proiectare experimentală și colectare a eșantioanelor

experimentul a fost înființat în 1982 în județul Mengcheng, provincia Anhui, China (33 13′ n, 116 35′ E, 42 m altitudine) cu beton tipic de var sol negru. Temperatura anuală este de 14,8 C, iar precipitațiile anuale sunt de 872 mm. Cinci tratamente de fertilizare cu rotație a culturilor de grâu-soia au fost comparate într-un bloc complet randomizat cu patru replici (fiecare parcelă este de 70 m2) : (1) control, non−fertilizare; (2) îngrășăminte chimice NPK, NPK cuprinzând uree (180 kg N ha−1 an−1), superfosfat (90 kg P2O5 ha−1 an− 1) și clorură de potasiu (86 kg K2O ha−1 y−1); (3) îngrășăminte chimice NPK + WS, NPK plus 7500 kg paie HA−1 an−1; (4) NPK + pm, îngrășăminte chimice NPK plus 15.000 kg gunoi de grajd proaspăt de porc ha−1 an-1; (5) NPK + CM, îngrășăminte chimice NPK plus 30.000 kg gunoi de grajd proaspăt ha−1 an−1. În tratamentul NPK + WS, toate paiele de grâu au fost returnate pe câmp, gunoiul de porc din tratamentul NPK + PM și gunoiul de vacă din NPK + CM au avut cantitatea similară de carbon organic cu paiele de grâu adăugate. Mai mult, aceste tipuri contrastante de îngrășăminte incluse în tratamentele noastre de fertilizare au niveluri diferite de disponibilitate pentru plante și microbi, de exemplu, de la mai labil (gunoi de porc) la mai recalcitrant (paie de grâu și gunoi de vacă). Am folosit o gamă largă de tratamente de fertilizare cu scopul de a face rezultatele noastre reprezentative și aplicabile practicilor de management contrastante.

am săpat în jurul grupului de grâu (care conține 30 până la 40 de plante de grâu în timpul etapei de umplere a grâului din 20 aprilie 2017) pentru a menține sistemele radiculare cât mai intacte. Solul rizosferei care a fost strâns aderat la rădăcini a fost apoi periat. În același timp, solul vegetal (0-15 cm adâncime) a fost colectat ca sol în vrac folosind un șnec corer (aproximativ 20 cm distanță de plante). Solul colectat a fost cernut printr-o plasă de 2 mm pentru a îndepărta impuritățile precum rădăcinile și pietrele. O parte din sol a fost depozitat la 4 centimetrii C pentru analize chimice, iar restul la − 40 centimetrii C pentru extragerea ADN-ului.

analiza fizico-chimică a solului

pentru măsurarea pH-ului solului la un raport sol-apă distilată de 1:5 (Greutate / volum) s-a utilizat un pH-metru (FE20 Fiveeasy Inqu, Mettler Toledo, Germania). Umiditatea solului a fost determinată gravimetric prin uscarea a 5 g de sol proaspăt la aproximativ 105-108 centi C pentru a atinge o greutate constantă și apoi calcularea raportului de greutate (apă evaporată la sol uscat). Conținutul total de carbon (TC) și azot total (TN) al solului a fost determinat prin arderea solului uscat la aer folosind un analizor CNS-2000 (LECO, St.Joseph, MI, SUA), după cernerea solului printr-o plasă de 0,15 mm. Conținutul total de fosfor (TP) și potasiu total (TK) din sol a fost extras după digestia HF-HClO4 și măsurat folosind metoda albastru de molibden și respectiv metoda spectrofotometriei cu flacără (FP640, Inasa, China). Carbonul organic dizolvat (DOC) a fost extras prin adăugarea a 50 mL de apă distilată la 5 g de sol proaspăt, agitând timp de 1 oră și filtrând în vid printr-un filtru din fibră de sticlă G4 cu un spațiu al porilor de 1,2 mm (Fisher), iar apoi, conținutul de carbon din extracte a fost determinat de un analizor de carbon organic total (multi N/C 3000, Analytik Jena, Germania). Nitrații (NO3–N), amoniul (NH4+-N) și azotul total dizolvat (DTN) au fost extrași la un raport de 5 g sol proaspăt la 50 mL 2 m KCl. După shacking timp de 1 h, extractele au fost filtrate printr-un filtru din fibră de sticlă G4 cu un spațiu al porilor de 1,2 mm (Fisher), iar apoi, un sistem analitic cu flux continuu (Sistemul San++, Skalar, Olanda) a fost utilizat pentru a analiza conținutul de NO3–n, NH4+ – N și DTN. Azotul organic dizolvat (DON) a fost calculat folosind următoarea formulă: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. fosforul disponibil (AP) din sol a fost extras cu 0.5 M NaHCO3 și determinat prin utilizarea metodei albastru de molibden. Potasiul disponibil (AK) a fost extras cu 1 M acetat de amoniu și determinat prin fotometru cu flacără (FP640, Inasa, China) (fișier suplimentar 3: apendicele 1).

