introducere

Halofilele sunt un grup interesant de organisme înfloritoare la salinitate ridicată. Aceste organisme pot fi clasificate în general pe baza salinității lor optime pentru creștere în halofile ușoare (1-6%, g/v NaCl), halofile moderate (7-15%) și halofile extreme (15-30%) (Madigan și Martinko, 2006). Cercetări ample au arătat că halofilele nu sunt limitate la niciunul dintre domeniile vieții, ele pot fi eucariote (Gunde-Cimerman și colab., 2000; Zalar și colab., 2005), sau procariote aparținând domeniilor bacteriilor și Archaea. Genul algal Dunaliella și creveții cu saramură Artemia (Boetius și Joye, 2009) sunt exemple de eucariote halofile, în timp ce Halobacterium și Salinibacter sunt exemple de procariote halofile. Succesul halofililor în supraviețuirea în medii foarte sărate se datorează adaptărilor fiziologice unice, cum ar fi strategia de pompare a ionilor și acumularea de substanțe dizolvate organice (Oren, 2006; Madigan și Martinko, 2006). La nivel genomic și proteomic, halofilele se caracterizează prin conținut ridicat de GC și proteine caracterizate prin hidrofobicitate scăzută, supra-reprezentare a reziduurilor acide, înclinații mai mici de formare a helixului și înclinații mai mari ale structurii bobinei (Paul și colab., 2008).

Halofilele câștigă acum mai mult acces la microbiologia industrială și biotehnologia, deoarece halofilele cresc la o concentrație mare de sare și acest lucru minimizează riscul de contaminare în timpul cultivării (Oren, 2006). Câteva exemple de aplicații biotehnologice sunt utilizarea Micrococcus varians pentru a produce nucleaza H (Kamekura el al., 1982) și utilizarea tulpinilor de Tetragenococ halofil în producția de sos de soia și producerea unor enzime, inclusiv hidrolaze (amilaze, nucleaze, fosfataze și proteaze) (Oren, 2006). Halofilele sunt, de asemenea, importante în biodegradare și bioremediere, deoarece mulți halofili sunt capabili să degradeze hidrocarburile și alți compuși toxici (Ventosa și colab., 1998). Halofilele pot produce, de asemenea, polimeri utilizați ca agenți de ameliorare a recuperării uleiului datorită activității lor de surfactant și a proprietăților bioemulsificante (Oren, 2006).

Halofilele înfloresc în medii în care salinitatea atinge niveluri ridicate, cum ar fi oceanele, salternele solare și lacurile naturale sărate (Oren, 2007). Marea Moartă a Iordaniei este unul dintre cele mai mari lacuri sărate interioare cu adevărat hipersaline din lume (Boetius și Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan și Martinko, 2006). Pe lângă salinitatea ridicată; sare, concentrație de peste 340 g L – 1 (Oren, 2007), Marea Moartă este unică prin presiunea barometrică ridicată (800 mmHg) datorită altitudinii foarte scăzute sub nivelul mării, presiunii parțiale a oxigenului (PIO2) cu 8% mai mult decât la nivelul mării, radiațiilor UV unice, umidității scăzute (sub 40%) și lipsei de ploaie (Avriel și colab., 2011).

acest studiu a fost realizat pentru a clasifica speciile bacteriene heterotrofe halofile înfloritoare în zona litorală a Mării Moarte a Iordaniei. Clasificarea microbiană se bazează pe morfologia colonială și celulară, precum și pe similitudinea genei ARNr 16S.

materiale și metode

eșantionare: probele de apă din Marea Moartă au fost colectate din patru zone litorale (Fig. 1) În martie, iunie și octombrie 2011. Coordonatele geografice și cota locurilor de eșantionare sunt prezentate în tabelul 1. Coordonatele geografice și altitudinea au fost determinate pentru fiecare locație de (eTrex Legend C, Taiwan). Probele de apă din Marea Moartă au fost colectate într-o sticlă sterilă curată de 1 L, lăsând suficient spațiu în cap în sticlă și transportate imediat la laborator.

