fresco è stato fornito come cibo larvale e sito di deposizione delle uova. La presenza di uova sul fegato di maiale è stata osservata ogni giorno. Quando sono state trovate le uova, il fegato di maiale con uova di mosca è stato trasferito delicatamente in una scatola di allevamento di larva usando una pinza, e poi, 2 o 3 pezzi (≈50 g/giorno) di fegato di maiale fresco sono stati aggiunti nella scatola come cibo per le larve. Alcuni pezzi di fegato di maiale fresco sono stati aggiunti ogni giorno fino a quando le larve nella scatola hanno smesso di nutrirsi e muoversi o sono diventati lo stadio prepupale (tardo 3 ° instar). Tutti i pezzi di fegato di maiale rimasti nella scatola di allevamento sono stati rimossi dalla scatola. Solo pupe sono stati tenuti nella scatola di allevamento e sigillato ermeticamente fino alla comparsa di adulti è stato trovato. Successivamente, la scatola è stata posizionata e aperta in una gabbia di allevamento per liberare gli adulti dalla scatola per vivere nella gabbia di allevamento. La nuova generazione della mosca è stata allevata continuamente come accennato sopra.
2.2. Morfologia
Uovo
In questo studio, campioni di uova di H. ligurriens sono stati ottenuti dalla colonia di laboratorio per studiare caratteristiche distinte utilizzando la tecnica di colorazione del permanganato di potassio, secondo la precedente descrizione di Sukontason et al. . Le caratteristiche principali, come la morfologia dell’area mediana che circonda il micropilo e la scultura corionica, sono state osservate e fotografate al microscopio ottico (Olympus, Giappone), che è stato collegato a una fotocamera digitale (Samsung S700, Corea). Inoltre, le larghezze e le lunghezze di 30 uova di mosca sono state misurate anche al microscopio ottico calibrato. Media e deviazione standard di larghezza e lunghezza sono stati analizzati utilizzando il programma Excel (Microsoft Office Enterprise 2007).
Larva
Questo studio ha determinato la morfologia e il tasso di sviluppo in tutti gli stadi larvali (1st, 2nd e 3rd instars). La morfologia di tutti gli instars è stata studiata utilizzando il metodo di clearing dell’idrossido. In breve, 30 larve di ogni instar sono state ottenute dalla colonia di laboratorio e sacrificate mettendole in un becher contenente acqua calda (80°C) per 30 sec per evitare che si restringano . Successivamente, sono stati conservati in una piccola bottiglia di vetro contenente il 70% di etanolo. Le larve conservate sono state sezionate singolarmente in due siti per ottenere tre porzioni del corpo usando una lama affilata sotto uno stereo microscopio (Olympus, Giappone), secondo il metodo descritto da Sukontason et al. . Il primo taglio è stato posizionato attraverso la metà del secondo segmento toracico per la visualizzazione dello scheletro cefalofaringeo interno e dello spiracolo anteriore esterno. Il secondo taglio è stato posizionato attraverso il segmento del corpo 11 al fine di osservare le caratteristiche dello spiracolo posteriore. Come metodo di compensazione, ogni coppia di parti anteriore e posteriore è stata lasciata in una lastra di vetro contenente una soluzione di idrossido di potassio al 10% (p/v) per 1 giorno (per 1 ° instar) o 2 giorni (per 2 ° e 3 ° instars). Successivamente, i campioni sono stati lavati due volte con acqua distillata e neutralizzati posizionandoli su una lastra di vetro contenente una miscela di etanolo al 35% e acido acetico glaciale all ‘ 1% per 30 min. Dopo di che, gli esemplari sono stati disidratati in serie in 50%, 70%, 80%, 95%, e etanolo assoluto (RCI LABSCAN, Thailandia) per 30 min per concentrazione di alcol. I campioni disidratati sono stati trasferiti su una lastra di vetro contenente xilene (PROLAB, Francia) e lasciati per 1 min prima di essere montati su un vetrino con 2-3 gocce di supporto di montaggio (Permount). Su ogni esemplare è stata posta una cover slip. I vetrini permanenti sono stati lasciati a temperatura ambiente per 2 giorni prima di essere osservati al microscopio ottico. Lo scheletro cefalofaringeo e lo spiracolo posteriore di ciascun instar sono stati fotografati al microscopio ottico, che è stato collegato alla fotocamera digitale. Inoltre, sono state esaminate la lunghezza e la larghezza del corpo di tutti gli instars. Trenta delle prime larve instar sono state misurate con un microscopio calibrato, mentre il secondo e il terzo instar (n = 30 larve/ ogni instar) sono stati misurati con calibri a nonio sotto un microscopio da dissezione. Media e deviazione standard della loro larghezza e lunghezza del corpo sono stati analizzati utilizzando il programma Excel.
