sistem Experimental de proiectare și studiu

În 2012, 300 de semințe de plante rapa cu ciclism rapid (semințe standard de plante rapide din Wisconsin, cu variație genetică ridicată) au fost obținute din Consumabile biologice din Carolina și cultivate într-un fitotron în condiții standardizate de sol, lumină și udare. Aceste plante sunt pe deplin depășite (auto-incompatibile) și au o variație genetică suficientă pentru a răspunde cu ușurință la selecție58,59. Din aceste 300 de plante, 108 familii complete de semințe sib au fost generate prin încrucișări artificiale (s-au folosit doar familii de semințe din cruci în care ambii părinți au produs fructe). Aceste 108 familii complete de semințe sib au fost folosite ca populație inițială pentru experiment.

pentru prima generație a experimentului, au fost stabilite trei grupuri de tratament folosind cele 108 familii, astfel încât fiecare familie să fie reprezentată în fiecare tratament pentru a controla genotipul dintre tratamente (Fig suplimentar. 1). Prin urmare, fiecare tratament a constat din 108 plante (reprezentând 108 familii de semințe), pe care le-am împărțit în trei replici (A,B, C) fiecare conținând 36 de plante. Replicatele din cadrul tratamentelor au fost păstrate ca linii izolate pe parcursul a 9 generații (nu s-au făcut încrucișări între replici) pentru a putea evalua schimbări evolutive independente, repetabile. Plantele tuturor replicilor din toate tratamentele au fost cultivate în fitotron sub sol standardizat (einheitserde classic), lumină (24 h lumină) și condiții de udare. Toate plantele au fost fenotipate la fiecare a doua generație începând cu generația 1. Datele parfumurilor florale din generațiile 1 și 3 s-au pierdut din cauza problemelor tehnice; în schimb, parfumul a fost colectat din generația 4. Datele parfumului Floral din generația 1 au fost obținute după încheierea experimentului prin re-cultivarea plantelor din generația inițială și colectarea parfumului de la o plantă din fiecare dintre cele 108 familii de semințe. Astfel, din prima generație în total 108 plante (36 din fiecare replică) au fost prelevate pentru parfum floral În același timp cu plantele din generația 9.

tratamente experimentale de evoluție și polenizare

în studiul nostru am folosit trei tratamente polenizatoare: bondari (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Elveția), hoverflies (‘Hf’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Germania) și polenizare manuală. Ambele insecte vizitează cu ușurință florile multor specii de Brassicaceae în natură, dar reprezintă diferite categorii funcționale de polenizatori și s-a dovedit că variază din abundență în habitatele naturale46. Utilizarea speciilor unice de polenizatori imită mediile polenizatorilor în care cei mai abundenți polenizatori sunt diferiți funcțional. În tratamentul de control (‘CO’), plantele alese aleatoriu au fost polenizate manual.

polenizarea s-a efectuat la 23 de zile de la însămânțarea într-o cușcă de zbor (2,5 m, 1,8 m, 1,2 m) în seră, în condiții de lumină standardizate, cu bondari și hoverflies. Experimentele au fost efectuate între orele 0900 și 1.500. Bumblebees au fost ținute într-o cușcă de zbor separată în seră. Hoverflies au fost achiziționate ca pupe și crescute până la eclozare, după care muștele masculine și feminine au fost separate. Polenizatorilor li s-a permis să se hrănească pe ciclismul rapid B. plante rapa (plante din grupul de control al generației respective) și hrănite cu polen suplimentar până cu 3 zile înainte de tratamentul de polenizare; după aceea, au fost furnizate doar polen și soluție de zahăr; 16 h. înainte de polenizare, polenizatorii au fost înfometați.

