introdução

halófilos são grupos interessantes de organismos que prosperam em alta salinidade. Estes organismos podem ser classificados com base em sua salinidade ideal para o crescimento em leve halophiles (1-6%, m/v) de NaCl), moderada halophiles (7-15%) e extrema halophiles (15-30%) (Madigan e Martinko, 2006). Pesquisas extensivas têm mostrado que os halófilos não estão restritos a nenhum dos domínios da vida, eles podem ser eucariotas (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), ou procariontes pertencentes aos domínios de bactérias e Archaea. A algas do gênero Dunaliella e artémia Artemia (Boetius e Joye, 2009) são exemplos de holofíticos eucariontes, enquanto Halobacterium e Salinibacter são exemplos de holofíticos procariotas. O sucesso dos halófilos em sobreviver em ambientes altamente salgados é devido a adaptações fisiológicas únicas, como a estratégia de bombeamento de íons e acumulação de solutos orgânicos (Oren, 2006; Madigan e Martinko, 2006). Nos níveis genômicos e proteômicos, os halófilos são caracterizados por alto teor de GC e proteínas caracterizadas por baixa hidrofobicidade, sobre-representação de resíduos ácidos, menores propensidades de formação de hélice e maiores propensidades de estrutura da bobina (Paul et al., 2008).

halófilos estão agora a ganhar mais acesso à Microbiologia industrial e Biotecnologia porque os halófilos crescem em alta concentração de sal e isso minimiza o risco de contaminação durante o cultivo (Oren, 2006). Alguns exemplos de aplicações biotecnológicas são o uso de Micrococcus varians para produzir nuclease H (Kamekura el al., 1982) e o uso do holofíticos Tetragenococcus cepas na produção de molho de soja e a produção de algumas enzimas, incluindo a hidrolases (amilases, nucleases, fosfatases e proteases) (Oren, 2006). Os halófilos também são importantes na biodegradação e biorremediação, uma vez que muitos halófilos são capazes de degradar hidrocarbonetos e outros compostos tóxicos (Ventosa et al., 1998). Halófilos também podem produzir polímeros usados como potenciadores da recuperação de óleo por causa de sua atividade surfactante e propriedades bioemulsionantes (Oren, 2006).

halófilos florescem em ambientes onde a salinidade atinge níveis elevados, tais como oceanos, salteros solares e lagos salgados naturais (Oren, 2007). O Mar Morto da Jordânia é um dos maiores lagos salgados interiores do mundo (Boécio e Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan e Martinko, 2006). Além da alta salinidade; o sal, a concentração de mais de 340 g L-1 (Oren, 2007), o mar Morto é única por sua alta pressão barométrica (800 mm hg) devido a muito baixa altitude abaixo do nível do mar, pressão parcial de oxigênio (PIO2) de 8% a mais do que no nível do mar, a única radiação UV, humidade baixa (abaixo de 40%) e escassez de chuva (Avriel et al., 2011).este estudo foi realizado para classificar a espécie bacteriana heterotrófica Halofílica que prospera na zona costeira do Mar Morto da Jordânia. A classificação microbiana é baseada na morfologia colonial e celular, bem como similaridade no gene rRNA 16S.materiais e métodos amostragem: amostras de água do mar morta foram colhidas em quatro zonas litorais(Fig. 1) em março, junho e outubro de 2011. As coordenadas geográficas e a elevação dos locais de amostragem são apresentadas no quadro 1. As coordenadas geográficas e a elevação foram determinadas para cada localização por (eTrex Legend C, Taiwan). As amostras de água do mar morto foram recolhidas numa garrafa de vidro estéril limpa, deixando espaço suficiente para a cabeça na garrafa e transportadas imediatamente para o laboratório.Análise Físico-Química das amostras: Foram determinadas a temperatura, o pH, o total de sólidos dissolvidos (TDS) e a carência biológica de oxigénio (CBO) das amostras de água. A temperatura da água, o pH e a salinidade foram medidos in situ. A temperatura da água e o pH foram medidos por um medidor de pH portátil (microcomputador pH meter T19000, Trans Instruments). A salinidade foi medida por um refractómetro de salinidade portátil. O CBO foi medido em (Centro de pesquisa de água, Meio Ambiente e regiões áridas na Universidade Al-Bayt, Jordânia). As amostras de água foram transferidas para um novo frasco de vidro, em seguida, 1 mL de tampão fosfato, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio, soluções de cloreto de ferro por amostra de água de litro foram adicionados. A amostra foi então levada à temperatura de 20±3 ° C e saturada com ar filtrado orgânico livre. O pH da amostra foi verificado. Se a amostra não se situasse na gama 6.5-7.5, adicionou-se ácido sulfúrico ou hidróxido de sódio para levar a amostra para a gama de pH requerida (6.5-7.5) e a concentração adicionada não diluiu a amostra em mais de 0,5%. A amostra foi levada à temperatura de 20 ° C antes de fazer diluições. O volume adequado da amostra foi então transferido para os frascos de CBO. O frasco foi cheio com água de diluição suficiente para deslocar todo o ar sem deixar bolhas. O oxigénio dissolvido (DO) foi determinado utilizando um analisador DO DO e qualquer conteúdo deslocado foi substituído por água de diluição e tampa firmemente. O frasco foi incubado durante 5 dias a 20 ° C. Depois disso, o DO foi determinado e a CBO foi calculada de acordo com a diferença entre o dbo inicial e o dbo final sobre o volume.

