Conception expérimentale et prélèvement d’échantillons

L’expérience a été mise en place en 1982 dans le comté de Mengcheng, dans la province de l’Anhui, en Chine (33 ° 13’N, 116 ° 35’E, 42 m d’altitude) avec un sol noir typique de concrétion de chaux. La température annuelle est de 14,8 °C et les précipitations annuelles sont de 872 mm. Cinq traitements de fertilisation avec rotation des cultures blé-soja ont été comparés dans un plan en blocs complètement randomisé avec quatre répliques (chaque parcelle mesure 70 m2): (1) témoin, non fertilisation; (2) NPK, engrais chimiques NPK comprenant de l’urée (180 kg N ha – 1 an−1), du superphosphate (90 kg P2O5 ha − 1 an−1) et du chlorure de potassium (86 kg K2O ha−1 y−1); (3) NPK + WS, engrais chimiques NPK plus 7500 kg de blé paille ha − 1 an− 1; (4) NPK + PM, engrais chimiques NPK plus 15 000 kg de fumier de porc frais ha − 1 an− 1; (5) NPK + CM, engrais chimiques NPK plus 30 000 kg de fumier de vache fraîche ha − 1 an−1. Dans le traitement NPK + WS, toute la paille de blé a été renvoyée au champ, le fumier de porc dans le traitement NPK + PM et le fumier de vache dans le NPK + CM avaient la même quantité de carbone organique que la paille de blé ajoutée. De plus, ces types d’engrais contrastés inclus dans nos traitements de fertilisation ont différents niveaux de disponibilité pour les plantes et les microbes, par exemple, de plus labiles (fumier de porc) à plus récalcitrants (paille de blé et fumier de vache). Nous avons utilisé une large gamme de traitements de fertilisation visant à rendre nos résultats représentatifs et applicables à des pratiques de gestion contrastées.

Nous avons creusé autour du groupe de blé (contenant 30 à 40 plants de blé lors de la phase de remplissage du blé le 20 avril 2017) pour garder les systèmes racinaires aussi intacts que possible. Le sol de la rhizosphère qui adhérait étroitement aux racines a ensuite été brossé. Dans le même temps, la terre arable (0-15 cm de profondeur) a été collectée sous forme de sol en vrac à l’aide d’un carottier à tarière (à environ 20 cm des plantes). Le sol collecté a été tamisé à travers un maillage de 2 mm pour éliminer les impuretés telles que les racines et les pierres. Une partie du sol a été stockée à 4 ° C pour les analyses chimiques, et le reste a été stocké à – 40 ° C pour l’extraction de l’ADN.

Analyse physico-chimique du sol

Un pH-mètre (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Allemagne) a été utilisé pour mesurer le pH du sol à un rapport sol/eau distillée de 1:5 (poids /volume). L’humidité du sol a été déterminée par gravité en séchant 5 g de sol frais à environ 105-108 ° C pour atteindre un poids constant, puis en calculant le rapport pondéral (eau évaporée sur sol séché). Les teneurs totales en carbone (TC) et en azote total (TN) du sol ont été déterminées par combustion de sol séché à l’air à l’aide d’un analyseur CNS-2000 (LECO, St. Joseph, MI, USA), après tamisage du sol à travers un maillage de 0,15 mm. Les teneurs en phosphore total (TP) et en potassium total (TK) du sol ont été extraites après digestion HF-HClO4 et mesurées à l’aide de la méthode du bleu de molybdène et de la méthode de spectrophotométrie à la flamme (FP640, INASA, Chine), respectivement. Le carbone organique dissous (DOC) a été extrait en ajoutant 50 mL d’eau distillée à 5 g de terre fraîche, en agitant pendant 1 h, et en filtrant sous vide à travers un filtre en fibre de verre G4 avec un espace poreux de 1,2 µm (Fisher), puis les teneurs en carbone dans les extraits ont été déterminées par un analyseur de carbone organique total (multi N / C 3000, Analytik Jena, Allemagne). Le nitrate (NO3–N), l’ammonium (NH4+-N) et l’azote total dissous (DTN) ont été extraits à raison de 5 g de sol frais pour 50 mL 2 M de KCl. Après shacking pendant 1 h, les extraits ont été filtrés à travers un filtre en fibre de verre G4 avec un espace poreux de 1,2 µm (Fisher), puis un système analytique à flux continu (système San++, Skalar, Holland) a été utilisé pour analyser la teneur en NO3–N, NH4 +-N et DTN. L’azote organique dissous (DON) a été calculé en utilisant la formule suivante : DON = DTN−NH4+-N−NO3– N. Le phosphore disponible (AP) dans le sol a été extrait par 0.5 M NaHCO3 et déterminé en utilisant la méthode du bleu de molybdène. Le potassium disponible (AK) a été extrait par 1 M d’acétate d’ammonium et déterminé par photomètre à flamme (FP640, INASA, Chine) (Dossier supplémentaire 3: Annexe 1).

