Introducere

lipomatoza multiplă familială (FML, OMIM% 151.900) este o tulburare dominantă autosomală rară a hipodermului caracterizată prin dezvoltarea nodulilor subcutanați bine încapsulați pe extremități și trunchi.1 primele rapoarte ale tumorilor adipocitare multiple au fost făcute din 1846 de Sir Benjamin Brodie.2 rezultate ulterioare din Blaschko (1891) și Alsberg (1892) au demonstrat o recurență familială a leziunilor și au observat o incidență crescută în rândul bărbaților.1,3,4 în anii următori, mulți alți autori au publicat familii cu caracteristici foarte sugestive pentru FML, 1, 5, 6 și, în final, în 1970, Das Gupta a clasificat tumorile lipomatoase în trei categorii: solitare sau sporadice, FML și lipomatoză simetrică multiplă (MSL).7,8

lipoamele solitare sunt considerate cele mai frecvente neoplasme benigne ale țesuturilor moi la adulți, dar lipoamele multiple apar la 5% dintre indivizi.9,10 prevalența exactă a FML este necunoscută, dar a fost estimată a fi 0.002%.8,11,12 vârsta-debutul nodulilor este între 30 și 40 de ani, atingând vârful maxim la anii 50.6,8,13,14 s-a susținut pe scară largă că această tulburare prezintă o preferință pentru bărbați, cu toate acestea, un număr mare de lucrări demonstrează că ambele sexe sunt afectate în mod egal.15-17 deși este considerată o boală benignă, preocupările cosmetice pot apărea la unii indivizi, afectând calitatea vieții lor. În plus, este, de asemenea, răspândită la persoanele obeze.9

până în prezent, cercetările disponibile în FML s-au concentrat în mod explicit asupra aspectelor clinice, iar problemele moleculare nu sunt de obicei investigate. Literatura sugerează că cel puțin 70% din lipoamele sporadice rezultă din rearanjări citogenetice care implică banda 12q13-15, ceea ce ar putea duce la o expresie dereglată a HMGA2 (grup de mobilitate ridicată AT-hook 2) genă. Această genă codifică proteinele cromatinei non-histone responsabile de modificările conformaționale ale ADN-ului, proliferarea celulară aberantă și dezvoltarea tumorilor mezenchimale benigne.18-20

recunoașterea bazei moleculare a condițiilor genetice și implementarea tehnologiilor de secvențiere cu randament ridicat a permis explorarea și elucidarea altor mecanisme implicate în etiologia mai multor genodermatoze. Prin urmare, acest studiu și-a propus să efectueze o caracterizare clinică și moleculară a șapte indivizi cu FML pentru a detecta variante în șase gene candidate legate de lipomatoză folosind tehnici de secvențiere Sanger și next-generation (NGS).

materiale și metode

pacienți și Aspecte etice

această cercetare a fost realizată în conformitate cu principiile Declarației de la Helsinki. Aprobarea a fost obținută de la Consiliul de evaluare instituțională înainte de studiu (Comitetul de etică a cercetării de la FCM-UNICAMP, dosar n 1.313.164) și toți participanții și-au dat consimțământul scris în cunoștință de cauză. Am efectuat studiul în clinica ambulatorie a serviciului de Genetică Medicală de la Spitalul Clinic al Universității din Campinas (HC-UNICAMP) din s Inktovo Paulo, Brazilia. Un total de șapte persoane aparținând a cinci familii independente (numite de la A la E) au fost eligibile. Criteriile primare de includere pentru selectarea subiecților au fost următoarele: i) vârsta peste 18 ani, ii) diagnosticul clinic și histopatologic al lipomului sau angiolipomului și iii) recurența familială care sugerează moștenirea dominantă autosomală. Principalele aspecte clinice au fost colectate din dosarele medicale folosind o formă structurată. Evaluarea fizică a implicat participarea atât a specialităților dermatologice, cât și a geneticienilor. Secția de patologie de la HC-UNICAMP a furnizat probele histopatologice. Rezultatele clinice sunt detaliate în tabelul 1.

