Introducción

La Lipomatosis Múltiple Familiar (FML, OMIM% 151,900) es un trastorno autosómico dominante poco frecuente de hipodermis caracterizado por el desarrollo de nódulos subcutáneos bien encapsulados en las extremidades y el tronco.1 Los primeros informes de tumores adipocíticos múltiples fueron hechos desde 1846 por Sir Benjamin Brodie.2 Los resultados posteriores de Blaschko (1891) y Alsberg (1892) demostraron una recurrencia familiar de las lesiones y observaron un aumento de la incidencia entre los varones.1,3,4 En los años siguientes, muchos otros autores publicaron familias con características altamente sugestivas de LMF1, 5, 6 y, finalmente, en 1970, Das Gupta clasificó los tumores lipomatosos en tres categorías: solitarios o esporádicos, LMF y Lipomatosis Simétrica Múltiple (LMS).7,8

Los lipomas solitarios se consideran la neoplasia benigna de tejidos blandos más común en adultos, pero se presentan lipomas múltiples en 5% de los individuos.9,10 Se desconoce la prevalencia exacta de LMF, pero se ha estimado que es del 0,002%.8,11,12 La edad de aparición de nódulos es de entre 30 y 40 años, alcanzando su pico máximo a los 50s6, 8, 13, 14.Se ha sostenido ampliamente que este trastorno muestra una preferencia por los varones, sin embargo, un gran número de trabajos demuestran que ambos sexos están igualmente afectados.15-17 Aunque se considera una enfermedad benigna, pueden aparecer preocupaciones estéticas en algunas personas, lo que afecta su calidad de vida. Además, también es frecuente en individuos obesos.9

Hasta ahora, la investigación disponible en LMF se ha centrado explícitamente en los aspectos clínicos, y los problemas moleculares generalmente no se investigan. La bibliografía indica que al menos 70% de los lipomas esporádicos se deben a reordenamientos citogenéticos que comprometen la banda 12q13-15, lo que podría conducir a una expresión desregulada del gen HMGA2 (Grupo de Movilidad alta en el gancho 2). Este gen codifica proteínas de cromatina no histonas responsables de los cambios conformacionales del ADN, la proliferación celular aberrante y el desarrollo de tumores mesenquimatosos benignos.18-20

El reconocimiento de la base molecular de las condiciones genéticas y la implementación de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha permitido explorar y dilucidar otros mecanismos involucrados en la etiología de varias genodermatosis. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo realizar una caracterización clínica y molecular de siete individuos con FML para detectar variantes en seis genes candidatos relacionados con la lipomatosis utilizando técnicas de secuenciación de Sanger y de próxima generación (NGS).

Materiales y métodos

Pacientes y Aspectos Éticos

Esta investigación se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo la aprobación del Comité de Revisión Institucional antes del estudio (Comité de Ética en Investigación de la FCM-UNICAMP, expediente N° 1.313.164) y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio se realizó en el ambulatorio del servicio de genética médica del Hospital Clínico de la Universidad de Campinas (HC-UNICAMP) en São Paulo, Brasil. Un total de siete personas pertenecientes a cinco familias no emparentadas (nombradas de A a E) eran elegibles. Los criterios de inclusión primarios para la selección de los sujetos fueron los siguientes: i) edad mayor de 18 años, ii) diagnóstico clínico e histopatológico de lipoma o angiolipoma y iii) recurrencia familiar que sugiera herencia autosómica dominante. Los principales aspectos clínicos se recogieron de las historias clínicas utilizando un formulario estructurado. La evaluación física contó con la participación de especialistas dermatólogos y genetistas. El Departamento de Patología de la HC-UNICAMP proporcionó las muestras histopatológicas. Los hallazgos clínicos se detallan en la Tabla 1.