enriquecimento, isolamento e coloração de gram: Para enriquecer as amostras de água, a água do mar morta (10 mL) foi transferida para 90 mL de líquido de alta salinidade e incubada a 30°C, às escuras, com agitação (100 rpm). Depois de cerca de 12 h, uma loopful de cultura de enriquecimento foi estriada em meio Sal mineral sólido modificado e as colônias separadas foram então subculturadas. As existências de glicerol dos isolados Também foram preparadas e armazenadas a -20°C para análise posterior. As células foram Gram-manchadas e examinadas ao microscópio.

16S sequenciação e análise do gene rRNA: 16S amplificação e sequenciação da sequência do gene rRNA foi realizada pela Macrogen Inc., Seoul, Coreia, de acordo com o seguinte método: jovens colônias de estirpes bacterianas foram suspensos em 1,5 mL do tubo de ensaio contendo 0,5 mL de soro fisiológico estéril e, em seguida, centrifugado a 10.000 rpm por 10 min, o sobrenadante foi removido e o sedimento foi suspenso em 0,5 mL de InstaGene Matrix (Bio-Rad, EUA) e incubadas a 56°C por 30 min e, em seguida, aquecida a 100°C por 10 min. Após aquecimento, utilizou-se sobrenadante para a PCR. A PCR foi realizada misturando 1 µL de ADN-modelo com 20 µL de solução de reacção PCR. 27F / 1492R primers (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5 ‘ – TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) foram utilizados para amplificação e, em seguida, 35 ciclos de amplificação foram realizados a 94 ° C para 45 segundos, 55 ° C Para 60 segundos e 72°C Para 60 segundos. primers PCR não incorporados e dNTPs foram removidos de produtos PCR por Montage PCR Clean up kit (Millipore). Os produtos de PCR purificados de aproximadamente 1,400 bp foram sequenciados por 518F/800R primers (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). A sequenciação foi realizada usando o Big Dye terminator cycle sequencing kit v. 3. 1 (Applied BioSystems, USA). Produtos de sequenciamento foram resolvidos em um modelo de Biossistemas aplicado 3730XL sistema de sequenciamento de DNA automatizado (Applied BioSystems, EUA) na Macrogen, Inc., Seul, Coreia.

As sequências foram analisadas e comparadas com a base de dados pública de nucleótidos usando o site NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sequências dos parentes mais próximos foram então recuperadas do banco de dados e usadas para construir uma árvore filogenética usando MEGA5 (Tamura et al., 2011). GC content the sequences were calculated by Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).resultados físico-químicos das Amostras: As amostras de água do mar morta eram muito Salinas variando de (36-38%). Os valores de pH das amostras foram baixos e variam entre 5.6 e 6.3. Isto indica a propriedade ligeiramente ácida da água do mar. O valor da CBO foi muito baixo (1-2 mg de O2 L-1), indicando um teor de matérias orgânicas muito baixo na amostra. As propriedades físico-químicas são apresentadas no quadro 2.

