Johdanto

familiaalinen Monilipomatoosi (FML, OMIM% 151,900) on harvinainen autosomaalinen monilipomatoosi, jolle on ominaista hyvin kapseloitujen ihonalaisten kyhmyjen kehittyminen raajoissa ja rungossa.1 ensimmäiset raportit useista adipocytic kasvaimia tehtiin vuodesta 1846 Sir Benjamin Brodie.2 myöhemmin tulokset Blaschko (1891), ja Alsberg (1892) osoitti familiaalinen toistuminen leesiot ja havaittu lisääntynyt esiintyvyys miehillä.1,3,4 seuraavina vuosina, monet muut kirjoittajat julkaistu perheet, joilla on ominaisuuksia erittäin viittaavia FML, 1, 5, 6 ja lopulta vuonna 1970 Das Gupta luokiteltu lipomatous kasvaimia kolmeen luokkaan: yksinäinen tai sporadinen, FML ja useita Symmetric Lipomatosis (MSL).7,8

yksinäisiä lipoomia pidetään aikuisten yleisimpinä pehmytkudosten hyvänlaatuisina kasvaimina, mutta useita lipoomia esiintyy 5%: lla yksilöistä.9,10 FML: n tarkkaa esiintyvyyttä ei tiedetä, mutta sen on arvioitu olevan 0, 002%.8,11,12 Ikä-puhkeamista kyhmyt on välillä 30 ja 40 vuotta, saavuttaa suurin huippu 50s.6,8,13,14 se on laajalti katsottu, että tämä häiriö näytteille mieluummin miehillä, kuitenkin suuri määrä teoksia osoittaa, että molemmat sukupuolet ovat yhtä vaikuttaa.15-17 vaikka sitä pidetään hyvänlaatuisena sairautena, joillakin yksilöillä saattaa esiintyä kosmeettisia huolenaiheita, jotka heikentävät heidän elämänlaatuaan. Lisäksi se on myös yleistä lihavilla henkilöillä.9

tähän mennessä saatavilla oleva FML: n tutkimus on keskittynyt nimenomaan kliinisiin näkökohtiin, eikä molekyylikysymyksiä yleensä tutkita. Kirjallisuuden mukaan ainakin 70% satunnaisista lipoomista johtuu sytogeneettisistä uudelleenjärjestelyistä, joihin liittyy 12q13-15-kaista, mikä voi johtaa hmga2-geenin (High Mobility Group AT-hook 2) vapauttavaan ilmentymiseen. Tämä geeni koodaa ei-histoneja kromatiiniproteiineja, jotka ovat vastuussa DNA: n konformaatiomuutoksista, poikkeavien solujen proliferaatiosta ja hyvänlaatuisten mesenkymaalisten kasvainten kehittymisestä.18-20

geneettisten sairauksien molekyylipohjan tunnustaminen ja suurikapasiteettisten sekvensointitekniikoiden käyttöönotto on mahdollistanut muiden mekanismien tutkimisen ja selventämisen, jotka liittyvät useiden genodermatoosin etiologiaan. Siksi tässä tutkimuksessa pyrittiin tekemään kliininen ja molekyylitason karakterisointi seitsemälle FML: ää sairastavalle henkilölle, jotta löydettäisiin variantteja kuudesta lipomatoosiin liittyvästä kandidaattigeenistä Sanger-ja seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoilla (NGS).

materiaalit ja menetelmät

potilaat ja eettiset näkökohdat

Tämä tutkimus tehtiin Helsingin julistuksen periaatteiden mukaisesti. Hyväksyntä saatiin Institutional Review Board ennen tutkimusta (Tutkimuseettisen komitean FCM-UNICAMP, tiedosto n° 1.313.164) ja kaikki osallistujat antoivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Teimme tutkimuksen lääketieteellisen genetiikan poliklinikalla Campinasin yliopiston kliinisessä sairaalassa (HC-UNICAMP) São Paulossa Brasiliassa. Tukikelpoisia oli yhteensä seitsemän henkilöä, jotka kuuluivat viiteen sukuun (jotka nimettiin A: sta E: hen). Ensisijaiset kriteerit koehenkilöiden valinnassa olivat seuraavat: i) yli 18 vuoden ikä, ii) lipooman tai angiolipooman kliininen ja histopatologinen diagnoosi ja iii) familiaalinen uusiutuminen, joka viittaa autosomaalisen dominantin periytymiseen. Tärkeimmät kliiniset näkökohdat koottiin potilastiedoista jäsennellyllä lomakkeella. Fyysiseen arviointiin osallistui sekä ihotautilääkäreitä että geneetikkoja. HC-UNICAMPIN patologian osasto toimitti histopatologiset näytteet. Kliiniset löydökset esitetään yksityiskohtaisesti taulukossa 1.

