Introduction

La Lipomatose multiple familiale (LFM, OMIM% 151 900) est un trouble autosomique dominant rare de l’hypoderme caractérisé par le développement de nodules sous-cutanés bien encapsulés sur les extrémités et le tronc.1 Les premiers rapports de tumeurs adipocytaires multiples ont été faits depuis 1846 par Sir Benjamin Brodie.2 Les résultats ultérieurs de Blaschko (1891) et d’Alsberg (1892) ont démontré une récurrence familiale des lésions et ont observé une incidence accrue chez les hommes.1,3,4 Au cours des années suivantes, de nombreux autres auteurs ont publié des familles avec des caractéristiques très suggestives de la LFM, 1, 5, 6 et finalement, en 1970, Das Gupta a classé les tumeurs lipomateuses en trois catégories: solitaires ou sporadiques, LFM et Lipomatose symétrique multiple (LMS).7,8

Les lipomes solitaires sont considérés comme le néoplasme bénin le plus fréquent des tissus mous chez l’adulte, mais des lipomes multiples surviennent chez 5% des individus.9,10 La prévalence exacte de la LF est inconnue, mais elle a été estimée à 0,002%.8,11,12 L’apparition des nodules à l’âge se situe entre 30 et 40 ans, atteignant le maximum maximal aux années 50.6,8,13,14 Il a été largement admis que ce trouble présentait une préférence pour les hommes, cependant, un grand nombre de travaux démontrent que les deux sexes sont également affectés.15-17 Bien qu’elle soit considérée comme une maladie bénigne, des problèmes esthétiques peuvent apparaître chez certaines personnes, altérant leur qualité de vie. De plus, il est également répandu chez les personnes obèses.9

Jusqu’à présent, les recherches disponibles dans la LF ont été explicitement axées sur les aspects cliniques, et les questions moléculaires ne sont généralement pas étudiées. La littérature suggère qu’au moins 70% des lipomes sporadiques résultent de réarrangements cytogénétiques impliquant la bande 12q13-15, ce qui pourrait conduire à une expression dérégulée du gène HMGA2 (High Mobility Group AT-hook 2). Ce gène code pour les protéines de chromatine non histones responsables des changements conformationnels de l’ADN, de la prolifération cellulaire aberrante et du développement de tumeurs mésenchymateuses bénignes.18-20

La reconnaissance de la base moléculaire des conditions génétiques et la mise en œuvre de technologies de séquençage à haut débit ont permis d’explorer et d’élucider d’autres mécanismes impliqués dans l’étiologie de plusieurs génodermatoses. Par conséquent, cette étude visait à effectuer une caractérisation clinique et moléculaire de sept individus atteints de LF afin de détecter des variants dans six gènes candidats liés à la lipomatose à l’aide de techniques de séquençage Sanger et de séquençage de nouvelle génération (NGS).

Matériaux et méthodes

Patients et Aspects éthiques

Cette recherche a été menée dans le respect des principes de la Déclaration d’Helsinki. L’approbation a été obtenue auprès du Comité de Révision Institutionnel avant l’étude (Comité d’Éthique de la Recherche au FCM-UNICAMP, dossier N° 1.313.164) et tous les participants ont donné leur consentement écrit et éclairé. Nous avons mené l’étude dans la clinique externe du service de génétique médicale de l’Hôpital clinique de l’Université de Campinas (HC-UNICAMP) à São Paulo, au Brésil. Au total, sept personnes appartenant à cinq familles non apparentées (nommées de A à E) étaient admissibles. Les principaux critères d’inclusion pour la sélection des sujets étaient les suivants: i) âge supérieur à 18 ans, ii) diagnostic clinique et histopathologique de lipome ou d’angiolipome et iii) récidive familiale suggérant une transmission autosomique dominante. Les principaux aspects cliniques ont été recueillis à partir des dossiers médicaux à l’aide d’un formulaire structuré. L’évaluation physique a impliqué la participation de spécialités dermatologues et généticiennes. Le service de pathologie de HC-UNICAMP a fourni les échantillons histopathologiques. Les résultats cliniques sont détaillés dans le tableau 1.