Tabla 1 Resumen Clínico de Pacientes con LMF

Secuenciación Sanger del Gen HMGA2

Se extrajo ADN genómico de muestras de sangre EDTA periférica de siete pacientes de acuerdo con el procedimiento convencional de fenol-cloroformo utilizado por Sambrook et al21

Se realizó una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar regiones de unión de exones e intrones-exones de la HMGA2 gen. Utilizando dos herramientas bioinformáticas en línea, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) y oligoanalizador 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), diseñamos el par específico de primers, como se resume en la Tabla 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cromatogramas se examinaron utilizando Chromas v. 2. 6.5. Los resultados se compararon con el número de transcripción HMGA2 Ensembl ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Verificamos las variantes novedosas en tres conjuntos de datos públicos: i) La red de Balizas de la Alianza Global para la Genómica y la Salud (GA4GH) (https://beacon-network.org/#/), ii) El Consorcio de Agregación de Exomas (http://exac.broadinstitute.org/) y, iii) El Archivo en Línea de Mutaciones Brasileñas (http://abraom.ib.usp.br/). Para evaluar las puntuaciones de patogenicidad y los efectos de daño de variantes nuevas en el gen candidato HMGA2, utilizamos diferentes modelos de predicción in silico como VEP (Predictor de Efecto de Variante),22 FATHMM (Análisis Funcional A Través de Modelos de Markov Ocultos),23 Predictor UMD,24 SIFT (Clasificación de Intolerantes de Tolerantes),25 PROVEAN (Analizador de Efecto de Variación de Proteínas),26 y Probador de Mutaciones.27

Panel de varios Genes Diana

Se realizó un panel personalizado para evaluar los genes implicados en la lipomatosis sindrómica. Para realizar esta técnica, obtuvimos ADN genómico de muestras de saliva de cinco pacientes (A, B, C, D y E) utilizando el kit de auto-recolección de ADN Oragene® (DNA Genotek, Inc. Ottawa, Ontario, Canadá). Las muestras se enriquecieron e hibridaron contra secuencias específicas del objetivo. La captura se realizó utilizando el secuenciador Illumina® MiSeq (Captura TruSeq) de última generación en modo de extremo emparejado de 150 bp de acuerdo con el protocolo estándar para esta plataforma. La profundidad de cobertura de las regiones objetivo fue superior a 50 veces. El enriquecimiento y el análisis se centraron en las secuencias de codificación de cinco transcripciones (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 y PTEN NM_000314.4), 10 pb de secuencias intrónicas y otras regiones presuntamente causantes de la enfermedad. Durante la investigación también se consideraron las eliminaciones exónicas, las duplicaciones y las variaciones en el lugar de empalme. Las lecturas se alinearon y compararon con la referencia del genoma humano (GRCh37). La Amplificación de Sonda dependiente de Ligadura múltiple (MLPA) se eligió para validar las variantes mencionadas por Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

Disponibilidad de datos

Las secuencias se enviaron a GenBank (número de acceso: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Los conjuntos de datos relacionados con este artículo están disponibles en el Instituto Europeo de Bioinformática EMBL-EBI a través del repositorio ENA con número de acceso al estudio PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

Resultados

Análisis clínico

Se incluyeron siete individuos de cinco familias no emparentadas (A, B1, B2, C, D1, D2 y E), como se muestra en la Figura 1. No identificamos consanguinidad parental entre los participantes. El origen étnico fue reportado como mezclado por cada probanda. En un panorama general, se observó que las familias A y B tenían tres generaciones sucesivas o más involucradas. La proporción entre hombres y mujeres se estimó en 1:6. La edad media en el momento de la inclusión fue de 42 años (DE 11,8), mientras que la edad media de aparición de las lesiones fue de 28 años (DE 11,8). Las mujeres informaron de una incidencia máxima de nódulos después de sus embarazos. Las características clínicas clásicas de la LML incluyeron nódulos blandos muy variables en número y tamaño, ubicados en la grasa subcutánea y confinados al tronco y las extremidades, como se muestra en la Figura 2. Las molestias y la sensibilidad marcada a la palpación se observaron solo en el individuo A. Los trastornos gastrointestinales comórbidos se presentaron en los pacientes A, C y D2. Reportaron diverticulitis y pólipos, estreñimiento crónico severo y cáncer colorrectal, respectivamente. Cuatro pacientes se sometieron a evaluación histológica de lesiones subcutáneas. La presencia de adipocitos maduros redondeados por numerosos capilares confirmó el diagnóstico de angiolipoma,tal como lo mencionan Bancroft y Fletcher et al10, 28 (Figura 2). Otros hallazgos relevantes se describen en la Tabla 1.

