minerale osoase: noi perspective asupra compoziției sale chimice
identificarea ionilor HPO4 2 în mineralul osos
Rezonanța Magnetică Nucleară în stare solidă (ssNMR) detectarea protonilor localizați în mineralul osos dintr− o probă de țesut osos intact nu este posibilă. Acest lucru se datorează prezenței matricei organice extracelulare ale cărei semnale diferite domină spectrul 1h single pulse (SP) ssNMR al unui eșantion de țesut osos54. Cu toate acestea, posibilitatea de a dezvălui proximități spațiale la scară atomică între nucleele de hidrogen și fosfor în experimentul ssNMR bidimensional (2D) {1h}31P corelație Heteronucleară (HetCor) permite sondarea mediilor de hidrogen mineral osos prin analiza dimensiunii F1 (Fig. 1A). Din păcate, acest experiment consumă mult timp și dă naștere unei proiecții de 1h a dimensiunii verticale (F1) cu un raport semnal-zgomot relativ slab (S/N) și o rezoluție digitală scăzută (Fig. 1B). Pentru a depăși aceste limitări, am folosit experimentul ssnmr unidimensional (1D) {1h-31P}1h polarizare dublă încrucișată (CP). Se compune dintr-un transfer CP dublu efectuat într-o manieră „acolo și înapoi” (1H 31P 1H) (Fig. S1). În primul rând, acest experiment ne-a permis să obținem Spectre ssNMR filtrate 31P 1h de minerale osoase dintr-o probă de țesut osos de oaie intactă, corticală de 2 ani, cu un S/N excelent, în ciuda unui timp de achiziție relativ scurt (adică 9 ore) (Fig. 1C, D). Diferitele medii chimice 1h din minerale osoase sunt acum ușor observabile și pot fi analizate în siguranță cu precizie. În ceea ce privește miezul cristalin intern al particulelor minerale osoase, ionii hidroxilici prezenți în rețeaua cristalină a hidroxiapatitei sunt observați sub forma unei rezonanțe complexe centrate la 0,0 ppm(1h) = 0,0. În ceea ce privește stratul lor amorf de suprafață, moleculele structurale de apă și speciile de fosfat acid prezente în medii non-apatitice sunt observabile sub forma unei singure rezonanțe centrate la 0(1h) = 5.2 ppm și o rezonanță largă, variind de la 1h = 7 la 17 ppm32, respectiv.
În al doilea rând, acest experiment permite investigarea dinamicii CP detectate de 1H pentru a dezvălui selectiv natura nucleelor 1h din apropierea nucleelor 31P. În acest scop, timpul de contact 1 (tCP1) s-a menținut fixat la 1000 de centimetrii, în timp ce timpul de contact 2 (tCP2) a variat de la 75 de centimetrii până la 1000 de centimetrii (Fig. 2). Se observă o creștere uniformă a magnetizării atât pentru rezonanțele centrate la XV(1h) = 0,0, cât și pentru cele de la XV(1h) = 5,2 ppm (vezi liniile punctate negre), atribuite anterior ionilor OH și moleculelor structurale H2O în funcție de deplasarea lor chimică 1H RMN respectivă. În schimb, evoluția semnalului larg în intervalul de la 7-1h = 7-17 ppm arată inițial o creștere rapidă a magnetizării acestuia (până la tCP2 = 300 de laqc) și este urmată de prezența unui comportament oscilator (până la tCP2 = 1250 de laqc – vezi linia punctată neagră). Acest comportament oscilator este caracteristic oscilațiilor dipolare 1h-31P (DP-H) 55,56. Montarea spectrelor ssNMR corespunzătoare {1h-31P}1h la diferite tCP2 nu este simplă datorită suprapunerii diferitelor rezonanțe. În timp ce probele sintetice de ha prezintă de obicei o rezonanță OH simetrică32; arătăm aici că rezonanța OH a mineralelor osoase este deosebit de complexă și se poate monta după cum urmează: un vârf principal la 0,0 ppm(1h) = 0,0 ppm înconjurat de două vârfuri de umeri la 0,7 și 0,9 ppm(Fig. S3). Rezonanța structurală reziduală a apei poate fi echipată corespunzător cu un singur vârf centrat la 0(1h) = 5,2 ppm (Fig. S4). În schimb, semnalul larg de la speciile de fosfat acid observabil în intervalul de la 1h = 7-17 ppm nu poate fi echipat în mod satisfăcător cu un singur vârf cu poziție fixă și lățime de linie, în special la timpi de contact scurți (Vezi cele mai bune rezultate de montare pentru diferitele valori tCP2 din Fig. S4-coloana din stânga). Cu toate acestea, rezultatele montajului sunt corecte atunci când se utilizează două vârfuri diferite cu poziții fixe și lățimi de linie fixă (6,2 0,1 și, respectiv, 5,0 0,1 ppm) (Fig. S4-coloana din dreapta). Nu putem pretinde că acest semnal larg este compus doar din două vârfuri corespunzătoare a două medii protonice distincte, dar este probabil compus dintr-o distribuție largă de medii chimice care duc la o distribuție a schimbărilor chimice RMN. În Consecință, Fig. 3A prezintă cele patru vârfuri care au fost utilizate pentru a analiza spectrele ssNMR 31P-filtrate 1h ale mineralelor osoase pentru fiecare tCP2 valori: (i) un vârf compozit centrat la XV(1h) = 0,0 (violet) și un singur vârf centrat la XV(1h) = 5,2 (gri) ppm ambele caracterizate printr-o creștere relativ lentă și uniformă a magnetizărilor lor; și(ii) două vârfuri la X (1h) = 9,8 (albastru) și 14,0 (verde) ppm ambele afișând oscilații dipolare (Fig. 3B). În ceea ce privește aceste din urmă două vârfuri, potrivirea exactă a profilului Hartmann-Hahn (H-H) (Fig. S2) permite modelarea numerică a curbelor de acumulare CP în conformitate cu modelul perechii de spin unice, reprezentând oscilațiile dipolare rezultate din transferul coerent de polarizare și impactul difuziei de spin 1H57:
cuantificarea ionilor HPO42 din mineralul osos
s− a efectuat cuantificarea ionilor HPO42 prezenți în mineralul osos. În acest scop, forma liniei și lățimea liniei semnalelor individuale 31P RMN ale OH – și PO43-conținând miezul cristalin intern și H2O și HPO42-conținând medii non-apatitice (strat de suprafață amorf) care au fost dezvăluite în Fig. 4B, au fost utilizate în montarea spectrului cantitativ 31P single pulse (SP) mas ssNMR al unei probe proaspete de țesut osos de oaie de 2 ani (Fig. 5A). Procentul molar de ioni HPO42 – și PO43 – în minerale osoase s-au dovedit a fi de aproximativ 50/50 5%. După cum sugerează observațiile noastre din figurile S9 și S10, acest calcul a fost făcut presupunând că proporția molară a ionilor HPO42 din miezul cristalin intern al particulelor a fost aproape de 0%. O proporție molară atât de mare de ioni HPO42− prezenți în stratul amorf de suprafață reflectă dimensiunea redusă a particulelor minerale osoase: grosimea de 1-5 nm, lățimea de 10-40 nm și lungimea de 20-100 nm de 1, 61,62,63. Deoarece am arătat că ionii HPO42 sunt concentrați în stratul amorf de suprafață, putem estima acum grosimea medie a acestui strat pentru o probă de țesut osos de oaie de 2 ani. Aici considerăm o plachetă nanosizată cu o grosime de 4,0 nm și presupunem că densitățile atomilor de fosfat prezenți în rețeaua cristalină a hidroxiapatitei și în stratul amorf de suprafață sunt echivalente. Într-un astfel de scenariu, grosimea miezului cristalin intern este de aproximativ 2,4 nm (adică., care este de aproximativ două ori dimensiunea celulei unitare hexagonale a hidroxiapatitei64 de-a lungul axelor cristalografice a și b; A = b = 0,94 nm); în timp ce grosimea stratului exterior amorf de suprafață poate fi estimată la aproximativ 0,8 nm (adică, care corespunde apoi dimensiunii celulei unitare hexagonale a hidroxiapatitei de-a lungul a și b și, prin urmare, este echivalentă cu stivuirea a numai doi ioni fosfat). Trebuie să fim conștienți că acestea sunt valori medii care corespund sumei contribuțiilor tuturor ionilor fosfat anorganici prezenți în proba noastră de țesut osos de oaie de 2 ani. Aceste rezultate pot fi diferite pentru specimenele mai vechi în care proporția mediilor non-apatitice ar putea fi mai mică65 datorită maturării minerale osoase: transformarea progresivă a stratului amorf de suprafață în medii apatice15. Cu toate acestea,grosimea stratului de suprafață determinată aici (0,8 nm) este în concordanță cu dimensiunile estimate propuse în unele studii anterioare: aproximativ dimensiunea unei unități fosfat în mezocristale fluorapatită-gelatină66; și aproximativ 1-2 nm în hidroxiapatite sintetice32,67, 68.
actualizare privind compoziția chimică minerală osoasă
rezultatele prezentate aici și în altă parte45 sugerează că compoziția chimică medie a mineralelor osoase corticale mature propusă de Legros și colab.27, CA8.3. 1,7(PO4)4.3(HPO4 sau CO3)1.7(oh sau CO3)0,3. 1.7. Într− adevăr, această formulă nu numai că ignoră prezența stratului amorf de suprafață a cărui compoziție chimică variază foarte mult în raport cu mediile apatitice prezente în miezul cristalin intern al particulelor, dar subestimează și proporția molară a ionilor HPO42. Pentru a propune o formulă actualizată a eșantionului nostru de țesut osos de oaie de 2 ani, am avut nevoie în primul rând să determinăm proporția în greutate a ionilor de CO32. O valoare de 4,8% cu o contribuție majoră în carbonații de tip B a fost găsită prin analizele FT-IR49 (Fig. 5B), care este în conformitate cu valorile găsite pentru alte probe minerale osoase3. În plus, au fost luați în considerare următorii parametri: (i) particulele trebuie să rămână neutre din punct de vedere electric (atât miezul cristalin intern, cât și stratul amorf de suprafață); (ii) proporția molară a ionilor HPO42 în raport cu cantitatea totală de ioni fosfat anorganici este limitată la aproape 50% conform studiului de față; (iii) gradul de carbonatare trebuie să fie apropiat de valoarea experimentală (4,8% g/g); (iv) raportul molar global Ca/(P + C) trebuie să rămână acceptabil pentru o probă de țesut osos, i.e.în intervalul 1,2–1,53 și, în sfârșit, (v) proporția de ioni de carbonat de tip A, B și non-apatitic prezenți în stratul amorf de suprafață trebuie să rămână în conformitate cu datele FT-IR. Odată ce toate aceste constrângeri au fost amalgamate, compoziția chimică medie a mineralului osos cortical matur din proba noastră de țesut osos de oaie de 2 ani poate fi aproximată după cum urmează: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Trebuie remarcat faptul că această compoziție chimică medie corespunde exclusiv probei noastre specifice de țesut osos în funcție de propriile noastre rezultate experimentale. Prin urmare, această formulă nu este universală, deoarece variabilitatea apare în rândul exemplarelor osoase în funcție, în special, de specie, vârstă, aprovizionare cu alimente și gradul lor de maturare.