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mineral Óssea: novas perspectivas na sua composição química

a Identificação de HPO4 2− íons em mineral óssea

O direto de estado sólido de Ressonância Magnética Nuclear (ssNMR) de detecção dos prótons localizados em mineral óssea a partir de um osso intacto o tecido da amostra não é possível. Isto é devido à presença da matriz orgânica extracelular cujos sinais diferentes dominam o espectro de 1H pulso único (SP) ssNMR de uma amostra de tecido ósseo 54. No entanto, a possibilidade de revelar atômica escala espacial proximidades entre hidrogênio e fósforo núcleos em duas dimensões (2D) {1H}31P de Correlação Heteronuclear (HetCor) ssNMR experiência permite a sondagem mineral óssea de hidrogênio ambientes através da análise da dimensão F1 (Fig. 1A). Infelizmente, este experimento é demorado e dá origem a uma projeção 1H da dimensão vertical (F1) com uma relação sinal-ruído relativamente fraca (S/N) e uma baixa resolução digital (Fig. 1B). Para superar essas limitações, usamos o experimento de polarização dupla (CP) ssNMR unidimensional (1D) {1H-31P}1H. Consiste de uma dupla transferência CP conduzida de uma maneira” ali-e-atrás ” (1H→31P→1H) (Fig. S1). Em primeiro lugar, esta experiência permitiu-nos obter espectros de 1H ssNMR de minerais ósseos de 31P filtrados a partir de uma amostra intacta e cortical de tecido ósseo de ovelha de 2 anos com uma excelente S/N apesar de um tempo de aquisição relativamente curto (ou seja, 9 horas) (Fig. 1C, D). Os diferentes ambientes químicos 1H do mineral ósseo são agora facilmente observáveis e podem ser analisados com segurança com precisão. No que diz respeito ao núcleo interno cristalino das partículas minerais ósseas, os íons hidroxila presentes na estrutura cristalina da hidroxiapatite são observados na forma de uma ressonância complexa centrada em δ(1H) = 0, 0 ppm. Em relação à sua camada superficial amorfa, moléculas estruturais de água e espécies de fosfato ácido presentes em ambientes não apáticos são observáveis na forma de uma única ressonância centrada em δ(1H) = 5.2 ppm e uma ampla ressonância que varia de δ ( 1H) = 7 a 17 ppm32, respectivamente.

Figura 1
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Detecção de hidrogênio-rolamento de espécies em mineral óssea. Espectros de ressonância magnética Nuclear de Estado Sólido (ssNMR) de uma amostra seca de tecido ósseo de ovinos com 2 anos de idade. (A) two-dimensional (2D) {1H}31P Heteronuclear Correlation (HetCor) spectrum (contact time, tCP = 1000 µs). A intensidade do sinal aumenta de azul para vermelho. B) 1H projecção da dimensão vertical (F1) do espectro HETCOR 2D {1H}31P indicado na alínea a). {1H-31P}1H espectro duplo CP MAS registado com os seguintes tempos de contacto: (c) tCP1 = tCP2 = 1000 µs; E, (D) tCP1 = tCP2 = 15000 µs. O tempo experimental total foi o mesmo em cada experiência (ou seja, 9 horas).