ontagem bacteriana viável heterotrófica: os resultados da contagem em placas viável revelaram um número muito baixo de unidades formadoras de colónias em cada amostra (200-6000 UFC mL-1). A contagem de UFC é mostrada em mais detalhes na Tabela 3.isolamento e classificação de bactérias heterotróficas halofílicas: neste estudo, isolámos 44 estirpes bacterianas heterotróficas halofílicas. Onze estirpes de bactérias de 44 foram consideradas diferentes com base na morfologia colonial, coloração de Gram e morfologia celular. Sete em onze estirpes diferentes eram Gram-positivas e quatro em sete eram Gram-negativas. As estirpes bacterianas foram identificadas com base na análise do gene rRNA 16S e foram encontradas como pertencendo ao Domínio das bactérias. O parente mais próximo de cada estirpe bacteriana isolada é mostrado na Tabela 4 e Fig. 2. Todas as sequências mostraram um conteúdo GC relativamente elevado (até 58%).

DISCUSSÃO

As propriedades físico-químicas da água do mar Morto amostras foram determinadas e analisadas. Verificou-se que a percentagem de salinidade era muito elevada (até 38%). Esta é uma característica típica da água do Mar Morto, tornando-a uma das famosas “athalassohaline” brines (Oren, 2007). O pH da água do mar morta foi considerado ligeiramente ácido (5.6-6.3) em comparação com o pH (7.5-8) nos brinos de talassohalina (Oren, 2007). CBO das amostras foram muito baixas (1-2 mg de O2 L-1) refletindo baixo material orgânico na água que poderia ser utilizado por bactérias heterotróficas. Estas condições físico-químicas, sem dúvida, afetam negativamente a diversidade microbiana. Por conseguinte, o número de células viáveis nas amostras testadas foi muito baixo (não superior a 6×102 UFC mL-1) em comparação com a água do mar. Contagem de heterotróficos bactérias em águas marinhas são geralmente da ordem de 105 a 106 bactérias mL-1 (Zweifel e Hagstrom, 1995; Madigan e Martinko, 2006). Estes números são derivados de técnicas de coloração fluorescente inespecíficas (Zweifel e Hagstrom, 1995) que geralmente dão números mais elevados do que o método de contagem de placas viável. As primeiras publicações sobre contagem de bactérias no mar morto foram feitas por microscopia. O número de telemóvel era cerca de 1.9×106 células mL1 e durante um florescimento de halobactérias vermelhas a densidade populacional atingiu 1. 9×107, mas diminuiu após as traças para 5×106 (Oren, 1983).