Tableau 1 Résumé clinique des patients atteints de LML

Séquençage de Sanger du gène HMGA2

L’ADN génomique a été extrait d’échantillons sanguins périphériques de l’EDTA de sept patients selon la procédure conventionnelle phénol-chloroforme utilisée par Sambrook et al21

Une réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été réalisée pour amplifier cinq régions de jonctions d’exons codants et d’introns-exons du HMGA2 gène. En utilisant deux outils bioinformatiques en ligne, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) et OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), nous avons conçu la paire spécifique d’amorces, comme résumé dans le tableau 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) en suivant les instructions du fabricant. Les chromatogrammes ont été examinés à l’aide des Chromas v.2.6.5. Les résultats ont été comparés au numéro de transcription de l’ensemble HMGA2 ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Nous avons vérifié les nouvelles variantes dans trois jeux de données publics: i) Le réseau de balises de l’Alliance Mondiale pour la Génomique et la Santé (GA4GH) (https://beacon-network.org/#/), ii) Le Consortium d’agrégation d’Exomes (http://exac.broadinstitute.org/) et, iii) Archive en ligne des Mutations brésiliennes (http://abraom.ib.usp.br/). Pour évaluer les scores de pathogénicité et les effets de dommages de nouveaux variants dans le gène candidat HMGA2, nous avons utilisé différents modèles de prédiction in silico tels que VEP (Variant Effect Predictor), 22 FATHMM (Analyse fonctionnelle à travers des modèles de Markov Cachés), 23 UMD-predictor, 24 SIFT (Tri des Intolérants de Tolérants), 25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), 26 et Mutation Taster.27

Panel Multi-gènes cible

Un panel personnalisé a été réalisé pour évaluer les gènes impliqués dans la lipomatose syndromique. Pour réaliser cette technique, nous avons obtenu de l’ADN génomique à partir d’échantillons de salive de cinq patients (A, B, C, D et E) à l’aide du kit d’auto-collecte d’ADN Oragene® (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Canada). Les échantillons ont ensuite été enrichis et hybridés contre des séquences spécifiques à la cible. La capture a été réalisée à l’aide d’un séquenceur Illumina® MiSeq (Truseq Capture) de nouvelle génération en mode de fin d’appariement 150bp selon le protocole standard de cette plate-forme. La profondeur de couverture des régions cibles était supérieure à 50x. L’enrichissement et l’analyse ont été axés sur les séquences codantes de cinq transcrits (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 et PTEN NM_000314.4), 10bp de séquences introniques et d’autres régions vraisemblablement responsables de la maladie. Les suppressions exoniques, les duplications et les variations du site d’épissure ont également été prises en compte au cours de l’enquête. Les lectures ont été alignées et comparées avec la référence du génome humain (GRCh37). L’amplification par sonde multiplex dépendante de la ligature (MLPA) a été choisie pour valider les variantes mentionnées par Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

Disponibilité des données

Des séquences ont été soumises à GenBank (numéro d’accession: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Les jeux de données liés à cet article sont disponibles à l’Institut Européen de Bioinformatique EMBL-EBI via le référentiel ENA avec le numéro d’acquisition de l’étude PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

Résultats

Analyse clinique

Sept personnes de cinq familles non apparentées (A, B1, B2, C, D1, D2 et E) ont été incluses, comme illustré à la figure 1. Nous n’avons pas identifié de consanguinité parentale entre les participants. L’origine ethnique a été autodéclarée comme mélangée par chaque échantillon. Dans un aperçu général, les familles A et B ont été observées avec trois générations successives ou plus impliquées. Le sex-ratio hommes/femmes a été estimé à 1:6. L’âge moyen à l’inclusion était de 42 ans (ET 11,8), tandis que l’âge moyen d’apparition des lésions était de 28 ans (ET 11,8). Les femelles ont signalé un pic d’incidence de nodules après leur grossesse. Les caractéristiques cliniques classiques de la LCF comprenaient des nodules mous très variables en nombre et en taille, situés dans la graisse sous-cutanée et confinés au tronc et aux extrémités, comme illustré à la figure 2. Une gêne et une sensibilité marquée à la palpation n’ont été remarquées que chez l’individu A. Des troubles gastro-intestinaux comorbides étaient présents chez les patients A, C et D2. Ils ont signalé une diverticulite et des polypes, une constipation chronique sévère et un cancer colorectal respectivement. Quatre patients ont subi une évaluation histologique des lésions sous-cutanées. La présence d’adipocytes matures arrondis par de nombreux capillaires a confirmé le diagnostic d’angiolipome, tel que référencé par Bancroft et Fletcher et al10,28 (Figure 2). D’autres constatations pertinentes sont décrites dans le tableau 1.