determinarea ratelor de fixare a azotului

metoda de etichetare 15N2 este una dintre cele mai comune și aplicate pe scară largă metode utilizate pentru măsurarea ratelor de fixare N. Cinci grame de sol au fost plasate în 18 tuburi de Balch de 150 mm, iar spațiul superior a fost înlocuit cu aer sintetic conținând 80% 15n2 și 20% O2. Controalele au fost umplute cu gaz N2 neetichetat și prelucrate în paralel. Tuburile au fost incubate orizontal în întuneric la temperatura camerei timp de 22 de zile. Atomul % 15N al probelor de sol a fost determinat folosind un spectrometru de masă cu raport izotopic stabil (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Germania). Apoi, am calculat potențialul net n rata de fixare Prin compararea diferenței de 15N total în solurile care primesc 15N2 în raport cu controlul.

secvențiere cu randament ridicat și analiză bioinformatică

pentru extracția ADN-ului, 0.5 g de sol proaspăt au fost utilizate cu kitul fast ADN SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, SUA). Genele nifH au fost amplificate folosind perechi de primeri nifH-F/nifH-R (5′-AAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′) . Reacții PCR au fost efectuate în 20 µL de reacție care conține 4 µL de 5 × FastPfu tampon, 2 µL de 2,5 mM dNTPs, de 0,8 µL de 5 µM înainte de grund, de 0,8 µL de 5 µM primer invers, 0.4 µL de fastPfu Polimeraza, 10 ng de ADN șablon, și apă dublu distilată (ddH2O). Amplificarea s-a efectuat la 95 CT pentru 3 min, cu 35 cicluri de 95 CT pentru 30 s, 55 CT pentru 30 s și 72 CT pentru 45 s, iar extinderea la 72 CT pentru 10 min. Ampliconii PCR au fost purificați prin kit de purificare a ADN-ului cu gel de agaroză (TaKaRa Bio), iar amplificările PCR triplicate pentru fiecare probă au fost efectuate și grupate ca produs PCR și apoi secvențiate pe platforma Illumina MiSeq PE300 (compania Majorbio din Shanghai, China). După secvențiere, secvențele de nucleotide nifH au fost analizate folosind conducta QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/) . În primul rând, secvențele de calitate scăzută (cele cu un scor de calitate < 20, conținând nucleotide ambigue sau care nu se potrivesc cu grundul și Codul de bare) au fost eliminate, iar secvențele rămase au fost transformate în continuare în secvențe de aminoacizi folosind conducta Fungenă a proiectului bazei de date ribozomale . Secvențele care codifică proteinele care nu se potriveau cu secvența proteinei nifH sau care conțineau codoni de terminare au fost aruncate. Secvențele rămase au fost aliniate cu baza de date a genei nifH, eliminând atât secvențele eșuate, cât și cele himerice. Secvențele rămase de înaltă calitate au fost grupate în unități taxonomice operaționale (Otu) la o similitudine de 95% cu UCLUST care rulează în modul de novo și toate Otu-urile singleton au fost șterse.

Analiza rețelei de Co-apariție

am construit o rețea de co-apariție cu toate probele (rizosferă și sol în vrac) și am identificat principalele clustere ecologice ale Otu-urilor puternic asociate. Au fost alese Otu-urile de top, reprezentând mai mult de 80% din abundența relativă din comunitatea totală . Au fost calculate toate corelațiile Spearman cu perechi între Otu, iar corelațiile cu un coeficient Spearman mai mic de 0,65 și o valoare P mai mare de 0,01 au fost eliminate. Acest lucru ne-a permis să ne concentrăm doar pe Otu-urile care au co-apărut puternic și au fost mai susceptibile de a interacționa între ele. Principalele module (clustere ecologice) din rețea au fost vizualizate folosind Gephi (https://gephi.org/). Abundența relativă a fiecărui cluster ecologic a fost calculată prin medierea abundențelor relative standardizate (scor z) ale speciilor care i-au aparținut (fișier suplimentar 3: Apendicele 3).