Pupa
In questa fase sono state studiate la morfologia delle parti anteriore e posteriore e il cambiamento di colorazione. Le parti anteriore e posteriore della puparia sono state determinate utilizzando la tecnica di compensazione dell’idrossido di potassio, precedentemente descritta da Sukontason et al. . Le parti anteriori di puparia erano i resti della testa contratta al quarto segmento di puparia dopo che le mosche erano emerse. Sono stati reclutati dalla scatola di allevamento che le mosche erano già emerse. Per ogni parte posteriore, il segmento caudale del pupario è stato tagliato con una lama affilata sotto lo stereo microscopio e poi trasferito usando una pinza nella stessa lastra di vetro utilizzata per la parte anteriore. Successivamente, sono stati immersi in detersivo per piatti 1% (v/v) per rimuovere artefatti superficiali e/o tessuti di fegato di maiale. Come metodo di compensazione, le parti anteriore e posteriore sono state lasciate in una provetta contenente una soluzione di idrossido di potassio al 10% (p/v) e la provetta è stata trasferita in un bagno d’acqua a una temperatura di 80°C per 1 h. Quindi, il processo del campione è stato eseguito seguendo quello descritto per lo stadio larva. Le caratteristiche importanti delle parti anteriore e posteriore sono state osservate e fotografate al microscopio ottico, collegato alla fotocamera digitale. Il numero di papille in ogni spiracolo posteriore di 30 parti anteriori è stato contato e calcolato per il suo intervallo. Inoltre, trenta pupari sono stati misurati per la loro larghezza e lunghezza utilizzando calibri a nonio. Media e deviazione standard della loro larghezza e lunghezza sono stati analizzati utilizzando il programma Excel. Per l’osservazione del cambiamento di colorazione, è stato selezionato e fotografato solo un pupario che rappresentava il colore della puparia nella scatola di allevamento 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, e 24 h utilizzando la fotocamera digitale. Prima di scattare fotografie, il pupario veniva lavato in acqua distillata per rimuovere i manufatti superficiali.
Adulto
I giovani adulti, 5-7 giorni di età, sono stati ottenuti dall’allevamento in gabbia utilizzando una provetta. Sono stati sacrificati mettendoli in frigorifero (-4°C) per 2 h. Successivamente, sono stati delicatamente appuntati con una buona disposizione anatomica. Le caratteristiche importanti per l’identificazione sono state esaminate e fotografate sotto lo stereo microscopio, collegato alla fotocamera digitale. Inoltre, trenta adulti sono stati misurati per la larghezza e la lunghezza del corpo utilizzando calibri a nonio. In questo studio, la larghezza del corpo indica la larghezza del 2 ° segmento toracico e la lunghezza del corpo è l’intera lunghezza del corpo, che va dall’occhio composto medio all’ultimo segmento dell’addome. Media e deviazione standard della loro larghezza e lunghezza del corpo sono stati analizzati utilizzando il programma Excel.
