o projeto Experimental e recolha de amostra

O experimento foi estabelecido em 1982, em Mengcheng county, província de Anhui, China (33° 13′ N, 116° 35′ E, de 42 m de altitude), com típica de cal concreção de terra negra. A temperatura anual é de 14,8 °C e a precipitação anual é de 872 mm. Cinco tratamentos de fertilização com trigo-soja, a rotação de culturas foram comparadas em um completamente aleatorizados projeto de bloco com quatro replica (cada parcela é de 70 m2) : (1) controle, não-fertilização; (2) NPK, NPK, fertilizantes químicos, composto de uréia (180 kg N ha−1 ano−1), superfosfato simples (90 kg de P2O5 ha−1 ano−1) e cloreto de potássio (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK, fertilizantes químicos, além de 7500 kg de palha de trigo ha−1 ano−1; (4) NPK + PM, NPK, fertilizantes químicos mais de 15.000 kg fresco dejetos suínos ha−1 ano−1; (5) NPK + CM, NPK chemical fertilizers plus 30,000 kg fresh cow chorume ha−1 year−1. No tratamento NPK + WS, toda a palha de trigo foi devolvida ao campo, o estrume de suíno no tratamento NPK + PM e o estrume de vaca no NPK + CM tinham a mesma quantidade de carbono orgânico com a palha de trigo adicionada. Além disso, estes tipos contrastantes de fertilizantes incluídos em nossos tratamentos de fertilização têm diferentes níveis de disponibilidade para plantas e micróbios, por exemplo, de mais labial (estrume de porco) para mais recalcitrante (palha de trigo e estrume de vaca). Utilizámos uma vasta gama de tratamentos de fertilização com o objectivo de tornar os nossos resultados representativos e aplicáveis a práticas de gestão contrastantes.cavamos em torno do grupo do trigo (contendo 30 a 40 plantas de trigo durante a fase de enchimento do trigo no dia 20 de abril de 2017) para manter os sistemas de raiz tão intactos quanto possível. O solo da rizosfera que estava firmemente aderido às raízes foi então escovado. Ao mesmo tempo, o solo de superfície (0-15 cm de profundidade) foi recolhido como solo a granel utilizando um corante de auger (a cerca de 20 cm das plantas). O solo recolhido foi peneirado através de uma malha de 2 mm para remover as impurezas, tais como raízes e pedras. Parte do solo foi armazenado a 4 °C para análises químicas, e o restante foi armazenado a − 40 °C para extração de ADN.

a Ph meter (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Alemanha) foi utilizada para medir o pH do solo numa relação solo/água destilada de 1:5 (peso / volume). A umidade do solo foi determinada gravimetricamente por secagem de 5 g de solo fresco a aproximadamente 105-108 °C para atingir um peso constante e, em seguida, calcular a razão de peso (água evaporada para o solo seco). O teor total de carbono (TC) e azoto (TN) do solo foi determinado pela combustão de solo seco ao ar utilizando um analisador SNC-2000 (LECO, St.Joseph, MI, EUA), após peneirar o solo através de uma malha de 0,15 mm. O teor total de fósforo (TP) e potássio total (TK) do solo foram extraídos após a digestão de HF-HClO4 e medidos utilizando o método azul de molibdénio e o método de espectrofotometria de chama (FP640, INASA, China), respectivamente. O carbono orgânico dissolvido (COD) foi extraído adicionando 50 mL de água destilada a 5 g de solo fresco, agitando durante 1 h, e filtrando a vácuo através de um filtro de fibra de vidro G4 com um espaço poro de 1,2 µm (Fisher), e então, o teor de carbono nos extratos foi determinado por um analisador de carbono orgânico total (multi n/c 3000, Analytik Jena, Alemanha). O nitrato (NO3–N), o amónio (NH4+-N) e o azoto total dissolvido (DTN) foram extraídos numa proporção de 5 g de solo fresco para 50 mL de 2 m KCl. Após o shacking de 1 h, os extratos foram filtrados através de um filtro de fibra de vidro G4 com um espaço poro de 1,2 µm (Fisher), e então, um sistema analítico de fluxo contínuo (San++ system, Skalar, Holland) foi usado para analisar o conteúdo de NO3–N, NH4+-N, e DTN. O azoto orgânico dissolvido (DON) foi calculado utilizando a seguinte fórmula: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. o fósforo disponível no solo foi extraído por 0.5 M NaHCO3 e determinado pelo método azul de molibdénio. O potássio disponível (AK) foi extraído com acetato de amónio de 1 M e determinado por fotómetro de chama (FP640, INASA, China) (ficheiro adicional 3: Apêndice 1).o método de rotulagem de 15N2 é um dos métodos mais comuns e amplamente utilizados para medir as taxas de fixação de azoto . Cinco gramas de solo foram colocados em tubos de bálsamo de 18 × 150 mm, e o espaço livre foi substituído por ar sintético contendo 80% de 15N2 e 20% de O2. Os controles foram preenchidos com gás N2 não marcado e processados em paralelo. Os tubos foram incubados horizontalmente no escuro à temperatura ambiente durante 22 dias. O átomo % 15N de amostras de solo foi determinado usando um espectrômetro de massa de razão isotópica estável (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Alemanha). Em seguida, calculamos a taxa de fixação líquida potencial de N comparando a diferença do total de 15N nos solos que recebem 15N2 em relação ao controlo.