pentru polenizare, toate plantele dintr-o replică au fost plasate aleatoriu într-un pătrat de 6 plante 6 cu o distanță de 20 cm una de cealaltă în cușca de zbor. Cinci polenizatori au fost adăugați individual și secvențial și fiecare insectă a fost lăsată să viziteze maximum trei plante diferite și apoi scoasă din cușcă; fiecare insectă a fost folosită o singură dată. În total, 12-15 plante per replică au primit una sau mai multe vizite ale polenizatorilor. Numărul mediu total de vizite (la plantele vizitate) a fost de 1,35 0,63 la plantele polenizate cu bumblebee și de 1,28 0,53 la plantele polenizate cu hoverfly. Pentru plantele care au fost vizitate, numărul de vizite și numărul de flori vizitate au fost înregistrate. În grupul de control, 12 plante au fost alese aleatoriu pe replică și 5 flori din fiecare plantă au fost polenizate manual de o plantă tată aleasă aleatoriu; tații au fost aleși dintre aceleași 12 plante. Fiecare plantă ar putea fi donator de polen pentru mai multe plante, dar a primit doar polen de la o plantă. După polenizare, florile vizitate au fost marcate și plantele au fost ținute într-o cușcă pentru încă 30 de zile până când fructele au fost colectate. Semințele au fost numărate și setul relativ de semințe a fost calculat pentru fiecare plantă prin împărțirea setului individual de semințe la setul mediu de semințe din replică. În plus, numărul de semințe pe fruct a fost calculat pentru fiecare plantă vizitată. Pentru fiecare plantă de sex masculin de fitness a fost estimat ca paternitate prezis (numărul de evenimente de export de polen).

Din toate semințele produse de florile polenizate, un subset de semințe reprezentativ pentru producția de semințe a fiecărui individ a fost folosit pentru a crește următoarea generație. Cu cât o plantă a produs mai multe semințe, cu atât mai multe semințe au contribuit la următoarea generație, care a constat din 36 de plante pentru fiecare replică. Contribuția semințelor fiecărei plante vizitate în următoarea generație a fost calculată pentru fiecare replică ca: 36/(replică sumă de semințe / set de semințe individuale). Valorile sub 0,5 au fost rotunjite până la 1.

depresia Consangvinizantă

depresia Consangvinizantă pe parcursul experimentului a fost cuantificată prin măsurarea greutății semințelor și a ratei de germinare, aceasta din urmă ca procent de semințe germinate per replică. Pentru a controla trăsătură-modificări datorită unor depresie, semințele produse de către plante a 9-a generație au fost cultivate (reprezentând a 10-a generație) și manual încrucișate între replici, în tratamente, astfel încât plantele de fiecare replica a fost donator de polen și polen recipient pentru plante din diferite replici (♀O-♂C, ♀B-♂ – O, ♀C-♂B). Trecerile în cadrul acestor combinații de replici au fost aleatorii. Din semințele rezultate (a unsprezecea generație) a fost cultivat un individ pe familie de semințe (36 de plante pe replică) în aceleași condiții ca în timpul experimentului. Dintre aceste încrucișări inter-replicate, trăsăturile au fost din nou măsurate și utilizate pentru compararea finală a trăsăturilor între grupurile de tratament.