Tabelul 1 Rezumatul clinic al pacienților cu LMF

secvențierea Sanger a genei hmga2

ADN-ul genomic a fost extras din probele de sânge EDTA periferice a șapte pacienți conform procedurii convenționale fenol-cloroform utilizată de Sambrook et al21

s-a efectuat o reacție în lanț a polimerazei (PCR) pentru a amplifica cinci exoni de codificare și joncțiuni intron-exon regiuni ale Hmga2 gene. Folosind două instrumente bioinformatice online, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) și OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), am proiectat perechea specifică de primeri, așa cum este rezumată în tabelul 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies (art. Cromatogramele au fost examinate folosind Chromas v. 2.6.5. Rezultatele au fost comparate cu numărul transcrierii HMGA2 Ensembl ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Am verificat variantele noi în trei seturi de date publice: i) Alianța Globală pentru Genomică și sănătate (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) și, iii) arhiva Online a mutațiilor braziliene (http://abraom.ib.usp.br/). Pentru a evalua scorurile de patogenitate și efectele de deteriorare ale variantelor noi în gena HMGA2 candidată, am folosit diferite modele de predicție in silico, cum ar fi Vep (Variant Effect Predictor),22 FATHMM (Analiza funcțională prin modele Markov ascunse),23 UMD-predictor,24 SIFT (Sortare intolerantă din tolerantă),25 PROVEAN (Analizor de efect de variație a proteinelor),26 și degustător de mutații.27

Target Multi-Gene Panel

a fost realizat un panel personalizat pentru a evalua genele implicate în lipomatoza sindromică. Pentru a realiza această tehnică, am obținut ADN genomic din specimene de salivă de la cinci pacienți (A, B, C, D și E) folosind kitul de auto-colectare a ADN-ului oragene (ADN Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Canada). Probele au fost apoi îmbogățite și hibridizate împotriva secvențelor specifice țintei. Captarea a fost realizată folosind următoarea generație Illumina XQ MiSeq (Truseq Capture) sequencer în modul pereche 150bp conform protocolului standard pentru această platformă. Adâncimea de acoperire a regiunilor țintă a fost mai mare de 50x. îmbogățirea și analiza s-au concentrat pe secvențele de codificare a cinci transcrieri (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 și PTEN NM_000314.4), 10bp de secvențe intronice și alte regiuni probabil cauzatoare de boală. În cursul anchetei au fost luate în considerare, de asemenea, ștergeri exonice, duplicări și variații ale sitului de îmbinare. Citirile au fost aliniate și comparate cu referința genomului uman (GRCh37). Amplificarea sondei dependente de ligatura Multiplex (MLPA) a fost aleasă pentru a valida variantele menționate de Invitae XV Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

disponibilitatea datelor

secvențele au fost transmise către GenBank (număr de acces: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Seturile de date legate de acest articol sunt disponibile la Institutul European de Bioinformatică EMBL-EBI prin depozitul ENA cu numărul de aderare la studiu PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

rezultate

analiza clinică

au fost incluși șapte indivizi din cinci familii independente (A, B1, B2, C, D1, D2 și E), așa cum este descris în Figura 1. Nu am identificat consangvinitatea părintească între participanți. Originea etnică a fost auto-raportată ca amestecată de fiecare proband. Într-o imagine de ansamblu generală, s-a observat că familiile a și B au implicat trei generații succesive sau mai multe. Raportul dintre sexul masculin și cel feminin a fost estimat la 1: 6. Vârsta medie la includere a fost de 42 de ani (DS 11,8), în timp ce vârsta medie a apariției leziunilor a fost de 28 de ani (DS 11,8). Femelele au raportat o incidență maximă a nodulilor după sarcini. Caracteristicile clinice clasice ale FML au inclus noduli moi foarte variabili ca număr și dimensiune, localizați în grăsimea subcutanată și limitați la trunchi și extremități, așa cum este descris în Figura 2. Disconfortul și sensibilitatea marcată la palpare au fost observate numai la persoanele A. tulburările gastro-intestinale comorbide au fost prezente la pacienții A, C și D2. Ei au raportat diverticulită și polipi, constipație cronică severă și, respectiv, cancer colorectal. Patru pacienți au avut o evaluare histologică a leziunilor subcutanate. Prezența adipocitelor mature rotunjite de numeroase capilare a confirmat diagnosticul de angiolipom,așa cum face referire Bancroft și Fletcher et al10, 28 (Figura 2). Alte constatări relevante sunt descrise în tabelul 1.