sequenciação de alto rendimento e análise Bioinformática

para a extracção do ADN, 0.5 g de solo fresco foi utilizado com o Kit de SPIN rápido de ADN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EUA). Os genes nifH foram amplificados utilizando pares primários nifH-F/nifH-R (5′-AAAGGGWATCGGYAARTCACCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCATCAT-3′) . Foram realizadas reacções PCR numa reacção de 20 µL contendo 4 µL de tampão de 5 × FastPfu, 2 µL de 2,5 mM dNTPs, 0,8 µL de iniciador dianteiro de 5 µM, 0,8 µL de iniciador reverso de 5 µM, 0,4 µL de polimerase de fastPfu, 10 ng de ADN-modelo e água destilada dupla (ddH2O). A amplificação foi realizada a 95 ° C durante 3 minutos, com 35 ciclos de 95 °C para 30 s, 55 °C para 30 s, e 72 °C para 45 s, e extensão a 72 °C para 10 min. PCR amplicons foram purificados por Gel de Agarose DNA purification kit (TaKaRa Bio), e triplicado amplificações de PCR para cada amostra foram realizados e agrupadas como um produto de PCR e sequenciados na plataforma da Illumina MiSeq PE300 (Majorbio Empresa em Xangai, China). Após a sequenciação, as sequências de nucleótidos nifH foram analisadas usando o oleoduto QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/) . Em primeiro lugar, as sequências de baixa qualidade (aquelas com uma pontuação de qualidade < 20, contendo nucleótidos ambíguos, ou não coincidindo com o primer e o código de barras) foram removidas e as sequências restantes foram posteriormente convertidas em sequências de aminoácidos usando o gasoduto Fungeno do projeto banco de dados Ribosomal . As sequências que codificam proteínas que não correspondem à sequência de proteínas nifH ou que continham codões terminais foram descartadas. As sequências restantes foram alinhadas com o banco de dados dos genes nifH, removendo as sequências falidas e quiméricas. As sequências restantes de alta qualidade foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 95% de similaridade com UCLUST rodando no modo de novo, e todos os OTUs singleton foram excluídos.