2.3. Valutazione del tasso di sviluppo
Per la valutazione del tasso di sviluppo, gli esperimenti sono stati eseguiti nella sala di allevamento a sistema aperto sotto la temperatura ambiente naturale della provincia di Phitsanulok, nel nord della Thailandia. La temperatura e l’umidità relativa sono state registrate quotidianamente utilizzando un termometro e un igrometro (Thermo-Hygro TM870, Cina). Le gamme (media ± SD) di temperatura e umidità relativa registrate utilizzate per determinare il tasso di sviluppo di questa mosca erano rispettivamente di 26,7 ± 0,61°C e 74 ± 3%. Per ogni esperimento, il tasso di sviluppo è iniziato al ritrovamento di larve appena schiuse (o il 1 ° instar); lo stadio prepupale ha significato l’endpoint. Le larve appena schiuse sono state riconosciute come 0 h vecchie larve. La valutazione del tasso di sviluppo in questo studio è stata studiata separando le larve appena schiuse dalla stessa colonia di mosche adulte in 3 gruppi. Ogni gruppo consisteva di 150-200 larve appena schiuse. Sono stati trasferiti delicatamente dalla scatola di allevamento a quella nuova usando un pennello bagnato (numero 4). Il fegato di maiale fresco (≈50 g) è stato fornito quotidianamente come fonte di cibo per le larve in ogni scatola di allevamento. Le cinque larve più grandi sono state rimosse dalla scatola di allevamento ogni 3 h. Sono state sacrificate mettendo in acqua calda (≈80°C) per 30 secondi per prevenire il restringimento larvale e sono state conservate in una piccola bottiglia di vetro contenente il 70% di etanolo. Tutte le larve conservate sono state misurate lunghezze del corpo utilizzando un microscopio calibrato o calibri a nonio sotto un microscopio da dissezione, a seconda delle loro dimensioni. La relazione tra lunghezze del corpo larvale e tempo di sviluppo è stata analizzata utilizzando il programma Excel. Inoltre, le durate di vita in altre fasi sono state registrate e analizzate utilizzando il programma Excel.
3. Risultati
3.1. Morfologia
Uovo
L’uovo di H. ligurriens era allungato e affusolato alle estremità anteriore e posteriore (Figura 1(a)). Misurava 1,44 ± 0,11 mm di lunghezza e 0,47 ± 0,04 mm di larghezza (Tabella 1). Ci è voluto tempo in questa fase per 10,3 ± 0,30 h prima della muta per essere stadio larvale (Tabella 1). L’uovo non colorato era bianco crema; mentre quelli dopo la colorazione con permanganato di potassio 1% erano di colore marrone chiaro. L’area mediana era situata dorsalmente, posizionando una forma a Y che si estendeva dall’estremità anteriore a quasi l’estremità posteriore (Figura 1(b)). La linea di tratteggio era eretta, mostrando così un ispessimento scuro lungo l’area mediana (Figura 1(a)). La scultura corionica appariva come un motivo esagonale, con il suo confine reticolare leggermente rialzato come una rete (Figura 1(c)).
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Uovo di Hemipyrellia ligurriens macchiato con 1% di permanganato di potassio. a) Uovo intero; MA: area mediana. b) Estremità anteriore dell’uovo con piastrone biforcato e micropilo; M: micropilo. (c) Scultura corionica esterna che mostra modello esagonale, con il suo confine reticolare leggermente elevando come una rete. Bar = 100 m m per tutte le figure.
Larva
Sotto osservazione con lo stereo microscopio, tutti gli istari larvali di H. ligurriens mostravano la tipica larva vermiforme a forma di muscoide che era appuntita anteriormente e smussata posteriormente. Il segmento caudale aveva un singolo paio di spiracoli posteriori. Il primo instar era relativamente piccolo, misurava 2,62 ± 0,70 mm di lunghezza e 0,75 ± 0,35 mm di larghezza, con il tempo di sviluppo in questa fase di 12 ± 0,1 h (Tabella 1). Lo scheletro cefalofaringeo non era ben sviluppato(Figura 2 (a)), mentre lo spiracolo posteriore aveva 2 fessure spiracolari che si fondevano ventralmente(Figura 2 (e)). Il secondo instar era di 6,24 ± 1,67 mm di lunghezza e 1,37 ± 0,19 mm di larghezza, con una durata di 12 ± 3 h in questa fase (Tabella 1). Lo scheletro cefalofaringeo era quasi completo(Figura 2 (b)), mentre lo spiracolo posteriore aveva 2 fessure spiracolari separate con peritreme incompleto debolmente pigmentato(Figura 2 (f)). La dimensione del 3 ° instar era la più grande, misurando 12,18 ± 1,31 mm di lunghezza e 2,32 ± 0,19 mm di larghezza. Il tempo di sviluppo è stato anche il più lungo in questa fase, essendo 84 ± 3 h (Tabella 1). Gli scheletri cefalofaringei del primo e del tardo 3 ° instar erano simili(Figure 2(c) e 2 (d), resp.). Gli spiracoli posteriori del primo(Figura 2 (g)) e del terzo stadio tardivo(Figura 2 (h)) erano simili, con 3 fessure spiracolari separate e peritreme completo con una proiezione interslit, ad eccezione di quest’ultimo che mostra un peritreme altamente pigmentato(Figura 2 (h)). Le caratteristiche distintive di tutti e tre gli instar sono state riassunte nella tabella 2.