Taulukko 1 kliininen Yhteenveto FML: ää sairastavista potilaista

Sanger-sekvensointi hmga2-geenin

genomi-DNA uutettiin seitsemän potilaan perifeerisestä EDTA-verinäytteestä Sambrook et al21

polymeraasiketjureaktion (PCR) mukaisesti. hmga2: n viiden koodaavan eksonin ja intron-eksonin liitosalueiden vahvistamiseen geeni. Käyttämällä kahta online-bioinformatiikkatyökalua, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) ja OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), suunnittelimme tietyn pohjustusparin, kuten taulukossa 2 on tiivistetty.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kromatogrammit tutkittiin Kromas v. 2.6.5-menetelmällä. Tuloksia verrattiin HMGA2 Ensemblin transkriptionumeroon ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Tarkistimme uudet vaihtoehdot kolmesta julkisesta aineistosta: I) Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) ja iii) online Archive of Brazilian Mutations (). Arvioidaksemme hmga2-geenin uusien varianttien patogeenisyyspisteitä ja vauriovaikutuksia, käytimme erilaisia silico-ennustemalleja,kuten VEP (variant Effect Predictor), 22 FATHMM (funktionaalinen analyysi piilotettujen Markov-mallien kautta), 23 UMD-predictor,24 SIFT (Lajittelu intolerantti Siedettävästä), 25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), 26 ja Mutaatiomaistaja.27

Kohdemonigeenipaneeli

oma paneeli suoritettiin syndromiseen lipomatoosiin liittyvien geenien arvioimiseksi. Tätä tekniikkaa varten hankimme viiden potilaan (A, B, C, D ja E) sylkinäytteistä genomisen DNA: n oragene® DNA-keräyspaketin (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Kanada). Näytteet rikastettiin ja hybridisoitiin kohdesekvenssejä vastaan. Kaappaus tehtiin seuraavan sukupolven Illumina® MiSeq (TruSeq Capture)-sekvensserillä 150bp: n parilopputilassa tämän Alustan standardiprotokollan mukaisesti. Kohdealueiden peittävyyden syvyys oli yli 50x. rikastus ja analyysi keskittyivät viiden transkriptin koodaussekvensseihin (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038. 5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 ja PTEN NM_000314.4), 10bp intronisia sekvenssejä ja muita oletettavasti taudin aiheuttavia alueita. Tutkimuksessa otettiin huomioon myös eksoniset poistot, kaksoiskappaleet ja liitoskohdan vaihtelut. Readit linjattiin ja niitä verrattiin human genome referenceen (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (mlpa) valittiin validoimaan variantit, kuten invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #) mainitsi.

tietojen saatavuus

sekvenssit toimitettiin Genbankille (liittymisnumero: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Tähän artikkeliin liittyvät tiedot ovat saatavilla Euroopan Bioinformatiikkainstituutista EMBL-EBI: stä ena-tietokannan kautta, jonka liittymisnumero on PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

tulokset

kliininen analyysi

seitsemän yksilöä viidestä toisistaan riippumattomasta perheestä (A, B1, B2, C, D1, D2 ja E), kuten kuvassa 1 esitetään. Emme tunnistaneet vanhempien verisukulaisuutta osallistujien välillä. Etninen alkuperä raportoitiin itse kunkin probandin sekoittamana. Yleiskatsauksessa havaittiin, että suvuissa A ja B oli mukana kolme peräkkäistä tai useampaa sukupolvea. Miesten ja naisten sukupuolisuhteeksi arvioitiin 1: 6. Hoidon aloittamisajankohdan keski-ikä oli 42 vuotta (SD 11, 8) ja leesioiden alkamisajankohdan keski-ikä 28 vuotta (SD 11, 8). Naiset raportoivat kyhmyjen esiintymistiheyden huipun raskauden jälkeen. FML: n klassisia kliinisiä piirteitä olivat pehmeät kyhmyt, joiden lukumäärä ja koko vaihtelivat suuresti ja jotka sijaitsivat ihonalaisessa rasvakudoksessa ja rajoittuivat runkoon ja raajoihin, kuten kuvassa 2 esitetään. Epämukavuutta ja tuntuvaa arkuutta tunnustelulle havaittiin vain yksittäisillä A: lla.samanaikaisia ruoansulatuskanavan häiriöitä esiintyi potilailla A, C ja D2. He raportoivat divertikuliitista ja polyypeista, vaikeasta kroonisesta ummetuksesta ja kolorektaalisyövästä. Neljälle potilaalle tehtiin histologinen tutkimus ihonalaisista leesioista. Lukuisten kapillaarien pyöristämien kypsien adiposyyttien läsnäolo vahvisti angiolipomadiagnoosin,johon Bancroft ja Fletcher et al10, 28 viittaavat (kuva 2). Muut asiaan liittyvät havainnot on kuvattu taulukossa 1.