Figura 1 Prezentare generală a pedigreelor familiilor studiate (A-E). Observați modul în care femelele și bărbații sunt implicați în mod egal și modelul de moștenire autosomal dominant cu aproape două generații succesive afectate. Familia A a avut cel mai mare număr de generații care au dezvoltat lipoame multiple (a). Probandul A (III 2) a fost singurul din grupul ei familial și în cazuistica în referirea durerii atunci când a fost examinat (a). Săgețile indică probandii.

figura 2 Caracteristicile clinice ale FML și aspectele histopatologice ale lipoamelor (he stain (10 inkt). Constatările primare includ noduli moi, mobili și circumscriu nedureroși, localizați în grăsimea subcutanată. Cea mai comună distribuție topografică cuprinde membrele superioare (A, B și D), peretele abdominal anterior, spatele și coapsele (C). Lipomul prezintă de obicei un model lobulat de adipocite albe cu nuclee uniforme și o capsulă fibroasă subțire (E). Angiolipoamele sunt compuse din grăsimi mature în asociere cu numeroase vase mici de sânge, care sunt predominant capilare. Trombii de fibrină (săgeți) sunt foarte frecvente (F). Imagini cu amabilitatea Departamentului de patologie și Genetică medicală, școala de științe Medicale, UNICAMP.

Molecular

secvențierea Sanger a dezvăluit două variante noi în exonul 5 al genei HMGA2. Ambele variante au fost identificate la pacienții a și B1. Prima a fost o variantă heterozigotă sinonimă c. 327c >T p.(Asp=) considerată ca fiind cu impact redus sau neutră, bazată pe mai multe instrumente de predicție (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). În schimb, a doua modificare a fost o variantă heterozigotă de schimbare nonsens c.328t>C (p.*110glnext*16) care determină o substituție stop codon de aminoacid glutamină și extinderea ulterioară a proteinei finale (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Figura 3 schematizează structura genei HMGA2, domeniile de legare a proteinelor și variantele noi.

Figura 3 structura genei HMGA2 umane. (A) situată pe 12q14.3, gena HMGA2 se întinde pe mai mult de 140 kb și cuprinde cinci exoni. Exonul 1, 2 și 3 (cutii albastre) codifică pentru un domeniu AT-hook (cercuri albastre). Al patrulea exon (liliac) codifică pentru o regiune distanțier. Exonul 5 (cutie roz)codifică domeniul C-terminal al proteinei a 109 aminoacizi. (B) Electroferograma de la pacienții A, B1 și referință. Două variante noi identice au fost găsite la acești pacienți. O variantă heterozigotă sinonimă c. 327c >T (P.Asp=) și o variantă heterozigotă fără schimbare C.328t>C (p.*110Glnext*16).

varianta c.328t>C (p.*110Glnext*16) a fost definită ca fiind 100% patogenă sau cu impact ridicat conform algoritmilor menționați în silico. Cu toate acestea, sistemul de predicție a degustătorului de mutații a demonstrat o discrepanță între cele două variante descrise, așa cum este prezentat în tabelul 3. Panoul multi-genic vizat al AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA și PTEN din familiile A, B, C, D și E nu a detectat modificări dăunătoare în secvențele evaluate.

Tabelul 3 variante găsite la indivizii a și B1 și Comparație între instrumentele de predicție

discuție

studiul actual și-a propus să identifice bazele moleculare ale FML prin integrarea tehnicilor moderne de secvențiere, cum ar fi secvențierea Sanger și NGS combinate cu abordările clinice tradiționale.

