o projeto Experimental e estudo do sistema

Em 2012, a 300 sementes de rápido de bicicleta Brassica rapa plantas (Wisconsin Rápido Plantas Padrão de Sementes, com alta variação genética) foram obtidos a partir de Carolina Biológica de Suprimentos, e crescido em um phytotron sob padronizados, solo, luz e rega condições. Estas plantas são totalmente extrovertidas (auto-incompatíveis) e abrigam suficiente variação genética permanente para responder prontamente à seleção 58,59. A partir dessas 300 plantas, 108 famílias de sementes SIB cheias foram geradas por cruzamentos artificiais (apenas famílias de sementes de cruzamentos onde ambos os pais produziram frutos foram usados). Estas 108 famílias de sementes SIB completas foram usadas como população inicial para a experiência.

para a primeira geração da experiência, foram estabelecidos três grupos de tratamento utilizando as 108 famílias, de modo que cada família foi representada em cada tratamento para controlar o genótipo entre os tratamentos (Figo suplementar. 1). Cada tratamento consistiu, portanto, em 108 plantas (representando 108 famílias de sementes), que subdividimos em três replicados (a,B, C) cada uma contendo 36 plantas. As réplicas dentro dos tratamentos foram mantidas como linhas isoladas durante 9 gerações (não foram feitas Cruzes entre réplicas) para serem capazes de avaliar mudanças evolucionárias independentes e repetíveis. As plantas de todas as réplicas em todos os tratamentos foram cultivadas no fitotron em solo padronizado (einheitserde classic), luz (24 h luz) e condições de rega. Todas as plantas foram fenotipadas a cada segunda geração, começando com a geração 1. Os dados florais das gerações 1 e 3 foram perdidos devido a problemas técnicos; em vez disso, o perfume foi coletado da geração 4. Os dados de aroma Floral da geração 1 foram obtidos após o final do experimento através do re-cultivo de plantas da geração inicial e coleta de perfume de uma planta de cada uma das 108 famílias de sementes. Assim, a partir da primeira geração no total 108 plantas (36 de cada replicado) foram amostradas para o aroma floral ao mesmo tempo que as plantas da geração 9.no nosso estudo, utilizámos três pollinadores: bumblebees (BB, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Suíça), hoverflies (HF, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Alemanha) e polinização manual. Ambos os insetos visitam prontamente flores de muitas espécies de Brassicaceae na natureza, mas representam diferentes categorias de polinizadores funcionais, e tem sido demonstrado que variam em abundância em habitats naturais 46. O uso de espécies de polinizadores únicos imita ambientes de polinizadores nos quais os polinizadores mais abundantes são funcionalmente diferentes. No tratamento de controlo (“CO”), as plantas escolhidas aleatoriamente foram polinizadas manualmente.a polinização foi realizada 23 dias após a semeadura em uma gaiola de vôo (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) na estufa, em condições de luz padronizadas com abelhões e moscas varejeiras. Os experimentos foram realizados entre 0900 horas e 1500 horas. Os Bumblebees foram mantidos em uma gaiola de vôo separada na estufa. As moscas voadoras foram compradas como pupas e criadas até a eclosão, após a qual as moscas macho e fêmea foram separadas. Os polinizadores foram autorizados a forragear em ciclos rápidos B. plantas de rapa (plantas do grupo de controlo da respectiva geração) e alimentados com pólen adicional até 3 dias antes do tratamento de polinização; depois, apenas pólen e Solução de açúcar foram fornecidos; 16 h. antes da polinização, os polinizadores estavam esfomeados. para polinização, todas as plantas de uma réplica foram colocadas aleatoriamente num quadrado de 6 × 6 plantas com uma distância de 20 cm umas das outras na gaiola de voo. Cinco polinizadores foram adicionados individual e sequencialmente e cada inseto foi autorizado a visitar um máximo de três plantas diferentes e, em seguida, removido da gaiola; cada inseto foi usado apenas uma vez. No total, 12-15 plantas por replicado receberam uma ou mais visitas de polinizadores. A média global (±S. D.) do número de visitas (em plantas visitadas) foi de 1,35±0,63 para plantas polinizadas por abelhões e de 1,28±0,53 para plantas polinizadas por hoverfly. Para as plantas que foram visitadas, o número de visitas e o número de flores visitadas foram registrados. No grupo de controle, 12 plantas foram escolhidas aleatoriamente por replicado e 5 flores de cada planta foram polinizadas à mão por uma planta pai escolhida aleatoriamente; pais foram escolhidos entre as mesmas 12 plantas. Cada planta pode ser doadora de pólen para mais de uma planta, mas só recebeu pólen de uma planta. Após a polinização, as flores visitadas foram marcadas e as plantas foram mantidas em uma gaiola por mais 30 dias até que os frutos foram coletados. As sementes foram contadas e o conjunto relativo de sementes foi calculado para cada planta dividindo o conjunto individual de sementes pela média de sementes estabelecida no replicado. Além disso, o número de sementes por fruto foi calculado para cada planta visitada. Para cada fitness vegetal masculino foi estimado como paternidade prevista (número de eventos de exportação de pólen).a partir de todas as sementes produzidas pelas flores polinizadas, um subconjunto de sementes representativo da produção de sementes de cada indivíduo foi usado para crescer na próxima geração. Quanto mais sementes uma planta produzia, mais sementes contribuía para a próxima geração, que mais uma vez consistia em 36 plantas para cada replicado. A contribuição de sementes de cada planta visitada para a próxima geração foi calculada para cada replicado como: 36 / (soma replicada de sementes / conjunto individual de sementes). Valores inferiores a 0,5 foram arredondados para 1.a depressão Endogamica durante todo o experimento foi quantificada medindo o peso das sementes e a taxa de germinação, esta última em percentagem de sementes germinadas por replicado. Para controlar o traço-alterações devido à consanguinidade (inbreeding depression, de sementes produzidas por plantas da 9ª geração foram cultivadas (representando a 10ª geração) e manualmente cruzados entre replica dentro dos tratamentos, de modo que as plantas de cada repetição foram doador de pólen pólen e do destinatário para as plantas de dois diferentes replica (♀Um-♂C, ♀B-♂Um, ♀C-♂B). Cruzamentos dentro destas combinações de replicados foram aleatórios. Das sementes resultantes (décima primeira geração), um indivíduo por família de sementes foi cultivado (36 plantas por replicado) nas mesmas condições que durante o experimento. Destes cruzamentos