analiza fizico-chimică a probelor: Au fost determinate temperatura, pH-ul, totalul solidelor dizolvate (TDS) și cererea biologică de oxigen (BOD) a probelor de apă. Temperatura apei, pH – ul și salinitatea au fost măsurate in situ. Temperatura apei și pH-ul au fost măsurate cu un pH-metru portabil (microcalculator pH-metru T19000, instrumente Trans). Salinitatea a fost măsurată printr-un refractometru de salinitate portabil. BOD a fost măsurat în (Centrul de cercetare pentru apă, mediu și regiuni aride de la Universitatea Al al-Bayt, Iordania). Probele de apă au fost transferate într-o nouă sticlă de sticlă, apoi s-au adăugat 1 mL de tampon fosfat, sulfat de magneziu, clorură de calciu, soluții de clorură de fier pe litru de probă de apă. Eșantionul a fost apoi adus la temperatura de 20 octombrie 3 octombrie C și saturat cu aer filtrat fără organice. PH-ul probei a fost verificat. Dacă eșantionul nu se încadra în intervalul 6,5-7,5, s-a adăugat acid sulfuric sau hidroxid de sodiu pentru a aduce eșantionul la intervalul de pH necesar (6,5-7,5) și concentrația adăugată nu a diluat eșantionul mai mult de 0,5%. Eșantionul a fost adus la temperatura de 20 centimetric C înainte de a face diluții. Volumul adecvat al eșantionului a fost apoi transferat în sticlele BOD. Sticla a fost umplută cu suficientă apă de diluare pentru a deplasa tot aerul fără a lăsa bule. Oxigenul dizolvat (DO) a fost determinat folosind un analizor DO și orice conținut deplasat a fost înlocuit cu apă de diluare și dop strâns. Flaconul a fost incubat timp de 5 zile la 20 centimetrii C. După aceea, s-a determinat DO și s-a calculat BOD ca urmare a diferenței dintre DO-ul inițial și Do-ul final față de volum.

Îmbogățire, izolare și colorare gram: Pentru îmbogățirea probelor de apă, apa din Marea Moartă (10 mL) a fost transferată în 90 mL de mediu lichid cu salinitate ridicată și incubată la 30 centimetric C în întuneric cu agitare (100 rpm). După aproximativ 12 ore, o buclă plină de cultură de îmbogățire a fost strecurată pe un mediu de sare minerală solidă modificată și coloniile separate au fost apoi subculturate. Stocurile de glicerol ale izolatelor au fost, de asemenea, preparate și depozitate la -20 CTC pentru analize ulterioare. Celulele au fost colorate Gram și examinate la microscop.

secvențierea și analiza genei ARNr 16S: amplificarea și secvențierea secvenței genei ARNr 16S a fost efectuată de Macrogen Inc., Seul, Coreea, conform următoarei metode: coloniile tinere ale tulpinilor bacteriene au fost suspendate într-un tub de centrifugă de 1,5 mL conținând 0,5 mL soluție salină sterilă și apoi centrifugate la 10.000 rpm timp de 10 min supernatantul a fost îndepărtat și peleta a fost suspendată în 0,5 mL de matrice InstaGene (Bio-Rad, SUA) și incubate la 56 CTC timp de 30 min și apoi încălzite la 100 CTC timp de 10 min. După încălzire, supernatantul a fost utilizat pentru PCR. PCR s-a realizat prin amestecarea a 1 oqql de ADN șablon cu 20 oqql de soluție de reacție PCR. Primeri 27F/1492r (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5’-TAC GGY Tac CTT GTT ACG ACT T-3′) au fost utilizate pentru amplificare și apoi s-au efectuat 35 de cicluri de amplificare la 94 CTC timp de 45 sec, 55 CTC timp de 60 sec și 72 CTC timp de 60 sec. primerii PCR Necorporați și dNTP-urile au fost îndepărtate din produsele PCR prin Kit de curățare PCR montaj (Millipore). Produsele PCR purificate de aproximativ 1.400 bp au fost secvențiate de primeri 518F/800R (518f: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800r: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Secvențierea a fost realizată prin utilizarea big dye terminator cycle sequencing kit v. 3.1 (Applied BioSystems, SUA). Produsele de secvențiere au fost rezolvate pe un sistem automat de secvențiere ADN aplicat Biosystems model 3730xl (Applied BioSystems, SUA) la Macrogen, Inc., Seul, Coreea.

secvențele au fost analizate și comparate cu baza de date publică de nucleotide utilizând site-ul NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Secvențele celor mai apropiate rude au fost apoi preluate din Baza de date și utilizate pentru a construi un arbore filogenetic folosind MEGA5 (Tamura și colab., 2011). Conținutul GC secvențele au fost calculate de Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

rezultate

proprietățile fizico-chimice ale probelor: probele de apă din Marea Moartă au fost foarte saline variind de la (36-38%). Valorile pH-ului probelor au fost scăzute și variază de la 5,6 la 6,3. Aceasta indică proprietatea ușor acidă a apei de mare. Valoarea BOD a fost foarte scăzută (1-2 mg O2 L-1) indicând un conținut foarte scăzut de material organic în probă. Proprietățile fizico-chimice sunt prezentate în tabelul 2.