În urma studiilor anterioare, cercetările de față arată unele divergențe în ceea ce privește datele epidemiologice. Am observat că există o concepție greșită comună cu privire la clasificarea și diagnosticul diferitelor tipuri de lipomatoză.7,10,15 mai mulți autori subliniază faptul că bărbații au o tendință ridicată de a prezenta lipoame multiple,11,29,30 cu toate acestea, rezultatele noastre arată o frecvență aparentă ridicată a FML la femei. Este posibil ca această constatare să reflecte doar o prejudecată de selecție din cauza dimensiunii mici a eșantionului sau poate fi explicată și prin faptul că femeile au mai multe șanse să solicite asistență medicală din cauza preocupărilor cosmetice.31 cu toate acestea, pedigreele indică faptul că proporția persoanelor afectate la ambele sexe a fost similară, ceea ce a dus la un raport de sex apropiat de 1:1 (10 bărbați față de 13 femei), ceea ce poate subestima adevărata prevalență a LMF.6,8,16 interesant, numărul total de lipoame observate la femei a fost mai mare comparativ cu bărbatul unic examinat.1,14

factori precum excesul de greutate și creșterea exacerbată a nodulilor în timpul și după sarcini sugerează că factorii exogeni (dieta), modificările metabolice (dislipidemia sau modificările desaturării acizilor grași) și mecanismele hormonale pot fi implicate în hiperplazia adipocitelor.32,33 Yee și colab au comparat diferențele în desaturarea enzimatică a stearoil-CoA între indivizii cu tulburări adipoase rare (RAD) și grupul de control obez și au concluzionat că persoanele cu FML și obezitate au prezentat cele mai mari rate de desaturare, crescând astfel procesul de lipogeneză.32,34

o constatare neașteptată a fost că pacientul A a fost singurul din cadrul grupului casuistic și al familiei sale care a manifestat durere, slăbiciune zilnică, oboseală și comorbiditate psihiatrică (depresie cronică și tulburare de anxietate). Aceste simptome sunt puternic asociate cu boala Dercum, care este considerată un diagnostic diferențial sau o variantă a FML.35 pe baza noii clasificări a bolii Dercum propusă de Hansson și colab., 36 am identificat la acest pacient forma nodulară generalizată, caracterizată prin durere intensă la suprafața țesutului gras și în jurul lipomelor. Un alt studiu care susține această ipoteză a fost publicat de Campen și colab. 37 au descris o familie de nouă membri diagnosticați cu lipoame multiple care au prezentat simptome variabile variind de la invaliditate totală la noduli asimptomatici. Prin urmare, se poate presupune că segregarea urmează un model dominant autosomal cu expresivitate variabilă și, eventual, reprezintă o manifestare extremă a FML.în ceea ce privește diagnosticul histopatologic, am evidențiat două tipuri principale: lipomul și angiolipomul. Microscopic, cea mai comună caracteristică vizibilă a angiolipomului este proliferarea vaselor de sânge fine care conțin microtrombi de fibrină în asociere cu adipocitele mature.10,28 Angiolipomii par să aibă o incidență ridicată la bărbații adulți tineri care manifestă ocazional durere ușoară sau sensibilitate. Acest tip de tumoare este, de asemenea, legat de istoricul traumei locale sau de utilizarea terapiei cu steroizi.13,38 deși mulți autori recunosc ambele diagnostice ca entități patologice diferite, unele rapoarte de caz nu fac această distincție din cauza diferențelor foarte subtile dintre ele.39 în acest context, analiza noastră confirmă faptul că este posibil să existe angiolipoame cu recurență familială și acest diagnostic ar putea face parte din spectrul larg al FML.40-43 mai mult, mai multe lipoame cu celule fusiforme, un alt tip de lipom, au fost, de asemenea, raportate în mai multe familii.44

deși există mai multe studii axate pe expresia și analiza citogenetică directă asupra lipomelor sporadice, puține studii au fost preocupate de cauzele constituționale ale FML.2 serii extinse de lipom la adulți confirmă mai multe rearanjări structurale cu frecvențe cuprinse între 50 și 75%.10,28,45 dintre aceste modificări cromozomiale echilibrate, translocația t (3; 12) (q27-28; q13-15) este observată la aproape 25% din tumori.9 în majoritatea cazurilor, punctul de întrerupere afectează gena HMGA2 care este compusă din 5 exoni și generează o proteină de 109 aminoacizi (Figura 3).18,46,47 Ligon și colab au raportat cazul unui băiat de opt ani cu o rearanjare constituțională care afectează banda 12q14.3 (de novo inversiune pericentrică) astfel, implicând gena HMGA2. Cu toate acestea, fenotipul clinic caracterizat prin supraaglomerare somatică, avansarea vârstei osoase și dentare, tumora cerebeloasă și lipoame multiple,48 diferă de cazuistica noastră.