Co-occurrence network analysis

we constructed a co-occurrence network with all the samples (rhizosphere and bulk soil) and identified the main ecological clusters of strongly associated OTUs. Foram escolhidos os OTUs superiores, que representam mais de 80% da abundância relativa na comunidade total . Todas as correlações de Spearman emparelhadas entre OTUs foram calculadas, e as correlações com um coeficiente de Spearman inferior a 0,65 e um valor P superior a 0,01, foram removidas. Isso nos permitiu focar apenas no OTUs que fortemente Co-ocorreu e eram mais propensos a interagir uns com os outros. Os principais módulos (clusters ecológicos) da rede foram visualizados usando Gephi (https://gephi.org/). A abundância relativa de cada aglomerado ecológico foi calculada através da média da abundância relativa padronizada (Z-score) das espécies que lhe pertenciam (arquivo adicional 3: Appendix 3).a análise estatística foi utilizada para comparar as variáveis do solo, os taxa microbianos dominantes e a diversidade microbiana Alfa entre diferentes tratamentos de fertilização (ficheiro adicional 3: Apêndice 1). Estes testes foram implementados usando SPSS 21. O teste de Mantel foi utilizado para analisar as correlações entre a comunidade diazotrófica e as propriedades físico-químicas (ficheiro adicional 3: Apêndice 2). Isto foi realizado usando o pacote “vegan” em R × 32 (3.2.2). Foi utilizada uma análise de coordenadas principal (PCoA) para detectar diferenças significativas nas comunidades diazotróficas entre os grupos de amostragem (ficheiro adicional 3: Apêndice 2). O PCoA foi realizado usando o pacote “labdsv” R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

Phylogenetic analyses

The nifH gene provides sufficient phylogenetic resolution in ecological studies. A árvore filogenética para os 481 filotipos diazotróficos dominantes nos aglomerados ecológicos foi construída usando FastTree, e visualizada usando GraPhlAn . Filogenética teoria da amostragem pode ser analiticamente independentes (supondo que a amostragem aleatória a partir da árvore filogenética como o previsto filogenética diversidade de uma comunidade local e, em seguida, comparando a observada diversidade filogenética com essas previsões,) para determinar o grau de diazotrophic comunidade aparecer aleatório (entre − 2 e + 2), sobre-dispersos (acima + 2), ou em cluster (abaixo de − 2). A teoria da amostragem filogenética foi realizada usando o pacote R “picante”. Uma vantagem de amostrar aleatoriamente a árvore filogenética regional é que ela pode ser usada para comparar amostras de tamanhos desiguais com base no modelo de amostragem binomial . As diferenças entre a diversidade filogenética observada e esperada foram determinadas calculando e comparando z-scores para cada aglomerado ecológico. Quando a diversidade filogenética observada é menor do que a diversidade esperada (abaixo de − 2), a comunidade microbiana no cluster ecológico é considerada filogeneticamente agrupada, o que significa que os taxa intimamente relacionados são mais propensos a serem amostrados e ativamente selecionados pelo meio ambiente .

Structural equation modeling analysis

The SEM was conducted using IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Foi usado para avaliar os efeitos diretos e indiretos das propriedades físico-químicas do solo e a abundância relativa dos principais clusters ecológicos nas taxas de fixação de N. As propriedades físico-químicas do solo incluíam pH do solo, carbono total, nitrogênio total e fósforo total. No modelo, os tratamentos (control, NPK, NPK + WS, NPK + PM, e NPK + CM) eram variáveis categóricas com dois níveis: 1 (um tratamento particular) e 0 (outros tratamentos considerados). In addition, bootstrapping was used to test the probability that path coefficients differed from zero, as a few of the variables were not normally distributed. Também calculamos os efeitos totais padronizados (STEs) das propriedades do solo, tratamentos de fertilização e efeito da rizosfera sobre a taxa de fixação de N para ajudar a interpretação do SEM.

Análise de modelagem Florestal aleatória

regressão Florestal aleatória (pacote R “randomForest”) foi usado para regredir o OTUs normalizado em diferentes tratamentos. O método de validação cruzada de 10 vezes foi utilizado para determinar o conjunto óptimo de OTUs correlacionado com as taxas de fixação de N . Listas classificadas de OTUs por ordem de florestas aleatórias relatadas pontuação de importância característica foram alcançados com base no aumento do erro médio-quadrado das taxas de fixação de nitrogênio previstas mais de 100 iterações do algoritmo. Os 50 OTUs marcadores foram escolhidos com base na média mínima de erros cruzados de validação cruzada, que foram obtidos a partir de cinco ensaios da 10 vezes de validação cruzada.