Figure 1 Aperçu des pedigrees des familles étudiées (A–E). Remarquez comment les femelles et les mâles sont également impliqués et le modèle d’héritage autosomique dominant avec près de deux générations successives affectées. La famille A avait le plus grand nombre de générations développant des lipomes multiples (a). Le proband A (III 2) était le seul au sein de son groupe familial et dans la casuistique à référer la douleur lors de l’examen (a). Les flèches indiquent les probands.

Figure 2 Caractéristiques cliniques de la LF et aspects histopathologiques des lipomes (coloration HE (10×). Les principaux résultats comprennent des nodules mous, mobiles et indolores circonscrits, situés dans la graisse sous-cutanée. La distribution topographique la plus courante comprend les membres supérieurs (A, B et D), la paroi abdominale antérieure, le dos et les cuisses (C). Le lipome présente généralement un motif lobulé d’adipocytes blancs avec des noyaux uniformes et une capsule fibreuse mince (E). Les angiolipomes sont composés de graisse mature en association avec de nombreux petits vaisseaux sanguins, qui sont principalement des capillaires. Les thrombus de fibrine (flèches) sont très fréquents (F). Images gracieuseté du Département de Pathologie et de Génétique Médicale, École des Sciences Médicales, UNICAMP.

Moléculaire

Le séquençage de Sanger a révélé deux nouveaux variants dans l’exon 5 du gène HMGA2. Les deux variantes ont été identifiées chez les patients A et B1. La première était une variante hétérozygote synonyme c.327C > T p. (Asp=) considérée comme à faible impact ou neutre, basée sur plusieurs outils de prédiction (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). En revanche, la deuxième altération était un changement non-sens variant hétérozygote c.328T > C (p. *110Glnext *16) qui provoque une substitution de codon stop par l’acide aminé glutamine et l’extension ultérieure de la protéine finale (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). La figure 3 schématise la structure du gène HMGA2, les domaines de liaison aux protéines et les nouveaux variants.

Figure 3 Structure du gène humain HMGA2. (A) Situé sur 12q14.3, le gène HMGA2 s’étend sur plus de 140 kb et englobe cinq exons. Les exons 1, 2 et 3 (boîtes bleues) codent pour un domaine AT-hook (cercles bleus). Le quatrième exon (lilas) code pour une région d’espacement. L’exon 5 (boîte rose) code le domaine C-terminal de la protéine de 109 acides aminés. (B) Électrophérogramme des patients A, B1 et référence. Deux nouvelles variantes identiques ont été trouvées chez ces patients. Une variante hétérozygote synonyme c. 327C >T (p.Asp=) et une variante hétérozygote sans changement c.328T > C (p.*110Glnext*16).

Le variant c.328T >C (p.*110Glnext*16) a été défini comme 100% pathogène ou à fort impact selon les algorithmes mentionnés dans silico. Cependant, le système de prédiction des dégustateurs de mutations a démontré une divergence entre les deux variantes décrites, comme indiqué dans le tableau 3. Le panel multi-gènes ciblé d’AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA et PTEN dans les familles A, B, C, D et E n’a pas détecté de changements délétères dans les séquences évaluées.

Tableau 3 Variantes Trouvées chez les Individus A et B1 et Comparaison entre les Outils de prédiction

Discussion

La présente étude visait à identifier les bases moléculaires de la LF par l’intégration de techniques de séquençage modernes telles que le séquençage de Sanger et le NGS combinés à des approches cliniques traditionnelles.