trăsăturile plantelor

majoritatea trăsăturilor, inclusiv parfumul floral, au fost măsurate înainte de polenizare, la 19-21 de zile după însămânțare. Lățimea petalei, lungimea, lungimea pistilului și diametrul florii a trei flori alese aleatoriu pe plantă au fost măsurate cu un etrier electronic (etrier Digital 0-150 mm,TOOLCRAFT). Nectarul din trei flori a fost recoltat cu 1 inqql micro tuburi capilare (Blaubrand, Wertheim, Germania) și volumul determinat prin măsurarea lungimii coloanei de nectar în micropipetă cu un etrier. Pentru cuantificare, s-a folosit media a trei flori. Pentru 157 de plante împărțite uniform pe tratamente, conținutul de zahăr al nectarului a fost determinat folosind derivatizare și analiză cromatografică gazoasă. Pentru a face acest lucru, nectarul a fost transmis hârtiei de filtru stocate în silicagel. Sectorul de pe hârtia de filtru care conține nectarul a fost tăiat din restul hârtiei de filtru și nectarul a fost eluat în 1 ml apă Mili-Q de înaltă puritate prin agitarea diluării timp de 90 min cu 400 r.p.m. la 60 XQC pe un agitator de laborator. Ulterior, 50 unqql din soluție au fost uscați la 60 unqql C și derivați cu 100 unqql dintr-un amestec de piridină anhidră (Fisher Scientific, Geel, Belgia), hexametilsilazan (Sigma-Aldrich, Buchs, Elveția) și trimetilclorosilan (Sigma-Aldrich, Buchs, Elveția) (10:5:3). Ulterior, probele au fost conduse de GC-MS așa cum este descris în ref. 32. Am calculat cantitățile totale de zahăr pe floare și inflorescență ca suma tuturor zaharurilor diferite (fructoză, glucoză, zaharoză și sorbitol). Corelația dintre conținutul de zahăr nectar și volumul de nectar a fost pozitivă și ridicată (r156=0,732, p<0,001), astfel, pentru plantele rămase, s-a determinat doar volumul de nectar. Colecția de parfumuri florale a fost făcută înainte de bioteste într-un mod nedistructiv din toate inflorescențele plantelor imediat ce au fost deschise cel puțin cinci flori. Am folosit sorbția headspace cu un sistem push-pull59, 60. Inflorescențele plantelor au fost închise în butelii de sticlă acoperite anterior cu sigmacote (Sigma-Aldrich) și închise cu o placă de Teflon. Numărul de flori deschise a fost numărat pentru fiecare plantă. Aerul din jur a fost împins cu un debit de 100 ml min−1 prin filtre de cărbune activat în cilindrul de sticlă. Simultan, s−a extras aer din butelia de sticlă cu un debit de 150 ml min-1 printr-un tub de sticlă umplut cu 30 mg Tenax ta (60/80 ochiuri; Supleco, Bellefonte, PA, SUA). Aerul din buteliile goale de sticlă a fost colectat ca comenzi de aer. Volatilele florale au fost colectate timp de două ore într-un fitotron în condiții standardizate de lumină și temperatură. Cuantificarea substanțelor volatile a fost realizată prin cromatografie în fază gazoasă cu detecție selectivă în masă (GC–MSD). Probele au fost injectate într-un GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, SUA) de către un Sampler multifuncțional (MPS; Gerstel, m Uniftllheim, Germania) folosind o unitate de desorbție termică Gerstel (TDU; Gerstel) cu un sistem de injecție la rece (CIS; Gerstel). Pentru termodesorbție, TDU a fost încălzit de la 30 la 240 centi C la o rată de 60 centi c min−1 și menținut la o temperatură finală timp de 1 min. CIS a fost setat la -150 CTC în timpul captării compușilor de eluare din TDU. Pentru injectare, CIS a fost încălzit la 250 C la o rată de 12 C S-1, iar temperatura finală a fost menținută timp de 3 min. GC a fost echipat cu o coloană HP-5 (Diametru de 0,25 mm, grosime de film de 0,25 mm, lungime de 15 m), iar heliul a fost utilizat ca gaz purtător la un debit de 2 ml min−1. Identificarea și cuantificarea compușilor au fost efectuate în urmarea60 cu programul Agilent MSD ChemStation. Cuantificarea compusilor a fost obtinuta prin masurarea ariilor de varf ale ionilor tinta selectati specifici compusilor aromatici individuali. Ionii țintă specifici au fost obținuți din standardele sintetice ale tuturor compușilor; zonele de vârf au fost transformate în cantități absolute folosind curbe de calibrare obținute anterior pentru fiecare compus folosind compuși sintetici în trei concentrații diferite. În analiză au fost incluși doar compuși parfumați care au fost prezenți în cantități semnificativ mai mari decât în controlul aerului (în total 14 compuși parfumați). Toate cantitățile de substanțe volatile au fost calculate în pg per floare L−1 aer eșantionat.