la Figura 1 Visión general de los árboles genealógicos de las familias estudiadas (a–E). Observe cómo las mujeres y los hombres están igualmente involucrados y el patrón de herencia autosómica dominante con casi dos generaciones sucesivas afectadas. La familia A tuvo el mayor número de generaciones que desarrollaron lipomas múltiples (a). El probanda A (III 2) fue el único dentro de su grupo familiar y en la casuística en referir dolor cuando fue examinado (a). Las flechas indican los probandos.

la Figura 2 características Clínicas de la FML y aspectos histopatológicos de los lipomas (ÉL de la mancha (10×). Los hallazgos primarios incluyen nódulos blandos, móviles y circunscritos indoloros, ubicados en la grasa subcutánea. La distribución topográfica más común comprende los miembros superiores (A, B y D), la pared abdominal anterior, la espalda y los muslos (C). El lipoma generalmente presenta un patrón lobulado de adipocitos blancos con núcleos uniformes y una cápsula fibrosa delgada (E). Los angiolipomas están compuestos de grasa madura en asociación con numerosos vasos sanguíneos pequeños, que son predominantemente capilares. Los trombos de fibrina (flechas) son muy frecuentes (F). Imágenes cortesía del Departamento de Patología y Genética Médica de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNICAMP.

Molecular

La secuenciación de Sanger reveló dos variantes novedosas en el exón 5 del gen HMGA2. Ambas variantes fueron identificadas en el paciente A y B1. La primera fue una variante heterocigota sinónimo c. 327C> T p. (Asp=) considerada de bajo impacto o neutra, basada en varias herramientas de predicción (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). En contraste, la segunda alteración fue una variante heterocigota de cambio sin sentido c. 328T>C (p.*110Glnext * 16) que causa una sustitución de codones de parada por aminoácidos de glutamina y la posterior extensión de la proteína final (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). La Figura 3 esquematiza la estructura del gen HMGA2, los dominios de unión a proteínas y las nuevas variantes.

la Figura 3 Estructura de los humanos gen HMGA2. (A) Ubicado en el 12q14.3, el gen HMGA2 abarca más de 140 kb y abarca cinco exones. Los exones 1, 2 y 3 (cajas azules) codifican para un dominio AT-hook (círculos azules). El cuarto exón (lila) codifica para una región espaciadora. El exón 5 (caja rosa)codifica el dominio C-terminal de la proteína de 109 aminoácidos. (B) Electroferograma de los pacientes a, B1, y de referencia. Se encontraron dos variantes nuevas idénticas en estos pacientes. Una variante heterocigota sinónimo c. 327C>T (p. Asp=) y una variante heterocigota sin cambios c. 328T>C (p.*110Glnext*16).

La variante c. 328T> C (p.*110Glnext*16) se definió como 100% patógena o de alto impacto según lo mencionado en los algoritmos silico. Sin embargo, el sistema de predicción de Catadores de Mutaciones demostró una discrepancia entre las dos variantes descritas, como se muestra en la Tabla 3. El panel de genes específicos de AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA y PTEN en las familias A, B, C, D y E, no detectó cambios perjudiciales en las secuencias evaluadas.

Variantes de la Tabla 3 Encontradas en Individuos A y B1 y Comparación Entre Herramientas de Predicción

Discusión

El presente estudio se propuso identificar las bases moleculares de la FML mediante la integración de técnicas de secuenciación modernas, como la secuenciación Sanger y el NGS, combinadas con enfoques clínicos tradicionales.