Détermination des taux de fixation de l’azote

La méthode de marquage au 15N2 est l’une des méthodes les plus courantes et les plus largement utilisées pour mesurer les taux de fixation de l’azote. Cinq grammes de terre ont été placés dans des tubes de 18 × 150 mm et l’espace de tête a été remplacé par de l’air synthétique contenant 80% de 15N2 et 20% d’O2. Les contrôles ont été remplis de gaz N2 non marqué et traités en parallèle. Les tubes ont été incubés horizontalement dans l’obscurité à température ambiante pendant 22 jours. Le % d’atomes 15N des échantillons de sol a été déterminé à l’aide d’un spectromètre de masse à rapport isotopique stable (Flash 2000 HT / Conflo IV / Delta V, Thermo Fisher Scientific, Allemagne). Ensuite, nous avons calculé le taux de fixation du potentiel net de N en comparant la différence de 15N total dans les sols recevant 15N2 par rapport au contrôle.

Séquençage à haut débit et analyse bioinformatique

Pour l’extraction de l’ADN, 0.5 g de terre fraîche ont été utilisés avec le kit Fast DNA SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). Les gènes nifH ont été amplifiés à l’aide de paires d’amorces nifH-F/ nifH-R (5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′) / (5′-TTGTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′). Des réactions de PCR ont été effectuées dans une réaction de 20 µL contenant 4 µL de tampon FastPfu 5 ×, 2 µL de dNTPs 2,5 mM, 0,8 µL d’amorce directe 5 µM, 0,8 µL d’amorce inverse 5 µM, 0,4 µL de polymérase fastPfu, 10 ng d’ADN modèle et de l’eau distillée double (ddH2O). L’amplification a été réalisée à 95 °C pendant 3 min, avec 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 45 s, et l’extension à 72 °C pendant 10 min. Les amplicons de PCR ont été purifiés par Kit de purification d’ADN en gel d’Agarose (TaKaRa Bio), et des amplifications de PCR en trois exemplaires pour chaque échantillon ont été réalisées et regroupées sous forme de produit de PCR, puis séquencées sur la plate-forme d’Illumina MiSeq PE300 (Société Majorbio à Shanghai, Chine). Après séquençage, les séquences nucléotidiques nifH ont été analysées à l’aide du pipeline QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/). Tout d’abord, les séquences de faible qualité (celles avec un score de qualité < 20, contenant des nucléotides ambigus, ou ne correspondant pas à l’amorce et au code-barres) ont été supprimées et les séquences restantes ont été converties en séquences d’acides aminés en utilisant le pipeline de Fungènes du projet de base de données Ribosomale. Les séquences codant pour des protéines qui ne correspondaient pas à la séquence de la protéine nifH ou qui contenaient des codons de terminaison ont été éliminées. Les séquences restantes ont été alignées sur la base de données de gènes nifH, supprimant à la fois les séquences échouées et chimériques. Les séquences de haute qualité restantes ont été regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) avec une similitude de 95% avec UCLUST fonctionnant en mode de novo, et toutes les OTU singleton ont été supprimées.

Analyse du réseau de cooccurrence

Nous avons construit un réseau de cooccurrence avec tous les échantillons (rhizosphère et sol en vrac) et identifié les principaux groupes écologiques d’OTU fortement associés. Les OTU les plus élevés, représentant plus de 80 % de l’abondance relative de l’ensemble de la communauté, ont été choisis. Toutes les corrélations de Spearman par paires entre OTU ont été calculées et les corrélations avec un coefficient de Spearman inférieur à 0,65 et une valeur de P supérieure à 0,01 ont été supprimées. Cela nous a permis de nous concentrer uniquement sur les OTU qui ont fortement co-eu lieu et étaient plus susceptibles d’interagir les uns avec les autres. Les principaux modules (clusters écologiques) du réseau ont été visualisés à l’aide de Gephi (https://gephi.org/). L’abondance relative de chaque amas écologique a été calculée en faisant la moyenne des abondances relatives normalisées (score z) des espèces qui lui appartenaient (fichier supplémentaire 3: Annexe 3).