a pesquisa sobre organismos halofílicos que habitam o Mar Morto começou muito cedo em 1892, quando as bactérias foram isoladas do gênero Clostridium da lama (Oren, 2002). Mais tarde, em um breve artigo publicado em 1936, deu a primeira descrição de uma comunidade microbiana indígena adaptada às condições extremamente duras do Mar Morto (Oren e Ventosa, 1999). Desde então, o nosso conhecimento sobre os aspectos biológicos do Mar Morto está a expandir-se e a acumular-se. Nós realizamos esta pesquisa para expandir nosso conhecimento sobre a bactéria heterotrófica Halofílica prosperando na zona litorânea do Mar Morto Jordaniano. Isolámos diferentes espécies bacterianas. Subsequentemente, isolámos e identificámos 11 espécies diferentes de bactérias halofílicas. A maioria dos isolados foram Gram-positivos (7 em 11). Apesar de bactérias Gram positivas possuírem importantes adaptações que lhes permitem coup com stress ambiental, como alta salinidade (Battistuzzi e Hedges, 2009). Não é claro na literatura se bactérias Gram-positivas ou gram-negativas são dominantes em ambientes hipersalinos. Num estudo sobre halófilos procarióticos recuperados dos sedimentos do Lago Salgado El-Djerid na Tunísia, Hedi et al. (2009) found that the dominant bacterial population belongs to Gram-positive spore-forming bacteria.todas as estirpes isoladas deste estudo pertencem ao Domínio das bactérias. Eles pertencem a 7 gêneros diferentes no domínio. Cinco dos sete isolados bacterianos Gram-positivos pertencem ao género Bacillus. Este gênero foi estabelecido em 1872 para incluir três espécies, mas agora existem 142 espécies de Bacillus listadas no manual de Bacteriologia sistemática de Bergey (Logan e de Vos, 2009). As estirpes de Bacillus são tipicamente estirpes do solo. As estirpes de Bacillus isoladas neste estudo pertencem às seguintes espécies: B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis e B. cereus. Estas estirpes foram encontradas em diferentes ambientes salgados (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Por exemplo, B. licheniformis foi anteriormente recuperado dos sedimentos marinhos por Miranda et al. (2008), while B. pumilus was isolated from marine organisms like Oyster, crab and fish in addition to sediments by Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis foi recuperado da água do mar do leste e do Mar Amarelo na Coreia (Yoon et al., 2004). E finalmente B. cereus, uma bactéria comum do solo, foi encontrada em água de esgoto, mas com propriedades halofílicas (Al-ZaZaee et al., 2011). Parede celular espessa, alto teor de peptidoglicano (mais de 90% da parede celular) (Madigan e Martinko, 2006), alto teor de GC e formação de esporos resistentes são as principais razões para a sobrevivência do Bacillus em condições duras como alta salinidade. Note-se que a estirpe DSD32 (identificada como B. cereus) tem a semelhança muito baixa com a sua relativa mais próxima B. cereus. Esta estirpe pode representar uma nova espécie do género Bacillus com base no gene rRNA 16S.as outras duas bactérias gram-positivas são estirpes de Arthrobacter sp. e Kocuria rosea. As espécies de Arthrobacter são amplamente distribuídas na natureza, especialmente no solo (Funke et al., 1996) mas não é muito comum em ambientes hipersalinos. Kocuria rosea é considerada como uma espécie moderadamente Halofílica e foi recuperada de diferentes ambientes salinos como água superficial salina e algumas estirpes de Kocuria rosea crescem de forma ótima na concentração de NaCl de 30% (Wright e Tanaka, 2002).as bactérias gram-negativas foram menos frequentes nas nossas amostras (4 em 11). No entanto, a literatura publicada mostra que esses isolados não são incomuns em ambientes salgados. Uma das estirpes isoladas foi identificada como Vibrio alginolyticus. Esta última espécie é realmente comum em amostras marinhas (Molitoris et al., 1985) e foi encontrado na água do mar marinho. A estirpe tem importância médica porque pode causar infecções complicadas da pele e dos tecidos moles (Sganga et al., 2009). Mais importante, algumas estirpes de Vibrio alginolyticus foram encontradas para produzir tetrodotoxina, uma neurotoxina forte (Noguchi et al., 1987). Outra bactéria Gram-negativa identificada neste estudo é o Cromohalobacter salexigens. Esta espécie foi inicialmente isolada e descrita como a espécie moderadamente Halofílica Halomonas elongata e depois proposta como nova espécie de Cromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli é outra espécie identificada neste estudo. Esta estirpe também não é incomum para habitats salinos. Foi recentemente isolado de maré plana do mar amarelo na Coreia e foi descrito como espécie Halofílica por Yoon et al. (2005). A última estirpe pertence a Salinivibrio costicola. Esta espécie foi descrita pela primeira vez como Vibrio costicola, mas as suas características fenotípicas e genotípicas distinguiram-na das espécies do género Vibrio. Portanto, a estirpe foi colocada em um novo gênero separado chamado Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola é moderadamente Halofílica e foi originalmente isolada a partir de alimentos salgados e cresce de forma óptima em meio contendo 10% de sais (Mellado et al., 1996). Um membro do gênero Salinibacter, S. ruber, é um modelo interessante para o estudo da adaptação dos microrganismos à vida em altas concentrações de sal (Oren, 2007).

CONCLUSÃO

a água do Mar Morto a partir do litoral zona é caracterizada pela alta salinidade, o pH baixo, baixo material orgânico conteúdo (baixa DBO) e conter diferentes espécies de heterotróficos bactérias pertencentes tanto bactérias Gram-positivas e Gram-negativos gêneros, incluindo Arthrobacter, Kocuria, Vibrião, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus e Erythrobacter.

reconhecimento

Este estudo foi apoiado pela gestão da investigação académica na Universidade Al-Bayt, Jordânia, decisão do Conselho de Investigação Científica na reunião n. º 2/2010/2011. Assim, o autor gostaria de apreciar a assistência financeira fornecida pela Universidade.