Siguiendo estudios anteriores, la presente investigación muestra algunas divergencias con respecto a los datos epidemiológicos. Observamos que existe una idea errónea común sobre la clasificación y el diagnóstico de los diferentes tipos de lipomatosis.7,10,15 Varios autores enfatizan que los hombres tienen una alta tendencia a presentar lipomas multiples11,29,30,sin embargo, nuestros resultados muestran una frecuencia aparentemente alta de LML en las mujeres. Es posible que este hallazgo simplemente refleje un sesgo de selección debido al pequeño tamaño de la muestra, o también se explique por el hecho de que las mujeres son más propensas a buscar atención médica de salud debido a preocupaciones cosméticas.31 Sin embargo, los pedigríes indican que la proporción de individuos afectados en ambos sexos fue similar, lo que lleva a una proporción de sexos cercana a 1:1 (10 hombres frente a 13 mujeres), lo que puede subestimar la prevalencia real de LML.6,8,16 Curiosamente, el número total de lipomas observados en mujeres fue mayor en comparación con el único varón examinado.1,14

Factores como el sobrepeso y el crecimiento exacerbado de nódulos durante y después del embarazo sugieren que factores exógenos (dieta), cambios metabólicos (dislipidemia o alteraciones en la desaturación de ácidos grasos) y mecanismos hormonales pueden estar involucrados en la hiperplasia de adipocitos.32,33 Yee et al compararon las diferencias en la desaturación enzimática de la estearoil-CoA entre individuos con trastornos adiposos raros (DRAD) y el grupo de control obeso y concluyeron que los individuos con LMF y obesidad mostraron las tasas más altas de desaturación, aumentando así el proceso de lipogénesis.32,34

Un hallazgo inesperado fue que la paciente A era la única dentro del grupo casuístico y de su familia en manifestar dolor, debilidad diaria, fatiga y comorbilidad psiquiátrica (depresión crónica y trastorno de ansiedad). Estos síntomas están fuertemente asociados con la enfermedad de Dercum, que se considera un diagnóstico diferencial o una variante de LML.Con base en la nueva clasificación de la enfermedad de Dercum propuesta por Hansson et al36,identificamos en este paciente la forma nodular generalizada, caracterizada por un dolor intenso en la superficie del tejido graso y alrededor de los lipomas. Otro estudio que apoya esta hipótesis fue publicado por Campen et al37 Describieron a una familia de nueve miembros diagnosticados con lipomas múltiples que mostraron síntomas variables que variaron desde discapacidad total hasta nódulos asintomáticos. Por lo tanto, se puede suponer que la segregación sigue un patrón autosómico dominante con expresividad variable y posiblemente representa una manifestación extrema de LML.

En cuanto al diagnóstico histopatológico, se evidenciaron dos tipos principales: lipoma y angiolipoma. Microscópicamente, la característica notable más común del angiolipoma es la proliferación de vasos sanguíneos finos que contienen microtrombis de fibrina en asociación con adipocitos maduros.10,28 Los angiolipomas parecen tener una incidencia alta en hombres adultos jóvenes que ocasionalmente manifiestan dolor o sensibilidad leves. Este tipo de tumor también está relacionado con los antecedentes de trauma local o el uso de terapia con esteroides.13,38 Aunque muchos autores reconocen ambos diagnósticos como diferentes entidades patológicas, algunos informes de casos no hacen esta distinción debido a diferencias muy sutiles entre ellos.39 En este contexto, nuestro análisis confirma que es posible tener angiolipomas con recidiva familiar y que este diagnóstico podría formar parte del amplio espectro de la LMF.40-43 Además, se han notificado lipomas de células fusiformes múltiples, otro tipo de lipoma, en varias familias.44

Aunque hay varios estudios centrados en la expresión y el análisis citogenético directo de lipomas esporádicos, pocos estudios se han preocupado por las causas constitucionales de la LMF.2 Series extensas de lipomas en adultos confirman múltiples reordenamientos estructurales con frecuencias que van de 50 a 75%.10,28,45 Entre esas alteraciones cromosómicas balanceadas, se observa translocación t(3; 12)(q27-28; q13-15) en casi 25% de los tumores.9 En la mayoría de los casos, el punto de ruptura afecta al gen HMGA2, que está compuesto por 5 exones y genera una proteína de 109 aminoácidos (Figura 3).18,46,47 Ligon et al relataron el caso de un niño de ocho años con un reordenamiento constitucional que afectaba a la banda 12q14.3 (inversión pericéntrica de novo) por lo tanto, involucrando al gen HMGA2. Sin embargo, el fenotipo clínico caracterizado por sobrecrecimiento somático, avance de la edad ósea y dental, tumor cerebeloso y lipomas múltiples48 difiere de nuestra casuística.