am analizat variantele heterozigote c.327c>T p.(Asp=) și C.328t>C (p.*110Glnext*16) ale exonului 5 al genei HMGA2 în diverse programe de predicție. Modificarea sinonimă sau silențioasă a fost interpretată ca benignă, în timp ce modificarea codonului stop de traducere a fost considerată ca fiind 100% patogenă sau cu impact ridicat. În acest fel, s-ar putea indica faptul că modificările care implică Regiunea UTR (netradusă) de 3 centime ar declanșa transformarea neoplazică a genei HMGA2.49 Fusco și colab au evidențiat rolul crucial al genei HMGA2 în tumorile mezenchimale. Ei au propus că, în gena HMGA2, Regiunea UTR de 3 centime este, în general, redusă la tăcere de Let-7 miARN și orice modificare la acest nivel, fie trunchiere, fie fuziune cu secvențe ectopice, conduce la reglarea sa în sus și, în consecință, la o replicare anormală a celulelor.46

este oarecum surprinzător faptul că în familia B am detectat ambele variante noi doar la mamă (B1). Ar putea indica faptul că acestea nu se separă de fenotipul FML, fiind aruncate cel puțin în această familie ca cauză etiologică. Pe de altă parte, pacientul a a prezentat aceleași două variante noi, dar a demonstrat un fenotip foarte sugestiv pentru boala Dercum. În ciuda acestor constatări promițătoare, acestea sunt oarecum dificil de interpretat, deoarece nu a fost posibilă evaluarea altor rude afectate de FML.

infiltrarea focală grasă și lipoamele multiple pot fi prezente în mai multe sindroame. Sindromul Proteus și cuișoarele (supraaglomerare asimetrică Lipomatoasă congenitală, malformații vasculare, nevi epidermici, anomalii scheletice și spinale) sunt exemple de mutații somatice în care este prezentă lipomatoza.50,51 pe de altă parte, sindromul Bannayan-Riley-Rubacalva, neoplazia endocrină multiplă de tip 1, Sindromul Cowden și sindromul Gardner sunt afecțiuni care rezultă din mutații germinale care au lipomatoză concomitentă.52-55 chiar și unele mutații care implică funcția mitocondrială sunt legate de creșterea anormală a țesutului adipos, mai ales în trunchiul superior și în gât, iar cel mai bun exemplu este boala Madelung.56 cu toate acestea, panoul negativ al AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA și PTEN exclude faptul că aceștia sunt responsabili pentru fenotipul FML, cel puțin în această cercetare.

concluzie

FML este o boală rară și eterogenă care se poate suprapune cu alte sindroame dermatologice, cum ar fi boala Dercum. Istoria naturală a FML din această serie a arătat că dezvoltarea leziunilor a fost progresivă și a atins cea mai mare incidență la persoanele de vârstă mijlocie. FML a afectat ambele sexe și a prezentat o distribuție topografică cu predominanță în extremități și trunchi. Raportul de sex în rândul pacienților evaluați a arătat o prevalență feminină, dar datele pedigree au afișat o distribuție mai echilibrată. Diagnosticul bolii Dercum a fost, de asemenea, recunoscut la un individ (pacientul a).

abordarea moleculară a oferit o perspectivă mai aprofundată asupra bazei genetice a FML și a încercat să investigheze în detaliu cel mai mare număr de gene candidate legate de aceasta. Am evidențiat utilitatea NGS în plus față de metoda Sanger în înțelegerea întregului spectru al FML, datorită faptului că ar putea oferi o alternativă pentru identificarea etiologiei și caracterizarea afecțiunilor genetice rare în mediile clinice. Variantele din exonul 5 al genei HMGA2 nu au fost descrise și până în prezent au o semnificație incertă în geneza FML. Studii suplimentare, inclusiv un număr mai semnificativ de persoane afectate și analiza funcțională a variantelor noi ale genei HGMA2, ar trebui întreprinse pentru a determina mai bine funcția sa biologică în FML.