inter-replicados, traços foram novamente medidos e usados para a comparação final de traços entre grupos de tratamento.a maioria dos traços, incluindo o aroma floral, foram medidos antes da polinização, 19-21 dias após a semeadura. Largura da pétala, Comprimento, Comprimento do pistil e diâmetro da flor de três flores escolhidas aleatoriamente por planta foram medidas com um paquímetro eletrônico (Calibrador Digital 0-150 mm, “TOOLCRAFT”). O néctar de três flores foi recolhido com tubos micro capilares de 1 µl (Blaubrand, Wertheim, Alemanha) e o volume determinado pela medição do comprimento da coluna de néctar na micropipeta com um paquímetro. Para a quantificação, foi utilizada a média de três flores. Para 157 plantas repartidas uniformemente pelos tratamentos, o teor de açúcar do néctar foi determinado por derivatização e análise cromatográfica em fase gasosa. Para isso, o néctar foi transmitido para filtrar papel armazenado em sílica-gel. O sector do papel de filtro que contém o néctar foi cortado do resto do papel de filtro e o néctar foi eluído em 1 ml de água Mili-Q de alta pureza, agitando a diluição durante 90 minutos com 400 m. p.m.a 60 °C num agitador de laboratório. Depois de 50 µl da solução foram secas a 60 °C e derivadas com 100 µl de uma mistura de anidro nucleotides (Fisher Scientific, Geel, Bélgica), hexamethylsilazane (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) e trimethylchlorosilane (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) (10:5:3). Subsequentemente, as amostras foram colhidas por GC-MS, conforme descrito na ref. 32. Calculámos as quantidades totais de açúcar por flor e inflorescência como a soma de todos os diferentes açúcares (frutose, glucose, sacarose e sorbitol). A correlação entre o teor de açúcar néctar e o volume de néctar foi positiva e elevada (r156=0, 732, P<0, 001), assim, para as restantes plantas, apenas o volume de néctar foi determinado. A colecção de aromas florais foi feita antes dos bioensaios de uma forma não destrutiva de todas as inflorescências das plantas assim que pelo menos cinco flores estavam abertas. Usámos sorção no headspace com um sistema push-pull 59, 60. As inflorescências das plantas foram fechadas em cilindros de vidro previamente revestidos com sigmacote (Sigma-Aldrich) e fechados com uma placa de Teflon. O número de flores abertas foi contado para cada planta. O ar da envolvente foi empurrado com um caudal de filtros de carvão activado de 100 ml min−1 para o cilindro de vidro. Simultaneamente, o ar foi retirado do cilindro de vidro com um caudal de 150 ml min−1 através de um tubo de vidro cheio com ∼30 mg de Tenax TA (malha 60/80; Supleco, Bellefonte, PA, EUA). O ar dos cilindros de vidro vazios foi coletado como controles de ar. Voláteis florais foram coletados por duas horas em um fitotrão sob condições padronizadas de luz e temperatura. A quantificação das substâncias voláteis foi efectuada por cromatografia em fase gasosa com detecção selectiva em massa (GC–MSD). As amostras foram injectadas num GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) por um amostrador polivalente (MPS; Gerstel, Müllheim, Alemanha) utilizando uma unidade de dessorção térmica Gerstel (TDU; Gerstel) com um sistema de injecção a frio (CIS; Gerstel). Para a termodesorção, o TDU foi aquecido de 30 a 240 ° C a uma taxa de 60 °C min−1 e mantido a uma temperatura final de 1 min. O CIS foi ajustado para -150 °C durante o aprisionamento de compostos eluindo a partir do TDU. Para injecção, o CIS foi aquecido a 250 ° C a uma taxa de 12 °C s−1, e a temperatura final foi mantida durante 3 minutos. O GC foi equipado com uma coluna HP-5 (0,25 mm de diâmetro, 0,25 µm de espessura de película, 15 m de comprimento), e o hélio foi usado como gás portador a um débito de 2 ml min−1. A identificação e quantificação do composto foram feitas após 60 com o Agilent MSD ChemStation Program. A quantificação dos compostos foi obtida através da medição das áreas de pico dos iões-alvo seleccionados específicos dos compostos odoríferos individuais. Foram obtidos iões-alvo específicos a partir de padrões sintéticos de todos os compostos; as áreas de pico foram convertidas em quantidades absolutas utilizando curvas de calibração previamente obtidas para cada composto utilizando compostos sintéticos em três concentrações diferentes. Apenas compostos odoríferos que estavam presentes em quantidades significativamente mais elevadas do que no controle do ar foram incluídos na análise (no total 14 compostos odoríferos). Todas as quantidades de voláteis foram calculadas em pg por flor L−1 de ar amostrado.vinte e três dias após a semeadura, no mesmo dia em que a polinização foi feita, o número de flores abertas e a altura de cada planta foram registrados. Após a polinização (mas no mesmo dia), os espectros de reflexão de cor de três pétalas de diferentes flores não polinizadas (quando possível) por planta foram registados utilizando um espectrofotómetro fiberóptico (AvaSpec-2048).; Avantes, Apeldoorn, Países Baixos) e uma fonte de luz pulsada de xenônio (AvaLight-XE; Avantes). Uma pétala de cada vez foi colocada sob o espectrofotômetro (focando especificamente na parte distal da pétala) e a porcentagem de refletância (em relação a um padrão branco) entre 200 e 900 nm a cada 0,6 nm foi registrado no modo de transmissão. Do espectro medido, apenas a média dos valores de refletância a cada 10 nm, de 260 a 650 nm das três pétalas, foi utilizada na análise. Nas plantas da décima primeira geração, analisou-se a cor de um subconjunto de cerca de 20 plantas por replicado, dado que nenhum dos PCs a cores foi seleccionado ao longo da experiência. A área da superfície de pétala absorvente e refletora do ultravioleta foi medida apenas na planta da geração 11 com uma câmera digital sensível ao ultravioleta com lente de quartzo. Imagens de flores foram tiradas e área de absorção ultravioleta quantificada usando o pacote de software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).os ensaios de preferência dos polinizadores para as preferências dos polinizadores foram realizados para cada replicado com ambos os tipos de polinizadores. Para cada replicado, foram realizados dois ensaios comportamentais (um para cada Polinizador-tratamento). As plantas polinizadas por Bumblebee e hoverfly (geração 11) de cada replicado foram aleatoriamente emparelhadas e colocadas lado a lado (cerca de 30 cm de distância) numa gaiola de voo (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Um polinizador foi colocado na gaiola e autorizado a visitar uma planta. Os polinizadores foram imediatamente apanhados depois de terem feito a sua escolha. Cada par de plantas foi assediado com um polinizador.