À la suite d’études antérieures, la présente recherche montre quelques divergences concernant les données épidémiologiques. Nous avons observé qu’il existe une idée fausse commune sur la classification et le diagnostic des différents types de lipomatose.7,10,15 Plusieurs auteurs soulignent que les hommes ont une forte tendance à présenter des lipomes multiples, 11, 29, 30 Cependant, nos résultats montrent une fréquence apparente élevée de LMC chez les femmes. Il est possible que cette constatation reflète simplement un biais de sélection dû à la petite taille de l’échantillon, ou peut également s’expliquer par le fait que les femmes sont plus susceptibles de consulter un médecin pour des raisons esthétiques.31 Néanmoins, les pedigrees indiquent que la proportion d’individus touchés chez les deux sexes était similaire, conduisant à un sex-ratio proche de 1:1 (10 hommes contre 13 femmes), ce qui peut sous-estimer la prévalence réelle de la LF.6,8,16 Fait intéressant, le nombre total de lipomes notés chez les femmes était plus élevé que chez le seul homme examiné.1,14

Des facteurs tels que le surpoids et la croissance exacerbée des nodules pendant et après la grossesse suggèrent que des facteurs exogènes (alimentation), des modifications métaboliques (dyslipidémie ou altération de la désaturation des acides gras) et des mécanismes hormonaux peuvent être impliqués dans l’hyperplasie adipocytaire.32,33 Yee et al ont comparé les différences de désaturation enzymatique du stéaroyl-CoA entre les individus atteints de troubles adipeux rares (RAD) et le groupe témoin obèse et ont conclu que les individus atteints de LCF et d’obésité présentaient les taux de désaturation les plus élevés, augmentant ainsi le processus de lipogenèse.32,34

Une conclusion inattendue a été que la patiente A était la seule du groupe casuistique et de sa famille à manifester de la douleur, une faiblesse quotidienne, de la fatigue et une comorbidité psychiatrique (dépression chronique et trouble anxieux). Ces symptômes sont fortement associés à la maladie de Dercum, considérée comme un diagnostic différentiel ou une variante de la LCF.35 Sur la base de la nouvelle classification de la maladie de Dercum proposée par Hansson et al.36, nous avons identifié chez ce patient la forme nodulaire généralisée, caractérisée par une douleur intense à la surface du tissu adipeux et autour des lipomes. Une autre étude qui soutient cette hypothèse a été publiée par Campen et al37 Ils ont décrit une famille de neuf membres diagnostiqués avec des lipomes multiples qui présentaient des symptômes variables allant de l’invalidité totale aux nodules asymptomatiques. On peut donc supposer que la ségrégation suit un schéma autosomique dominant à expressivité variable et représente éventuellement une manifestation extrême de la LFP.

Concernant le diagnostic histopathologique, nous avons mis en évidence deux types principaux: le lipome et l’angiolipome. Au microscope, la caractéristique notable la plus courante de l’angiolipome est la prolifération de vaisseaux sanguins fins contenant des microthrombes de fibrine en association avec des adipocytes matures.10,28 Les angiolipomes semblent avoir une incidence élevée chez les jeunes hommes adultes qui manifestent parfois une légère douleur ou une sensibilité. Ce type de tumeur est également lié aux antécédents de traumatisme local ou à l’utilisation de la thérapie par les stéroïdes.13,38 Bien que de nombreux auteurs reconnaissent les deux diagnostics comme des entités pathologiques différentes, certains rapports de cas ne font pas cette distinction en raison de différences très subtiles entre eux.39 Dans ce contexte, notre analyse confirme qu’il est possible d’avoir des angiolipomes avec récurrence familiale et que ces diagnostics pourraient faire partie du large spectre de la LFP.40-43 De plus, des lipomes à cellules multiples du fuseau, un autre type de lipome, ont également été rapportés dans plusieurs familles.44

Bien qu’il existe plusieurs études axées sur l’expression et l’analyse cytogénétique directe sur les lipomes sporadiques, peu d’études se sont préoccupées des causes constitutionnelles de la LF.2 De nombreuses séries de lipomes chez l’adulte confirment de multiples réarrangements structurels avec des fréquences allant de 50 à 75%.10,28,45 Parmi ces altérations chromosomiques équilibrées, la translocation t(3; 12) (q27-28; q13-15) est observée dans près de 25% des tumeurs.9 Dans la plupart des cas, le point d’arrêt affecte le gène HMGA2 qui est composé de 5 exons et génère une protéine de 109 acides aminés (Figure 3).18,46,47 Ligon et al ont rapporté le cas d’un garçon de huit ans présentant un réarrangement constitutionnel affectant la bande 12q14.3 (inversion péricentrique de novo) impliquant donc le gène HMGA2. Cependant, le phénotype clinique caractérisé par une prolifération somatique, l’avancement de l’âge osseux et dentaire, une tumeur cérébelleuse et des lipomes multiples,48 diffère de notre casuistique.