număr de bacterii viabile heterotrofe: rezultatele numărului de plăci viabile au evidențiat un număr foarte mic de unități care formează colonii în fiecare probă (200-6000 CFU mL-1). Numărul CFU este prezentat în mai multe detalii în tabelul 3.

izolarea și clasificarea bacteriilor heterotrofe halofile: în acest studiu, am izolat 44 de tulpini bacteriene heterotrofe halofile. Unsprezece tulpini de bacterii din 44 au fost considerate diferite pe baza morfologiei coloniale, a colorării Gram și a morfologiei celulare. Șapte din unsprezece tulpini diferite au fost Gram-pozitive și 4 din 7 au fost Gram negative. Tulpinile bacteriene au fost identificate pe baza analizei genei ARNr 16S și s-a constatat că aparțin domeniului bacteriilor. Cea mai apropiată rudă a fiecărei tulpini bacteriene izolate este prezentată în tabelul 4 și Fig. 2. Toate secvențele au prezentat un conținut relativ ridicat de GC (până la 58%).

discuție

proprietățile fizico-chimice ale probelor de apă din Marea Moartă au fost determinate și analizate. Procentul de salinitate sa dovedit a fi foarte mare (până la 38%). Aceasta este o caracteristică tipică a apei din Marea Moartă, făcându-l unul dintre celebrele saramuri “athalassohaline” (Oren, 2007). PH-ul apei din Marea Moartă s-a dovedit a fi ușor acid (5,6-6,3) în comparație cu pH-ul (7,5-8) în saramurile talasohaline (Oren, 2007). CBO-ul probelor a fost foarte scăzut (1-2 mg O2 L-1) reflectând material organic scăzut în apă care ar putea fi utilizat de bacteriile heterotrofe. Aceste condiții fizico-chimice afectează, fără îndoială, negativ diversitatea microbiană. Prin urmare, numărul de celule viabile din probele testate a fost foarte scăzut (nu mai mult de 6X102 CFU mL-1) în comparație cu apa de mare deschisă. Numărul de bacterii heterotrofe din apele marine este de obicei de ordinul a 105 până la 106 bacterii mL-1 (Zweifel și Hagstrom, 1995; Madigan și Martinko, 2006). Aceste numere sunt derivate din tehnici nespecifice de colorare fluorescentă (Zweifel și Hagstrom, 1995) care oferă de obicei numere mai mari decât metoda de numărare a plăcilor viabile. Primele publicații despre numărul de bacterii din Marea Moartă au fost realizate prin microscopie. Numărul de celule a fost de aproximativ 1.9×106 celule mL1 și în timpul unei înfloriri de halobacterii roșii densitățile populației au ajuns la 1, 9×107, dar au scăzut după molii la 5×106 (Oren, 1983).

cercetările asupra organismelor halofile care locuiesc în Marea Moartă au început foarte devreme în 1892, când bacteriile au fost izolate din genul Clostridium din noroi (Oren, 2002). Mai târziu, într-un scurt articol publicat în 1936, a dat prima descriere a unei comunități microbiene indigene adaptate condițiilor extrem de dure ale Mării Moarte (Oren și Ventosa, 1999). Din acel moment, cunoștințele noastre despre aspectele biologice ale Mării Moarte se extind și se acumulează. Am efectuat această cercetare pentru a ne extinde cunoștințele despre bacteriile heterotrofe halofile care înfloresc în zona litorală a Mării Moarte iordaniene. Am izolat diferite specii bacteriene. Ulterior, am izolat și identificat 11 specii diferite de bacterii halofile. Majoritatea izolatelor au fost Gram-pozitive (7 din 11). Chiar dacă bacteriile Gram pozitive posedă adaptări importante care le permit să facă față stresului de mediu, cum ar fi salinitatea ridicată (Battistuzzi și Hedges, 2009). Nu este clar în literatura de specialitate dacă bacteriile Gram-pozitive sau bacteriile Gram-negative sunt dominante în mediile hipersaline. Într-un studiu asupra halofilelor procariote recuperate din sedimentele din Lacul Sărat el-Djerid din Tunisia, Hedi și colab. (2009) a constatat că populația bacteriană dominantă aparține bacteriilor Gram-pozitive care formează spori.