Analyse statistique

Des tests ANOVA et t par paires ont été utilisés pour comparer les variables du sol, les taxons microbiens dominants et la diversité alpha microbienne entre différents traitements de fertilisation (fichier supplémentaire 3: Annexe 1). Ces tests ont été mis en œuvre à l’aide du SPSS 21. Le test Mantel a été utilisé pour analyser les corrélations entre la communauté diazotrophe et les propriétés physico-chimiques (fichier supplémentaire 3 : Annexe 2). Cela a été réalisé à l’aide du package ”vegan » dans R × 32 (3.2.2). Une analyse des coordonnées principales (PCoA) a été utilisée pour trouver des différences significatives dans les communautés diazotrophes entre les groupes d’échantillonnage (fichier supplémentaire 3 : Annexe 2). Le PCoA a été réalisé à l’aide du package ”labdsv » R × 32(3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

Analyses phylogénétiques

Le gène nifH fournit une résolution phylogénétique suffisante dans les études écologiques. L’arbre phylogénétique des 481 phylotypes diazotrophes dominants des grappes écologiques a été construit à l’aide de FastTree et visualisé à l’aide de GraPhlAn. La théorie de l’échantillonnage phylogénétique peut être utilisée de manière analytique (en supposant que l’échantillonnage aléatoire de l’arbre phylogénétique est la diversité phylogénétique prédite dans une communauté locale, puis en comparant la diversité phylogénétique observée avec ces prédictions) pour déterminer le degré auquel la communauté diazotrophe apparaît aléatoire (entre −2 et +2), sur-dispersée (au−dessus de + 2) ou groupée (en dessous de -2). La théorie de l’échantillonnage phylogénétique a été réalisée en utilisant le paquet R « picante”. Un avantage de l’échantillonnage aléatoire de l’arbre phylogénétique régional est qu’il peut être utilisé pour comparer des échantillons de tailles inégales sur la base du modèle d’échantillonnage binomial. Les différences entre la diversité phylogénétique observée et attendue ont été déterminées en calculant et en comparant les z-scores pour chaque groupe écologique. Lorsque la diversité phylogénétique observée est inférieure à la diversité attendue (inférieure à − 2), la communauté microbienne du groupe écologique est considérée comme étant phylogénétiquement groupée, ce qui signifie que les taxons étroitement apparentés sont plus susceptibles d’être échantillonnés et sélectionnés activement par l’environnement.

Analyse de modélisation d’équations structurelles

La MEB a été réalisée à l’aide d’IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL : Amos Development Corporation). Il a été utilisé pour évaluer les effets directs et indirects des propriétés physico-chimiques du sol et de l’abondance relative des principaux amas écologiques sur les taux de fixation de l’azote. Les propriétés physiochimiques du sol comprenaient le pH du sol, le carbone total, l’azote total et le phosphore total. Dans le modèle, les traitements (contrôle, NPK, NPK + WS, NPK + PM et NPK + CM) étaient des variables catégorielles à deux niveaux : 1 (un traitement particulier) et 0 (les traitements considérés restants). De plus, l’amorçage a été utilisé pour tester la probabilité que les coefficients de chemin diffèrent de zéro, car quelques-unes des variables n’étaient normalement pas distribuées. Nous avons également calculé les effets totaux normalisés (ETS) des propriétés du sol, des traitements de fertilisation et de l’effet de la rhizosphère sur le taux de fixation de l’Azote pour faciliter l’interprétation du MEB.

Analyse de modélisation aléatoire des forêts

La régression aléatoire des forêts (package R « randomForest ») a été utilisée pour régresser les OTU normalisées dans différents traitements. La méthode de validation croisée de 10 fois a été utilisée pour déterminer l’ensemble optimal d’OTU corrélé aux taux de fixation de N. Des listes classées d’OTU par ordre de Forêts aléatoires signalées ont été obtenues en fonction de l’augmentation de l’erreur quadratique moyenne des taux de fixation de l’azote prédits sur 100 itérations de l’algorithme. Les OTU de 50 marqueurs ont été choisis en fonction des erreurs moyennes quadratiques moyennes minimales de validation croisée, qui ont été obtenues à partir de cinq essais de validation croisée de 10 fois.