kuva 1 yleiskatsaus tutkittujen perheiden sukutauluista (A–E). Huomaa, miten naiset ja miehet ovat yhtä mukana ja autosomaalinen hallitseva perintö malli lähes kaksi peräkkäistä sukupolvea vaikuttaa. Perhe A oli eniten sukupolvien kehittää useita lipomas (a). Proband A (III 2) oli ainoa hänen perheryhmän ja kasuistry viittaava kipu, kun tutkittiin (a). Nuolet osoittavat probandit.

molekyyli

Sanger-sekvensointi paljasti hmga2-geenin ekson 5: ssä kaksi uutta varianttia. Molemmat vaihtoehdot tunnistettiin potilaasta A ja B1. Ensimmäinen oli synonyymi heterotsygoottinen muunnos c. 327c>T p. (Asp=), jota pidettiin vähäisenä tai neutraalina ja joka perustui useisiin ennustusvälineisiin (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). Sen sijaan toinen muutos oli nonsense-muutos heterotsygoottinen muunnos c. 328t>c (p.*110glnext*16), joka aiheuttaa stop-kodonin substituution glutamiiniaminohapolla ja sitä seuraavan lopullisen proteiinin laajenemisen (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Kuva 3 kaavailee hmga2-geenin rakennetta, proteiinia sitovia domeeneja ja uusia variantteja.

kuva 3 ihmisen HMGA2-geenin rakenne. (A) sijaitsee 12q14.3, HMGA2 geeni ulottuu yli 140 kb ja käsittää viisi eksonia. Ekson 1, 2 ja 3 (siniset laatikot) koodaavat at-hook-verkkotunnuksen (siniset ympyrät). Neljäs eksoni (lilac) koodaa välilyöntialuetta. Eksoni 5 (vaaleanpunainen laatikko)koodaa 109 aminohapon proteiinin C-terminaalista domeenia. (B) Elektroferogrammi potilaista A, B1 ja viite. Näiltä potilailta löydettiin kaksi identtistä uutta varianttia. Synonyymi heterotsygoottinen muunnos c.327c>T (P.Asp=) ja pysäyttämätön heterotsygoottinen muunnos c. 328t>C (p.*110glnext*16).

variantti c.328t>C (p.*110glnext*16) määriteltiin silico-algoritmien mukaan 100-prosenttisesti patogeeniseksi tai suureksi iskuksi. Mutaatiomaistajan ennustusjärjestelmä osoitti kuitenkin poikkeaman kuvattujen kahden muunnoksen välillä, kuten taulukossa 3 esitetään. Kohdennettu monigeenipaneeli AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA ja PTEN perheissä A, B, C, D ja E ei havainnut haitallisia muutoksia arvioiduissa sekvensseissä.

Taulukko 3 yksilöistä A ja B1 löydetyt variantit ja vertailu Ennustusvälineistä

keskustelu

nykyisessä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään FML: n molekyyliemäkset integroimalla nykyaikaiset sekvensointitekniikat, kuten Sanger-sekvensointi ja NGS yhdistettynä perinteisiin kliinisiin lähestymistapoihin.

aiempien tutkimusten perusteella tässä tutkimuksessa on havaittu joitakin eroja epidemiologisissa tiedoissa. Havaitsimme, että eri lipomatoosityyppien luokittelusta ja diagnoosista on yleinen väärinkäsitys.7,10,15 useat kirjoittajat korostavat, että miehillä on korkea taipumus esittää useita lipomas, 11,29, 30 kuitenkin, meidän tulokset osoittavat ilmeinen korkea taajuus FML naisilla. On mahdollista, että tämä havainto vain heijastaa valintaharhaa, joka johtuu pienestä otoskoosta, tai se voi selittyä myös sillä, että naiset hakeutuvat todennäköisemmin terveydenhoitoon kosmeettisten huolenaiheiden vuoksi.31 sukutaulut kuitenkin osoittavat, että sairastuneiden osuus molemmilla sukupuolilla oli sama, minkä vuoksi sukupuolisuhde oli lähellä 1:1 (10 miestä vs. 13 naista), mikä saattaa aliarvioida FML: n todellista esiintyvyyttä.6,8,16 mielenkiintoista, kokonaismäärä lipomas totesi naisilla oli suurempi verrattuna ainutlaatuinen mies tutkittu.1, 14