toate tulpinile izolate din acest studiu aparțin domeniului bacteriilor. Acestea aparțin 7 genuri diferite în domeniu. Cinci din șapte izolate bacteriene Gram-pozitive aparțin genului Bacillus. Acest gen a fost înființat în 1872 pentru a include trei specii, dar acum există 142 de specii numite Bacillus enumerate în manualul de Bacteriologie sistematică al lui Bergey (Logan și de vos, 2009). Tulpinile de bacil sunt de obicei tulpini de sol. Tulpinile de bacil izolate în acest studiu aparțin următoarelor specii B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis și B. cereus. Aceste tulpini au fost întâlnite în diferite medii sărate (Miranda și colab., 2008; Parvathi și colab., 2009; Yoon și colab., 2004; Al-ZaZaee și colab., 2011). De exemplu, B. licheniformis a fost recuperat anterior din sedimentele marine de Miranda și colab. (2008), în timp ce B. pumilus a fost izolat de organisme marine precum stridiile, crabul și peștele pe lângă sedimente de Parvathi și colab. (2009). B. hwajinpoensis a fost recuperat din apa de mare a mării de Est și a Mării Galbene din Coreea (Yoon și colab., 2004). Și în cele din urmă B. cereus, o bacterie comună a solului, a fost întâlnită în apa de canalizare, dar cu proprietăți halofile (Al-ZaZaee și colab., 2011). Peretele celular gros, conținutul ridicat de peptidoglican (mai mult de 90% din peretele celular) (Madigan și Martinko, 2006), conținutul ridicat de GC și formarea de spori rezistenți sunt principalele motive pentru supraviețuirea bacilului în condiții dure, cum ar fi salinitatea ridicată. Trebuie remarcat faptul că tulpina DSD32 (identificată ca B. cereus) are asemănarea foarte scăzută cu cea mai apropiată rudă B. cereus. Această tulpină poate reprezenta o nouă specie din genul Bacillus bazată pe gena ARNr 16S.

celelalte două bacterii Gram-pozitive sunt tulpini de Arthrobacter sp. și Kocuria eug. Speciile de artrobacter sunt distribuite pe scară largă în natură, în special în sol (Funke și colab., 1996), dar nu este foarte frecventă în mediile hipersaline. Kocuria rosea este considerată specie moderat halofilă și a fost recuperată din diferite medii saline, cum ar fi apa salină deschisă și unele tulpini de Kocuria rosea cresc optim la concentrația de NaCl de 30% (Wright și Tanaka, 2002).

bacteriile Gram negative au fost mai puțin frecvente în probele noastre (4 din 11). Cu toate acestea, literatura publicată arată că aceste izolate nu sunt neobișnuite în mediile sărate. Una dintre tulpinile izolate a fost identificată ca Vibrio alginolyticus. Ultima specie este de fapt comună în probele marine (Molitoris și colab., 1985) și a fost întâlnit în apa de mare marină. Tulpina are importanță medicală, deoarece poate provoca infecții complicate ale pielii și țesuturilor moi (Sganga și colab., 2009). Mai important, s-a constatat că unele tulpini de Vibrio alginolyticus produc tetrodotoxină, o neurotoxină puternică (Noguchi și colab., 1987). O altă bacterie Gram-negativă identificată în acest studiu este Chromohalobacter salexigens. Această specie a fost mai întâi izolată și descrisă ca specie moderat halofilă Halomonas elongata și apoi propusă ca specie nouă de Chromohalobacter (Arahal și colab., 2001). Eritrobacter gaetbuli este o altă specie identificată în acest studiu. Această tulpină nu este, de asemenea, neobișnuită pentru habitatele saline. A fost recent izolat de maree plat din Marea Galbenă în Coreea și a fost descris ca specie halofilă de Yoon și colab. (2005). Ultima tulpină aparține lui Salinivibrio costicola. Această specie a fost descrisă pentru prima dată ca Vibrio costicola, dar caracteristicile sale fenotipice și genotipice au distins-o de speciile genului Vibrio. Prin urmare, tulpina a fost plasată într-un nou gen separat numit Salinivibrio (Mellado și colab., 1996). Salinivibrio costicola este moderat halofil și a fost izolat inițial din alimentele sărate și crește optim în medii care conțin 10% săruri (Mellado și colab., 1996). Un membru al genului Salinibacter, S. ruber, este un model interesant pentru studiul adaptării microorganismelor la viață la concentrații mari de sare (Oren, 2007).

concluzie

apa Mării Moarte din zona litorală se caracterizează prin salinitate ridicată, pH scăzut, conținut scăzut de material organic (bod scăzut) și restrânge diferite specii de bacterii heterotrofe aparținând genurilor Gram-pozitive și Gram-negative, inclusiv Artrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus și Erythrobacter.

recunoaștere

acest studiu a fost susținut de decanatul cercetării academice de la Universitatea Al al-Bayt, Iordania, decizia Consiliului de cercetare științifică în ședința numărul 2/2010/2011. Astfel, autorul ar dori să aprecieze asistența financiară oferită de universitate.