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Pupa
Il pupario di H. ligurriens era di tipica forma coartata (Figura 3), che misurava 6,82 ± 0.27 mm di lunghezza e 2,76 ± 0,11 mm di larghezza (Tabella 1). I cambiamenti di colore osservati hanno rivelato che il primo pupario era di colore bianco crema (0 h), con l’estremità posteriore ancora troncata (Figura 3(a)). Tuttavia, il colore del pupario è cambiato gradualmente in marrone giallo chiaro entro 3 h dopo la pupariazione(Figura 3 (b)) e poi in marrone dopo circa 15 h(Figura 3 (f)). Il colore del pupario è diventato marrone scuro dopo circa 18 ore di osservazione (Figura 3 (g)). A 24 h, il pupario mostrava il colore marrone più scuro(Figura 3 (i)). La durata per l’intero stadio pupale era di 152,5 ± 30,7 h (Tabella 1).
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Color changes in puparia of Hemipyrellia ligurriens up to 24 h after pupariation. Puparium (a)–(i) at 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, and 24 h, respectively. Bars = 100 𝜇m for all figures.
L’osservazione delle parti anteriore e posteriore della puparia è apparsa di un colore giallo-marrone pallido dopo essere stata trattata con idrossido di potassio al 10%. La piastra anteriore, pressata con una cover slip, era a forma trapezoidale con 2 spiracoli anteriori situati ad entrambe le estremità superiori (Figura 4(a)). Ogni spiracolo anteriore era costituito da 5 a 7 papille(Figura 4 (b)). La colonna vertebrale osservata nel terzo segmento mostrava file di punte a punta singola(Figura 4 (c)). Ogni spiracolo posteriore presentava tre fessure spiracolari marrone scuro altamente pigmentate, con bottone altamente pigmentato e peritreme debolmente pigmentato (Figura 4(d)).
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Puparium of Hemipyrellia ligurriens after treating with 10% KOH. (a) Anterior plate with trapezoid shape. (b) Anterior spiracle with 6 papillae. (c) Modello della colonna vertebrale al 3 ° segmento che mostra punta punto singolo. d) Spiracoli posteriori. Bar = 100 m m per tutte le figure.
Adulto
L’adulto H. ligurriens aveva una lunghezza di 12,23 ± 0,61 mm, una larghezza di 2,85 ± 0,25 mm (Tabella 1) e un aspetto verde rame metallico, con pollinosi bianco grigiastro sulla parte anteriore del torace (Figure 5(a) e 5(b)). La testa della femmina era dicottica, ma quella del maschio era subholoptica (Figure 5(c) e 5(d)). La pollinosità facciale grigiastra è stata trovata in entrambi i sessi(Figure 5 (c) e 5(d)), e l’intero terzo segmento antennale era marrone scuro o arancione ventralmente (Figure 5(c) e 5(d)). Squama era biancastro(Figura 5 (e)). Gena era coperto di peli neri (Figura 5 (f)). La vena del gambo era senza setole (Figura 5 (g)). Due setae acrostichali postsuturali sono state trovate sul torace (Figura 5 (h)). Supraconvessità è stata trovata capelli pilosi (Figura 5 (i)). Tutte le caratteristiche di cui sopra erano importanti per l’identificazione di questa mosca adulta.