Nous avons analysé les variants hétérozygotes c.327C >T p. (Asp=) et c.328T >C (p.*110Glnext*16) de l’exon 5 du gène HMGA2 dans divers programmes de prédiction. L’altération synonyme ou silencieuse a été interprétée comme bénigne, alors que la modification du codon d’arrêt de traduction a été considérée comme 100% pathogène ou à fort impact. De cette façon, cela pourrait indiquer que des changements impliquant la région 3ʹ UTR (non traduite) déclencheraient la transformation néoplasique du gène HMGA2.49 Fusco et al ont mis en évidence le rôle crucial du gène HMGA2 dans les tumeurs mésenchymateuses. Ils ont proposé que dans le gène HMGA2, la région 3ʹ UTR soit généralement réduite au silence par le miARN Let-7 et que toute altération à ce niveau, qu’elle soit tronquée ou fusionnée avec des séquences ectopiques, entraîne sa régulation ascendante et par conséquent une réplication anormale des cellules.46

Il est quelque peu surprenant que dans la famille B, nous n’ayons détecté les deux nouvelles variantes que chez la mère (B1). Cela pourrait indiquer qu’ils ne se séparent pas du phénotype de la LML, étant écartés au moins dans cette famille comme cause étiologique. D’autre part, le patient A a présenté les deux mêmes variantes nouvelles mais a démontré un phénotype très évocateur de la maladie de Dercum. Malgré ces résultats prometteurs, ils sont quelque peu difficiles à interpréter car il n’a pas été possible d’évaluer d’autres parents atteints de LML.

Une infiltration graisseuse focale et des lipomes multiples peuvent être présents dans plusieurs syndromes. Le syndrome de Proteus et les clous de GIROFLE (Prolifération asymétrique lipomateuse congénitale, malformations vasculaires, naevus épidermiques, Anomalies squelettiques et spinales) sont des exemples de mutations somatiques où la lipomatose est présente.50,51 D’autre part, le syndrome de Bannayan-Riley-Rubacalva, la Néoplasie endocrinienne multiple de type 1, le syndrome de Cowden et le syndrome de Gardner sont des affections résultant de mutations de la lignée germinale qui présentent une lipomatose concomitante.52-55 Même certaines mutations impliquant la fonction mitochondriale sont liées à une croissance anormale du tissu adipeux principalement dans la partie supérieure du tronc et du cou et le meilleur exemple est la maladie de Madelung.56 Cependant, le panel négatif d’AKT1, d’APC, de MEN-1, de PIK3CA et de PTEN exclut qu’ils soient responsables du phénotype FML, du moins dans cette recherche.

Conclusion

La LML est une maladie rare et hétérogène qui peut se chevaucher avec d’autres syndromes dermatologiques tels que la maladie de Dercum. L’histoire naturelle de la LF dans cette série a révélé que le développement des lésions était progressif et atteignait son incidence la plus élevée chez les individus d’âge moyen. La LF affecte les deux sexes et présente une distribution topographique avec prédominance dans les extrémités et le tronc. Le sex-ratio chez les patients évalués a montré une prévalence féminine, mais les données de pedigree ont montré une distribution plus équilibrée. Le diagnostic de la maladie de Dercum a également été reconnu chez un individu (patient A).

L’approche moléculaire a fourni un aperçu plus approfondi de la base génétique de la LFM et a tenté d’étudier en profondeur le plus grand nombre de gènes candidats qui lui sont liés. Nous avons souligné l’utilité du NGS en plus de la méthode de Sanger dans la compréhension de l’ensemble du spectre de la LF, car il pourrait offrir une alternative pour l’identification étiologique et la caractérisation de conditions génétiques rares en milieu clinique. Les variants de l’exon 5 du gène HMGA2 n’ont pas été décrits, et jusqu’à présent, ils ont une signification incertaine dans la genèse de la LFM. D’autres études, y compris un nombre plus important d’individus affectés et une analyse fonctionnelle des nouveaux variants du gène HGMA2, devraient être entreprises pour mieux déterminer sa fonction biologique dans la LFR.