self-compatibility and autonomous selfing

To test for self-compatibility, we grew plants from the first (15 plants per replicate) and the eleventh generation (30 plants per replicate). Uma semente por família de sementes (de famílias escolhidas aleatoriamente) foi cultivada e duas flores por planta selfed em antesis. O número médio de sementes produzidas por flor selfed para cada planta individual foi usado como uma medida de auto-compatibilidade.para testar a selfing autônoma, cultivamos cerca de 12 plantas (uma semente por família) por replicado de cada tratamento da geração 11 e 1 (no total 162 plantas). Depois de 30 dias quando cerca de 20 flores tinham aberto, os botões restantes em cada planta foram cuidadosamente cortados e o número de flores abertas foi registrado. A planta foi então autorizada a desenvolver frutos sem nenhum inseto acessando as plantas. Após o amadurecimento dos frutos, as sementes foram coletadas e o número de sementes foi contado e pesado para cada planta. O número de frutos por flor aberta e sementes por frutos foram usados como medida para a auto-auto-suficiência autônoma. Como algumas plantas tinham um número muito elevado de frutos por flores abertas, eliminamos estes valores para a comparação final de selfing autônomo. Foi suprimido o seguinte número de casos anómalos: 1 na geração 1; no G11: 2 no BB, 3 no HF, 2 no CO.