Analizamos las variantes heterocigotas c. 327C>T p.(Asp=) y c. 328T> C (p.*110Glnext*16) del exón 5 del gen HMGA2 en diversos programas de predicción. La alteración sinónima o silenciosa se interpretó como benigna, mientras que el cambio en el codón de parada de traducción se consideró 100% patógeno o de alto impacto. De esta manera, podría indicar que los cambios que involucran la región 3 UT UTR (no traducida) desencadenarían la transformación neoplásica del gen HMGA2.Fusco et al destacaron el papel crucial del gen HMGA2 en los tumores mesenquimatosos. Propusieron que en el gen HMGA2, la región 3ʹ UTR generalmente es silenciada por el miARN Let-7 y cualquier alteración a este nivel, ya sea truncamiento o fusión con secuencias ectópicas, conduce a su regulación ascendente y, en consecuencia, a una replicación anormal de las células.46

Es algo sorprendente que en la familia B hayamos detectado ambas variantes novedosas solo en la madre (B1). Podría indicar que no se segregan con fenotipo FML, siendo descartados al menos en esta familia como causa etiológica. Por otro lado, el paciente A presentó las mismas dos variantes novedosas, pero demostró un fenotipo altamente sugestivo de la enfermedad de Dercum. A pesar de estos hallazgos prometedores, son algo difíciles de interpretar porque no fue posible evaluar a otros familiares afectados con LFM.

La infiltración grasa focal y los lipomas múltiples pueden estar presentes en varios síndromes. El síndrome de Proteus y los CLAVOS (Sobrecrecimiento asimétrico Lipomatoso congénito, malformaciones vasculares, nevos epidérmicos, anomalías esqueléticas y espinales) son ejemplos de mutaciones somáticas en las que está presente la lipomatosis.50,51 Por otro lado, el Síndrome de Bannayan-Riley-Rubacalva, la Neoplasia Endocrina Múltiple tipo 1, el síndrome de Cowden y el síndrome de Gardner son afecciones resultantes de mutaciones de la línea germinal que tienen lipomatosis concomitante.52-55 Incluso algunas mutaciones que involucran la función mitocondrial están relacionadas con el crecimiento anormal del tejido adiposo, principalmente en la parte superior del tronco y el cuello, y el mejor ejemplo es la enfermedad de Madelung.56 Sin embargo, el panel negativo de AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA y PTEN excluye que sean responsables del fenotipo FML, al menos en esta investigación.

Conclusión

La LMF es una enfermedad rara y heterogénea que puede solaparse con otros síndromes dermatológicos como la enfermedad de Dercum. La historia natural de la LML en esta serie reveló que el desarrollo de lesiones fue progresivo y alcanzó su mayor incidencia en individuos de mediana edad. La LML afectó a ambos sexos y presentó una distribución topográfica con predominio en extremidades y tronco. La proporción de sexos entre los pacientes evaluados mostró una prevalencia femenina, pero los datos de pedigrí mostraron una distribución más equilibrada. El diagnóstico de enfermedad de Dercum también se reconoció en un individuo (paciente A).

El enfoque molecular ha proporcionado una visión más profunda de la base genética de la FML y ha intentado investigar a fondo el mayor número de genes candidatos vinculados a ella. Destacamos la utilidad del SGN, además del método Sanger, en la comprensión del espectro completo de la LML, ya que podría ofrecer una alternativa para la identificación etiológica y caracterización de condiciones genéticas raras en entornos clínicos. No se han descrito variantes en el exón 5 del gen HMGA2, y hasta ahora, tienen un significado incierto en la génesis de la FML. Se deben realizar estudios adicionales, que incluyan un número más significativo de individuos afectados y un análisis funcional de las nuevas variantes del gen HGMA2, para determinar mejor su función biológica en la LMF.