tekijät, kuten ylipaino ja kyhmyjen paheneminen raskauden aikana ja sen jälkeen, viittaavat siihen, että eksogeeniset tekijät (ruokavalio), metaboliset muutokset (dyslipidemia tai muutokset rasvahappojen desaturaatiossa) ja hormonaaliset mekanismit voivat liittyä adiposyyttien hyperplasiaan.32,33 Yee et al vertasi stearoyyli-CoA: n entsymaattisen desaturaation eroja harvinaisista rasvasairauksista (RAD) kärsivien ja lihavien verrokkiryhmien välillä ja totesi, että FML: ää ja lihavuutta sairastavilla henkilöillä desaturaatio oli korkein, mikä lisäsi lipogeneesiä.32, 34

yksi odottamaton havainto oli, että potilas A oli ainoa casuistic-ryhmässä ja hänen perheryhmässään, jossa ilmeni kipua, päivittäistä heikkoutta, väsymystä ja psyykkistä oheissairautta (krooninen masennus ja ahdistuneisuushäiriö). Nämä oireet liittyvät vahvasti Dercumin tautiin, jota pidetään erotusdiagnoosina tai FML: n muunnoksena.35 Hansson et al: n ehdottaman uuden Dercumin tautiluokituksen perusteella 36 tunnistimme tässä potilaassa yleistyneen nodulaarisen muodon,jolle on ominaista voimakas kipu rasvakudoksen pinnalla ja lipomasin ympärillä. Toinen tutkimus, joka tukee tätä hypoteesia julkaisi Campen et al37 he kuvailivat perheen yhdeksän jäsentä diagnosoitu useita lipomas jotka näkyvät vaihtelevia oireita vaihteli yhteensä työkyvyttömyys oireeton kyhmyt. Voidaan siis olettaa, että erottelu noudattaa autosomaalisesti dominoivaa kaavaa, jonka ekspressiivisyys vaihtelee ja edustaa mahdollisesti FML: n äärimmäistä ilmentymää.

histopatologisesta diagnoosista osoitimme kahta päätyyppiä: lipoomaa ja angiolipoomaa. Mikroskooppisesti angiolipooman yleisin havaittavissa oleva piirre on fibriinin mikrotrombia sisältävien hienojen verisuonten lisääntyminen yhdessä kypsien adiposyyttien kanssa.10, 28 Angiolipoomaa näyttää esiintyvän runsaasti nuorilla aikuisilla miehillä, joilla ilmenee toisinaan lievää kipua tai arkuutta. Tämäntyyppinen kasvain liittyy myös paikallisen trauman historiaan tai steroidihoidon käyttöön.13,38 vaikka monet kirjoittajat tunnistavat molemmat diagnoosit eri patologisiksi kokonaisuuksiksi, joissakin tapausraporteissa tätä eroa ei tehdä niiden välisten hyvin hienovaraisten erojen vuoksi.39 tässä yhteydessä analyysimme vahvistaa, että on mahdollista saada angiolipomas familiaalisen uusiutumisen kanssa ja tämä diagnoosi voisi olla osa FML: n laajaa kirjoa.40-43 lisäksi useita Kara solu lipomas, toinen tyyppi lipoma, on myös raportoitu useissa perheissä.44

vaikka on olemassa useita tutkimuksia, jotka keskittyvät sporadisten lipoomien ilmentymiseen ja suoriin sytogeneettisiin analyyseihin, harvat tutkimukset ovat olleet huolissaan FML: n perustuslaillisista syistä.2 Laaja lipoma sarja aikuisilla vahvistaa useita rakenteellisia uudelleenjärjestelyjä taajuudet vaihtelevat 50-75%.10,28,45 näistä tasapainotetuista kromosomimuutoksista translokaatio t(3; 12)(q27-28; q13-15) havaitaan lähes 25%: ssa kasvaimista.9 useimmissa tapauksissa breakpoint vaikuttaa HMGA2-geeniin, joka koostuu 5 eksonista ja tuottaa 109 aminohapon proteiinin (kuva 3).18,46,47 Ligon et al raportoitu tapaus kahdeksanvuotias poika perustuslaillinen uudelleenjärjestely vaikuttaa bändi 12q14.3 (de novo pericentric inversion) siten, johon HMGA2 geeni. Kuitenkin kliininen fenotyyppi ominaista somaattinen liikakasvu, etenemistä luun ja hampaiden Ikä, pikkuaivokasvain,ja useita lipomas, 48 eroaa meidän casuistic.