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Adults and important characteristics for identification of Hemipyrellialigurrien. (a) Dorsal view of the female. (b) Dorsal view of the male. (c) Frons of the female showing dichoptic eyes. (d) Frons of the male showing subholoptic eyes. (e) Vista laterale dell’adulto che mostra squame biancastre (freccia). (f) Maggiore ingrandimento della testa che mostra peli neri sulla gena (freccia). (g) Ala che mostra la vena del gambo senza setole (freccia). h) Torace dorsale. (i) Capelli pilosi sulla supraconvessità (freccia). Bar = 200 m m per tutte le figure.
3.2. Valutazione del tasso di sviluppo
Le valutazioni del tasso di sviluppo di H. ligurriens sono state determinate durante il periodo dell’inchiesta, in base alle condizioni ambientali naturali della provincia di Phitsanulok. La curva di crescita dello stadio larvale ha mostrato la forma sigmoidea (Figura 6). I dati sul tasso di sviluppo dell’allevamento hanno rivelato che il tempo di sviluppo dalle larve appena covate all’inizio della puperiazione cresce rapidamente in un periodo totale di 108 h. Le larve hanno raggiunto la loro lunghezza mediana massima a ≈42 h e la puperiazione si è verificata a 108h.
4. Discussione
I dati relativi alle caratteristiche importanti degli insetti per un’identificazione e uno sviluppo rapidi e affidabili in laboratorio sono prerequisiti cruciali per un’applicazione appropriata nelle indagini forensi. H. ligurriens è una specie di mosca forense che è stata registrata in casi forensi in Malesia e Thailandia . Questo studio si è concentrato sulle caratteristiche importanti per identificare tutte le fasi di H. ligurriens, sulla base dell’osservazione al microscopio ottico e del tempo di sviluppo di ogni stadio in condizioni ambientali naturali con temperature medie e umidità relativa, che erano rispettivamente di 26,7 ± 0,61°C e 74 ± 3%. Sebbene la morfologia in alcune fasi di H. ligurriens sia stata studiata in precedenza utilizzando il microscopio elettronico a scansione e il microscopio ottico , questo studio ha fornito informazioni più dettagliate sulle caratteristiche distintive e nuovi indizi per l’identificazione utilizzando tecniche semplici al fine di aumentare l’accuratezza e la precisione dell’applicazione forense in futuro. Inoltre, questo studio ha fornito dati di sviluppo di H. ligurriens, che possono essere utilizzati per stimare il PMI dei cadaveri su cui questa specie di mosca ha colonizzato.
La scultura corionica così come la larghezza e la lunghezza dell’area mediana sono state segnalate in precedenza come una caratteristica importante nell’identificazione dell’uovo di mosca . La morfologia dell’uovo di H. ligurriens, osservata in questo studio colorando con permanganato di potassio all ‘ 1% e osservando al microscopio ottico, era simile a quella del lavoro precedente, che studiava usando il microscopio elettronico a scansione . Pertanto, i risultati di questo studio hanno confermato l’efficacia del metodo di colorazione, avviato da Sukontason et al. , per scopo di identificazione di uova di mosca. Le uova macchiate potevano essere osservate chiaramente al microscopio ottico. Confrontando i dati con studi precedenti, la dimensione dell’uovo di H. ligurriens in questo studio era più grande di quella di altre mosche di colpo, come Lucilia cuprina, Ceylonomyia (= Chrysomya) nigripes e Aldrichina grahami; tuttavia, le sue dimensioni non erano diverse dalle dimensioni di Chrysomya megacephala e Achoetandrus (= Chrysomya) rufifacies . Tuttavia, le dimensioni dell’uovo di mosca non possono essere utilizzate come caratteristiche primarie per l’identificazione, secondo le informazioni fornite da Erzinclioglu , che ha riferito che le dimensioni dell’uovo di mosca dipendevano dai livelli dietetici. Pertanto, l’identificazione dell’uovo di mosca dovrebbe utilizzare le caratteristiche della larghezza del piastrone, la morfologia dell’area del piastrone che circonda il micropilo come criteri principali e utilizzare le dimensioni come caratteristica supplementare per l’identificazione dell’uovo .