em Segundo lugar, esta experiência permite a investigação da 1H detectado CP dinâmica seletiva de revelar a natureza da 1H núcleos nas proximidades 31P núcleos. Para o efeito, o tempo de contacto 1 (tCP1) foi mantido em 1000 µs, enquanto o tempo de contacto 2 (tCP2) variou entre 75 µs e 1000 µs (Fig. 2). Um aumento uniforme da magnetização é observado para ambas as ressonâncias centradas em δ (1H) = 0.0 e δ(1H) = 5,2 ppm (ver as linhas tracejadas pretas), anteriormente atribuídas a íons OH e moléculas de H2O estruturais de acordo com seu respectivo deslocamento químico 1H NMR. Em contraste, a evolução da ampla sinal no intervalo de δ(1H) = 7-17 ppm inicialmente mostra um rápido aumento de sua magnetização (até tCP2 = 300 µs) e é seguido pela presença de um comportamento oscilatório (até tCP2 = 1250 µs – ver o preto linha tracejada). Este comportamento oscilatório é característico das oscilações dipolar 1H-31P (DP-H )55,56. A instalação dos espectros correspondentes a {1H-31P}1H ssNMR em vários tCP2 não é direta devido à sobreposição de várias ressonâncias. Enquanto que as amostras de HA sintético apresentam geralmente uma ressonância OH simétrica 32; nós mostramos aqui que a ressonância OH do mineral ósseo é particularmente complexa e pode ser instalada da seguinte forma: um pico principal em δ(1H) = 0.0 ppm rodeado por dois picos de ombros em δ(1H) = -0.7 e 0.9 ppm (Fig. S3). A ressonância residual estrutural da água pode ser adequadamente equipada com um único PICO centrado em δ ( 1H) = 5,2 ppm (Fig. S4). Em contraste, o sinal largo das espécies ácidas de fosfato observável na gama δ(1H) = 7-17 ppm não pode ser satisfatoriamente equipado com um único pico com posição fixa e largura de linha, especialmente em tempos de contacto curtos (ver os melhores resultados de montagem para os vários valores de tCP2 na Fig. S4-coluna da esquerda). No entanto, os resultados da montagem são precisos quando são utilizados dois picos diferentes com posições fixas e linhas fixas (6.2 ± 0.1 e 5.0 ± 0.1 ppm, respectivamente) (Fig. S4-coluna da direita). Não podemos afirmar que este sinal amplo é composto apenas por dois picos correspondentes a dois ambientes de prótons distintos, mas é provavelmente composto por uma ampla distribuição de ambientes químicos levando a uma distribuição de mudanças químicas NMR. Consequentemente, Fig. 3A mostra os quatro picos que foram utilizados para analisar a 31P-filtrada 1H ssNMR espectros de osso mineral para cada tCP2 valores: (i) um composto de pico centrado em δ(1H) = 0.0 (roxo) e um único pico centrado em δ(1H) = 5.2 (cinza) ppm ambos caracterizados por uma relativamente lento e uniforme, o crescimento de sua magnetizations; e ii) dois picos a δ(1H) = 9,8 (azul) e 14,0 (verde) ppm, ambos apresentando oscilações dipolares (Fig. 3B). Em relação a estes dois últimos picos, a combinação precisa do perfil Hartmann-Hahn (H-H) (Fig. S2) permite a modelação numérica do CP construir curvas de acordo com a rotação único par de modelo de contabilidade para dipolar oscilações resultantes coerente polarização de transferência e o impacto de 1H spin diffusion57:

$${\rm{M}}({\rm{t}})={{\rm{M}}}_{0}.\exp (-\,{{\rm{t}}}_{{\rm{CP}}}/{{\rm{T}}}_{1{\rm{\rho }}}({}^{{\rm{1}}}{\rm{H}})). e a posição de íons hidroxila em F1 foi convocada. C) 1D 31P CP MAS ssNMR spectrum (tCP = 1000 µs) de uma amostra sintética de fosfato octacálcico (OCP). P1 a P6 correspondem aos seis diferentes grupos de fosfato presentes na rede de cristais de OCP de acordo com o trabalho de Davies et al.60. A linha tracejada vermelha marca a ressonância mais intensa no sinal de OCP que não é detectada no mineral ósseo (B).

Quantificação de HPO4 2− íons em mineral óssea

A quantificação do HPO42− íons presentes no mineral óssea foram realizados. Para este fim, a lineshape e a linewidth dos sinais individuais de 31P NMR do OH− e PO43–contendo núcleo interno cristalino e a H2O e HPO42–contendo ambientes não apáticos (camada de superfície amorfa)que foram revelados na Fig. 4B, foram utilizados na montagem do espectro quantitativo 31P de pulso único (SP) MAS ssNMR de uma amostra recente de tecido ósseo de ovinos com 2 anos de idade (Fig. 5A). Verificou− se que a percentagem molar de hpo42− e PO43-iões no mineral ósseo era de cerca de 50/50 ± 5%. Tal como sugerido pelas nossas observações nos Figs S9 e S10, este cálculo foi efectuado partindo do princípio de que a proporção molar de hpo42− iões no núcleo interno cristalino das partículas era próxima de 0%. Tal proporção molar elevada de hpo42-iões presentes na camada superficial amorfa reflete o pequeno tamanho de partículas minerais ósseas: ∼1-5 nm em espessura, ∼10-40 nm em largura, e ∼20-100 nm em comprimento1,61,62,63. Uma vez que mostramos que os íons HPO42 estão concentrados dentro da camada de superfície amorfa, podemos agora estimar a espessura média desta camada para uma amostra de tecido ósseo de ovelha de 2 anos de idade. Aqui consideramos uma placa nanosizada com uma espessura de 4,0 nm, e assumimos que as densidades de átomos de fosfato presentes na estrutura cristalina da hidroxiapatita e na camada superficial amorfa são equivalentes. Em tal cenário, a espessura do núcleo cristalino interno é de cerca de 2,4 nm (i.e., o que é cerca de duas vezes o tamanho da célula unitária hexagonal da hydroxyapatite64 ao longo do cristalográfica eixos a e b; a = b = 0.94 nm), enquanto que a espessura da bainha amorfo camada de superfície pode ser estimado em cerca de 0,8 nm (i.é., que, em seguida, corresponde ao tamanho da célula unitária hexagonal da hidroxiapatita ao longo de a e b, e, portanto, é equivalente ao de empilhamento de apenas dois íons fosfato). Devemos estar conscientes de que estes são valores médios que correspondem à soma das contribuições de todos os íons de fosfato inorgânico presentes na nossa amostra de tecido ósseo de ovinos com 2 anos de idade. Estes resultados podem ser diferentes para espécimes mais antigos em que a proporção dos ambientes não apáticos pode ser inferior a 65 devido à maturação mineral óssea: a transformação progressiva da camada superficial amorfa em ambientes apáticos15. No entanto, a espessura da camada de superfície determinado aqui (0,8 nm) está em bom acordo com a estimativa de tamanhos proposto em alguns estudos anteriores: sobre o tamanho de uma unidade de fosfato em fluorapatita-gelatina mesocrystals66; e cerca de 1-2 nm em sintético hydroxyapatites32,67,68.