la douăzeci și trei de zile după însămânțare, în aceeași zi în care s-a făcut polenizarea, s-au înregistrat numărul de flori deschise și înălțimea fiecărei plante. După polenizare (dar în aceeași zi) spectrele de reflexie a culorilor a trei petale din diferite flori nepoluate (atunci când este posibil) pe plantă au fost înregistrate folosind un spectrofotometru fiberoptic (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Olanda) și o sursă de lumină pulsată cu Xenon (AvaLight-XE; Avantes). O petală la un moment dat a fost plasată sub spectrofotometru (concentrându-se în mod specific pe partea distală a petalei) și procentul de reflectanță (în raport cu un standard alb) între 200 și 900 nm la fiecare 0,6 nm a fost înregistrat în modul de transmisie. Din spectrul măsurat, în analiză au fost utilizate doar media valorilor de reflectanță la fiecare 10 nm de la 260 la 650 nm din cele trei petale. La plantele din a unsprezecea generație, un subset de plante ca 20 pe replică a fost analizat pentru culoare, deoarece niciunul dintre PC-urile de culoare nu s-a dovedit a fi selectat pe tot parcursul experimentului. Suprafața petalei de absorbție și reflectare a ultravioletului a fost măsurată numai în instalația din generația 11 cu o cameră digitală sensibilă la ultraviolete cu obiectiv de cuarț. S-au făcut poze cu flori și s-a cuantificat suprafața de absorbție ultravioletă folosind pachetul software ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/).

testele de preferință pentru polenizatori

testele pentru preferințele polenizatorilor au fost efectuate pentru fiecare replică cu ambele tipuri de polenizatori. Pentru fiecare replică, au fost efectuate două teste comportamentale (câte unul pentru fiecare polenizator-tratament). Plantele polenizate cu Bumblebee și hoverfly (generația 11) din fiecare replică au fost împerecheate aleatoriu și plasate una lângă alta (distanță de cca 30 cm) într-o cușcă de zbor (2,5 m, 1,8 m, 1,2 m). Un polenizator a fost plasat în cușcă și i s-a permis să viziteze o plantă. Polenizatorii au fost prinși imediat după ce și-au făcut alegerea. Fiecare pereche de plante a fost testată cu un polenizator.

auto-compatibilitate și auto-compatibilitate autonomă

pentru a testa auto-Compatibilitatea, am crescut plante din prima (15 plante pe replică) și a unsprezecea generație (30 de plante pe replică). O sămânță pe familie de semințe (din familii alese aleatoriu) a fost cultivată și două flori pe plantă s-au autoeditat la anthesis. Numărul mediu de semințe produse pe floare selfed pentru fiecare plantă în parte a fost folosit ca o măsurare de auto-compatibilitate.

pentru a testa autonomia autonomă, am crescut ca 12 plante (o sămânță pe familie) pe replică din fiecare tratament al generațiilor 11 și 1 (în total 162 de plante). După 30 de zile când s-au deschis ca 20 de flori, mugurii rămași din fiecare plantă au fost tăiați cu atenție și s-a înregistrat numărul de flori deschise. Planta a fost apoi lăsată să dezvolte fructe fără ca insectele să acceseze plantele. După maturarea fructelor, semințele au fost colectate și numărul de semințe a fost numărat și cântărit pentru fiecare plantă. Numărul de fructe pe floare deschisă și semințe pe fructe au fost utilizate ca măsură pentru auto-autoing. Deoarece câteva plante au avut un număr foarte mare de fructe pe flori deschise, am șters aceste valori aberante pentru compararea finală a selfing autonome. Următorul număr de valori aberante a fost eliminat: 1 în generația 1; în G11: 2 în BB, 3 în HF, 2 în CO.