Sulla base dei nostri riferimenti, questo studio è stato il primo studio, mostrando la morfologia dello scheletro cefalofaringeo e dello spiracolo posteriore in tutte le larve instar osservando al microscopio ottico. Scheletri cefalofaringei e spiracoli posteriori delle larve sono stati visti chiaramente come diversi in ogni instar. I risultati di questo studio concordano con le relazioni precedenti . Inoltre, questo studio ha mostrato grado di pigmentazione di peritreme in ogni instar. Può essere un nuovo indizio per differenziare l ” età delle larve, soprattutto tra inizio e fine instar. Con ogni instar evolutivo sicuramente diverso così come il grado di pigmentazione, i dati di questo studio possono essere utili per identificare gli stadi larvali e l’età delle larve di questo colpo volare in dettaglio come accennato in precedenza.
Studio sulla morfologia dello stadio pupale ha fornito i risultati che erano simili ai rapporti precedenti . I risultati dell’osservazione nei cambiamenti di colorazione per tempo di H. ligurriens puparia sono stati riportati per la prima volta in questo studio e possono essere un’altra nuova evidenza di supporto per determinare almeno l’età approssimativa di puparia per aumentare l’accuratezza del valore PMI.
Questo studio ha dimostrato alcune fotografie di caratteristiche distintive per l’utilizzo nell’identificazione di H. ligurriens adulti. Queste fotografie di caratteristiche peculiari di questo studio possono essere utili per le persone che non hanno familiarità con la terminologia nelle chiavi tassonomiche. L’attuale chiave tassonomica per l’identificazione delle specie di mosche soffiate in Thailandia è stata data da Kurahashi e Bunchu . Dagli occhi nudi di un nonentomologo, l’adulto H. ligurriens sembra simile a A. rufifacies in apparenza. Pertanto, la possibilità di identificazione errata può verificarsi in entrambe le specie, specialmente in Thailandia perché A. rufifacies era la seconda specie di mosca colpo più predominante della Thailandia, e coincidenza di entrambe le specie in alcune province di questo paese è stato trovato .
Questo studio è stato il primo rapporto che ha fornito il tempo di sviluppo di H. ligurriens in tutte le fasi. I risultati hanno mostrato che il tempo di sviluppo di H. ligurriens in condizioni naturali in questo studio (una temperatura media di 26,7 ± 0,61°C e un’umidità relativa di 74 ± 3%) era più veloce di quello di C. megacephala e A. rufifacies, che sono stati studiati ad una temperatura media di 27,4°C. Inoltre, il tempo di sviluppo di ogni stadio di H. ligurriens era diverso da quello di C. megacephala e A. rufifacies. È stato specificato il tasso di sviluppo di ciascuna specie, sebbene siano cresciute nelle stesse condizioni o in condizioni correlate . Inoltre, la variazione dei tempi di sviluppo all’interno di una specie di mosca del colpo è stata trovata in popolazioni geograficamente diverse . I dati di sviluppo specifici della popolazione locale sono necessari per stimare l’età larvale per determinare il PMI. Pertanto, i dati di questo studio sono molto importanti per ulteriori applicazioni, in particolare nella provincia di Phitsanulok.
I dati, ottenuti sia dalle caratteristiche morfologiche che dal tempo di sviluppo, soddisfano le informazioni precedenti e forniscono nuove prove di supporto per l’identificazione di questa specie di mosca soffiata e l’applicazione nelle indagini forensi, in particolare quando H. ligurriens è presente nei cadaveri umani. Inoltre, potrebbero essere utili come dati di base nel suo studio di biologia in futuro.
Riconoscimenti
Questo studio è stato sostenuto principalmente da una sovvenzione fornita a N. Bunchu dalla Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University, e un altro dal Fondo di ricerca Thailandia (MRG5280194). Gli autori ringraziano anche il Centro di Eccellenza in Biotecnologie mediche, Facoltà di Scienze Mediche, Università di Naresuan, e la Divisione di Amministrazione della ricerca, Università di Naresuan, per il sostegno e la defraying del costo di pubblicazione.