Figura 5
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Quantificação de HPO42− e CO32− íons presentes no mineral óssea. A) espectro de ressonância magnética Nuclear de Estado Sólido (ssNMR) quantitativo 31P de um único impulso (SP) de amostra recente de tecido ósseo de ovinos com 2 anos de idade (linha azul) e a sua correspondente instalação (linha tracejada vermelha) com dois picos. Aqueles dois picos, cuja paisagem e linewidth foram revelados na Fig. 4B, corresponde à PO43 — contendo núcleo interno cristalino na forma de hidroxiapatite (pico laranja) e hpo42 — contendo ambientes não apáticos na forma de uma camada superficial amorfa (pico roxo). B) espectro de vibração da Transformada de Fourier-infravermelho (FT-IR) do modo ν2(CO3) para uma amostra de tecido ósseo de ovinos com 2 anos (Linha Azul) e a respectiva instalação (linha tracejada a vermelho). Co32− iões Tipo B ocupam os locais de PO43 dentro da rede de cristal da hidroxiapatita; CO32− iões tipo A ocupam os locais de OH dentro da rede de cristal da hidroxiapatita; enquanto que CO32 não-apátíticos estão presentes dentro da camada de superfície amorfa que cobre as partículas minerais ósseas.

Actualização no osso mineral de composição química

Os resultados aqui apresentados e elsewhere45 sugerem que a média da composição química de maturidade de cortical óssea mineral proposto por Legros et al.27, Ca8. 3 d 1,7 (PO4)4.3(HPO4 ou CO3)1.7(OH ou ½ CO3) 0,3 D 1.7, deve ser reconsiderado. Na verdade, esta fórmula não só ignora a presença da camada superficial amorfa cuja composição química varia muito em relação aos ambientes apáticos presentes no núcleo interno cristalino das partículas, como também subestima a proporção molar de íons HPO42. Para propor uma fórmula actualizada da nossa amostra de tecido ósseo de ovinos de 2 anos, foi necessário, em primeiro lugar, determinar a proporção de peso dos co32-iões. Um valor de 4,8%, com uma importante contribuição em carbonatos do tipo B, foi encontrado através de análises FT-IR49 (Fig. 5 B), que está de acordo com os valores encontrados para outras samples minerais ósseas3. Além disso, os seguintes parâmetros foram considerados: (i) as partículas devem permanecer eletricamente neutro (tanto interna núcleo cristalino e amorfo camada de superfície); (ii) a proporção molar de HPO42− íons em relação ao montante total de íons fosfato inorgânico é restrita perto de 50%, de acordo com o presente estudo; (iii) o grau de carbonatação deve estar próximo do valor experimental (de 4,8% w/w); (iv) o total Ac/(P + C) razão molar deve permanecer aceitável para um tecido ósseo exemplo, eu.e. Na Gama 1.2–1.53 e, por último, (v), a proporção de iões carbonatados do tipo a, do tipo B e não apáticos presentes na camada superficial amorfa deve permanecer de acordo com os dados FT-IR. Uma vez que todas estas restrições foram amalgamadas, a composição química média do mineral ósseo cortical maduro a partir da nossa amostra de tecido ósseo de ovinos com 2 anos de idade pode ser aproximada do seguinte modo: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Note-se que esta composição química média corresponde apenas à nossa amostra específica de tecido ósseo, de acordo com os nossos próprios resultados experimentais. Por conseguinte, esta fórmula não é universal, uma vez que a variabilidade ocorre entre os espécimes ósseos, dependendo, em particular, da espécie, da Idade, do fornecimento de alimentos e do seu grau de maturação.

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