analysoimme hmga2-geenin ekson 5: n heterotsygoottiset variantit C.327c>T p.(Asp=) ja C.328t>C (p.*110glnext*16) erilaisissa ennustusohjelmissa. Synonyymi eli äänetön muutos tulkittiin hyvänlaatuiseksi, kun taas käännöksen stop-kodonin muutos katsottiin 100-prosenttisesti patogeeniseksi tai suureksi vaikutukseksi. Tällä tavalla se voisi osoittaa, että muutokset, jotka koskevat 3ʹ UTR (kääntämätön) – aluetta, laukaisisivat hmga2-geenin neoplastisen muutoksen.49 Fusco et al korosti hmga2-geenin ratkaisevaa roolia mesenkymaalisissa kasvaimissa. He ehdottivat, että HMGA2-geenissä 3ʹ UTR-alue yleensä hiljennetään Let-7 mirnalla, ja kaikki tämän tason muutokset, joko typistyminen tai fuusio kohdunulkoisiin sekvensseihin, ajavat sen säätelyyn ja siten solujen epänormaaliin replikaatioon.46

on hieman yllättävää, että suvussa B oli havaittu molemmat romaaniset muunnokset vain äidissä (B1). Se voi osoittaa, että ne eivät erotu FML-fenotyypistä, joka hylätään ainakin tässä perheessä etiologisena syynä. Toisaalta potilas a esitti samat kaksi uutta varianttia, mutta osoitti fenotyypin, joka viittasi voimakkaasti Dercumin tautiin. Lupaavista löydöksistä huolimatta niitä on hieman vaikea tulkita, koska ei ollut mahdollista arvioida muita FML: ään sairastuneita sukulaisia.

fokaalinen rasva-infiltraatio ja useita lipoomia voi esiintyä useissa oireyhtymissä. Proteus-oireyhtymä ja neilikka (synnynnäinen lipomatoottinen epäsymmetrinen liikakasvu, verisuonten epämuodostumat, epidermaalinen nevi, luuston ja selkärangan poikkeavuudet) ovat esimerkkejä somaattisista mutaatioista, joissa lipomatoosi on läsnä.50,51 toisaalta, Bannayan-Riley-Rubacalva oireyhtymä, useita hormonitoimintaa Neoplasia tyyppi 1, Cowdenin oireyhtymä ja Gardnerin oireyhtymä ovat sairauksia johtuvat germline mutaatioita, joilla on samanaikainen lipomatoosi.52-55 jopa jotkut mitokondrioiden toimintaan liittyvät mutaatiot liittyvät epänormaaliin rasvakudoksen kasvuun lähinnä ylävartalossa ja kaulassa ja paras esimerkki on Madelungin tauti.56 akt1: n, APC: n, MEN-1: n, PIK3CA: n ja PTEN: n negatiivinen paneeli kuitenkin sulkee pois sen, että ne olisivat vastuussa FML: n fenotyypistä, ainakin tässä tutkimuksessa.

johtopäätös

FML on harvinainen ja heterogeeninen sairaus, joka voi olla päällekkäinen muiden dermatologisten oireyhtymien, kuten Dercumin taudin kanssa. FML: n luonnollinen historia tässä sarjassa osoitti, että leesioiden kehitys oli progressiivista ja oli suurimmillaan keski-ikäisillä yksilöillä. FML vaikutti molempiin sukupuoliin, ja sen Topografinen jakauma oli hallitseva raajoissa ja rungossa. Arvioitujen potilaiden sukupuolisuhde oli naisten esiintyvyys, mutta polveutumistiedot jakautuivat tasapainoisemmin. Myös Dercumin taudin diagnoosi tunnistettiin yhdellä henkilöllä (potilas A).

molekylaarinen lähestymistapa on tarjonnut syvällisemmän käsityksen FML: n geneettisestä perustasta ja pyrkinyt tutkimaan perusteellisesti suurinta määrää siihen liittyviä kandidaattigeenejä. Korostimme NGS: n hyödyllisyyttä Sanger-menetelmän lisäksi FML: n täyden spektrin ymmärtämisessä, koska se saattaa tarjota vaihtoehdon harvinaisten geneettisten sairauksien etiologiselle tunnistamiselle ja luonnehtimiselle kliinisissä asetuksissa. Hmga2-geenin Exon 5: n variantteja ei ole kuvattu, ja toistaiseksi niiden merkitys FML: n synnyssä on epävarma. Lisätutkimuksia, mukaan lukien merkittävämpi määrä sairastuneita henkilöitä ja funktionaalinen analyysi hgma2-geenin uusista muunnoksista, olisi tehtävä sen biologisen funktion määrittämiseksi FML: ssä paremmin.