analiza statistică

pentru a analiza selecția fenotipică, diferențele de selecție și gradienții au fost calculați prin regresarea fitnessului plantelor pe trase61. Această analiză a fost făcută separat pentru tratamente, dar pentru toate replicile și generațiile combinate. Ca o estimare de fitness, a fost folosit’ numărul de vizite’, care a fost o variabilă de numărare și a urmat o distribuție Poisson. O altă variabilă de fitness,’ setul relativ de semințe ‘ a avut o distibuție părtinitoare de numeroasele valori zero; în plus, setul de semințe a ratat singura componentă de fitness masculină a primei plante vizitate, care nu a stabilit semințe din această vizită (deoarece polenizatorii inițial nu purtau polen de Brassica). Cu toate acestea, numărul de vizite a fost puternic corelat cu setul relativ de semințe (BB: r626=0,694, p<0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Modelele liniare generalizate (cu distribuție Poisson) au fost utilizate pentru a calcula gradienții de selecție (multivariate) și diferențialele (univariate) pentru fiecare tratament cu numărul de vizite ca variabilă dependentă și trăsături ca covariabile. În plus, gradienții de selecție pătratică au fost calculați cu toate trăsăturile și termenul pătrat al fiecărei trăsături adăugate modelului și, ulterior, gradienții dublați62. Pentru a verifica diferențele de selecție între bondari și hoverflies, a fost efectuat un model liniar generalizat (cu distribuție Poisson) cu numărul de vizite ca variabilă dependentă, tratamentul ca factor fix, trăsăturile plantelor ca covariabile și tratamentul de interacțiune*trăsătura plantelor. Înainte de analiza de selecție, toate variabilele au fost standardizate la media = 0 și s. d.=1 (valorile Z) la nivelul replicat. Un model liniar generalizat a fost, de asemenea, utilizat pentru a compara ratele de vizitare între plantele polenizate de bondar și hoverfly din toate generațiile. Valorile spectrofotometrului de culoare florală au fost reduse prin analiza componentei principale (PC) cu rotație varimax. Numai PC-urile cu o valoare proprie deasupra unuia au fost utilizate în analiză.

schimbarea evolutivă a trăsăturilor plantelor a fost evaluată la plantele din generația a 11-a folosind analiza funcției discriminante liniare multivariate și modele liniare generale univariate (GLM). Pentru GLM, fiecare trăsătură a fost utilizată ca variabilă dependentă, replicată ca factor aleatoriu și tratament ca factor fix cu testul post-hoc LSD. Pentru a diferenția impactul selecției naturale de drift, am evaluat dacă diferențele de trăsături au fost consistente între replicile unui anumit tratament de polenizare. În analiza GLM, un efect semnificativ de tratament indică diferența de trăsătură între diferitele grupuri de polenizatori din toate replicile și, astfel, discriminează evoluția specifică polenizatorului de drift. Deriva ar fi indicată doar de modificările evolutive ale unor replici (aleatorii), indicate de o semnificație a factorului ‘replică’ sau a interacțiunii dintre ‘replică’ și ‘tratament’. Auto-Compatibilitatea și autonomia autonomă au fost evaluate și de GLM, dar valorile plantelor de primă generație au fost incluse în analiză. Pentru analizele volatilelor și volumului nectarului, datele au fost transformate ln(1+x) pentru a se apropia de distribuția normală. Pentru GLM cu variabilele de culoare, a fost efectuată o analiză PC așa cum este descris mai sus, dar fără standardizarea prealabilă a variabilelor. Analiza PC a fost efectuată pentru toate tratamentele, replicile și toate generațiile, rezultând patru PC-uri care explică 96,9% din varianța totală. Frecvența florilor fără nectar a fost analizată separat pentru fiecare generație, utilizând modele liniare generalizate cu distribuție bimodală, cu ‘prezența nectarului’ (da/nu) ca variabilă dependentă și tratament și replicare ca factori. Trăsăturile florilor nectarifere și nectaroase au fost comparate pentru a noua și a unsprezecea generație împreună, folosind modele liniare generale cu trăsătura ca variabilă dependentă și’ prezența nectarului ‘ și tratamentul ca factori fixați. Preferințele de primă alegere ale bondarilor și hoverflies au fost analizate prin testul binomial (test-prop=0,5; toate replicate grupate). Corelațiile dintre nectar și trăsăturile plantelor au fost calculate pentru toate generațiile combinate folosind corelații produs-moment Pearson cu valori transformate în ln. Statisticile au fost realizate cu statistici IMB SPSS (versiunea 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

disponibilitatea datelor