analiza statistică

testele ANOVA și pairwise t au fost utilizate pentru a compara variabilele solului, taxonii microbieni dominanți și diversitatea alfa microbiană între diferite tratamente de fertilizare (fișier suplimentar 3: apendicele 1). Aceste teste au fost implementate folosind SPSS 21. Testul Mantel a fost utilizat pentru a analiza corelațiile dintre Comunitatea diazotrofică și proprietățile fizico-chimice (fișier suplimentar 3: apendicele 2). Acest lucru a fost realizat folosind pachetul „vegan” din R 32 (3.2.2). O analiză principală a coordonatelor (PCoA) a fost utilizată pentru a găsi diferențe semnificative în comunitățile diazotrofe între grupurile de eșantionare (fișierul suplimentar 3: apendicele 2). Pcoa a fost realizată cu ajutorul pachetului” labdsv”R 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

analize filogenetice

gena nifH asigură o rezoluție filogenetică suficientă în studiile ecologice. Arborele filogenetic pentru cele 481 de filotipuri diazotrofe dominante din clusterele ecologice a fost construit folosind FastTree și vizualizat folosind GraPhlAn . Teoria eșantionării filogenetice poate fi utilizată analitic (presupunând eșantionarea aleatorie din arborele filogenetic ca diversitate filogenetică prezisă într − o comunitate locală și apoi comparând diversitatea filogenetică observată cu acele predicții) pentru a determina gradul în care comunitatea diazotrofică apare aleatorie (între-2 și + 2), supra − dispersată (peste + 2) sau grupată (sub-2). Teoria eșantionării filogenetice a fost realizată folosind pachetul R” picante”. Un avantaj al eșantionării aleatorii a arborelui filogenetic regional este că poate fi utilizat pentru a compara eșantioane de dimensiuni inegale pe baza modelului de eșantionare binomială . Diferențele dintre diversitatea filogenetică observată și cea așteptată au fost determinate prin calcularea și compararea scorurilor z pentru fiecare cluster ecologic. Când diversitatea filogenetică observată este mai mică decât diversitatea așteptată (sub − 2), comunitatea microbiană din clusterul ecologic este considerată a fi grupată filogenetic, ceea ce înseamnă că taxonii strâns înrudiți sunt mai susceptibili de a fi eșantionați și selectați activ de mediu .

analiza modelării ecuațiilor structurale

SEM a fost realizat folosind IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Acesta a fost utilizat pentru a evalua efectele directe și indirecte ale proprietăților fizico-chimice ale solului și abundența relativă a principalelor clustere ecologice asupra ratelor de fixare N. Proprietățile fizico-chimice ale solului au inclus pH-ul solului, carbonul total, azotul total și fosforul total. În model, tratamentele (control, NPK, NPK + WS, NPK + PM și NPK + CM) au fost variabile categorice cu două niveluri: 1 (un anumit tratament) și 0 (restul tratamentelor considerate). În plus, bootstrapping-ul a fost utilizat pentru a testa probabilitatea ca coeficienții de cale să difere de zero, deoarece câteva dintre variabile nu au fost distribuite în mod normal. De asemenea, am calculat efectele totale standardizate (STEs) ale proprietăților solului, tratamentelor de fertilizare și efectului rizosferei asupra ratei de fixare N pentru a ajuta la interpretarea SEM.

Random Forest modeling analysis

random Forest regresion (pachetul R „randomForest”) a fost utilizat pentru a regresa Otu normalizat în diferite tratamente. Metoda de validare încrucișată de 10 ori a fost utilizată pentru a determina setul optim de Otu corelat cu ratele de fixare N. Listele clasate ale Otu în ordinea pădurilor aleatorii raportate scorurile de importanță a caracteristicilor au fost obținute pe baza creșterii erorii medii pătrate a ratelor de fixare a azotului prezise peste 100 de iterații ale algoritmului. Otu-urile cu 50 de markeri au fost alese pe baza erorilor medii pătrate medii minime de validare încrucișată, care au fost obținute din cinci studii ale validării încrucișate de 10 ori.