análise estatística

para analisar a selecção fenotípica, os diferenciais de selecção e os gradientes foram calculados através da regressão da aptidão das plantas nos traços 61. Esta análise foi feita separadamente para os tratamentos, mas para todas as réplicas e gerações combinadas. Como uma estimativa de fitness,’ número de visitas ‘ foi usado, que era uma variável de contagem e seguiu uma distribuição de Poisson. Outra variável de fitness,’ relative seed set ‘ teve uma distibução distorcida pelos muitos valores nulos; além disso, o seed set falhou o único componente masculino de fitness da primeira planta que foi visitada, que não estabeleceu semente a partir desta visita (porque os polinizadores inicialmente não carregavam pólen de Brassica). O número de visitas foi, no entanto, fortemente correlacionada com relativa produção de sementes (BB: r626=0.694, P<0.001; HF: r605=0.597, P<0.001). Modelos lineares generalizados (com distribuição de Poisson) foram usados para calcular gradientes de seleção (multivariados) e diferenciais (univariados) para cada tratamento com número de visitas como variáveis dependentes e traços como covariados. Além disso, gradientes de seleção quadrática foram calculados com todas as características e o termo quadrado de cada traço adicionado ao modelo, e gradientes subsequentemente dobrados 62. Para verificar diferenças na seleção entre abelhões e hoverflies, um modelo linear generalizado (com distribuição de Poisson) com número de visitas como variável dependente, tratamento como fator fixo, traços de plantas como covariatas e o tratamento de interação*traço de planta foi realizado. Antes da análise de seleção, todas as variáveis foram padronizadas para média=0 e s. d.=1 (Valores Z) no nível replicado. Um modelo linear generalizado também foi usado para comparar taxas de visitação entre plantas polinizadas por bumblebee e hoverfly em todas as gerações. Os valores do espectrofotómetro de cor Floral foram reduzidos através da análise principal do componente (PC) com rotação de varimax. Na análise, apenas foram utilizados PCs com um valor eigenvalue acima de um.

a alteração evolutiva das características das plantas foi avaliada em plantas da 11ª geração usando análise multivariada da função discriminante linear e modelos lineares gerais univariados (GLM). Para GLM, cada traço foi usado como variável dependente, replicado como fator Aleatório e tratamento como fator fixo com LSD Teste post-hoc. Para discriminar o impacto da seleção natural da deriva, avaliamos se as diferenças de traços eram consistentes entre as réplicas de um determinado tratamento de polinização. Na análise GLM, um efeito significativo de “tratamento” indica uma diferença de traços entre diferentes grupos polinizadores em todas as réplicas, discriminando assim a evolução específica do polinizador da deriva. A deriva seria indicada apenas por alterações evolutivas em alguns replicados (aleatórios), indicadas por um significado no factor “replicado” ou pela interacção entre “replicado” e “tratamento”. A auto-compatibilidade e a auto-autonomia também foram avaliadas pela GLM, mas os valores das plantas de primeira geração foram incluídos na análise. Para a análise dos voláteis e do volume de néctar, os dados foram ln(1+x) transformados de modo a aproximarem-se da distribuição normal. Para o GLM com as variáveis de cor, uma análise PC foi realizada como descrito acima, mas sem padronização prévia das variáveis. A análise PC foi realizada para todos os tratamentos, replicados e todas as gerações em conjunto, resultando em quatro PCs explicando 96,9% da variância total. A frequência das flores sem néctar foi analisada separadamente para cada geração, utilizando modelos lineares generalizados com distribuição bimodal, com a “presença de néctar” (sim/não) como variável dependente, e o tratamento e replicação como factores. Traços em flores nectariíferas e nectarinas foram comparados para a nona e décima primeira geração juntos, usando modelos lineares gerais com o traço como variável dependente, e “presença de néctar” e tratamento como fatores fixos. As preferências de primeira escolha dos abelhões e das libélulas foram analisadas por teste binomial (test-prop=0,5; todos os replicados agrupados). As correlações entre o néctar e as características das plantas foram calculadas para todas as gerações combinadas usando a Pearson product-moment correlations com os valores ln-transformed. As estatísticas foram realizadas com as estatísticas do IMB SPSS (versão 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

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