projektowanie eksperymentalne i pobieranie próbek

eksperyment został przeprowadzony w 1982 r.w hrabstwie Mengcheng w prowincji Anhui w Chinach (33° 13′ N, 116° 35′ E, wysokość 42 m) z typową czarną glebą z betonu wapiennego. Roczna temperatura wynosi 14,8 °C, a roczne opady 872 mm. Pięć zabiegów nawożenia z płodozmianem pszenicy i soi porównano w całkowicie randomizowanym projekcie bloku z czterema replikatami (każda działka ma powierzchnię 70 m2) : (1) Kontrola, niewodzenie; (2) NPK, nawozy chemiczne NPK zawierające mocznik (180 kg N ha-1 rok-1), superfosfat (90 kg P2O5 ha−1 rok−1) i chlorek potasu (86 kg K2O ha−1 y−1); (3) NPK + ws, nawozy chemiczne NPK plus 7500 kg słomy pszennej Ha− 1 rok−1; (4) NPK + PM, nawozy chemiczne NPK plus 15 000 kg świeżego obornika wieprzowego ha−1 rok−1; (5) NPK + CM, nawozy chemiczne NPK plus 30 000 kg świeżego obornika krowiego ha−1 rok−1. W obróbce NPK + WS Cała słoma pszenna została zwrócona na pole, obornik wieprzowy w obróbce NPK + PM i obornik krowy w obróbce NPK + CM miały podobną ilość węgla organicznego z dodatkiem słomy pszennej. Co więcej, te kontrastujące ze sobą rodzaje nawozów wchodzące w skład naszych zabiegów nawożenia mają różne poziomy dostępności dla roślin i drobnoustrojów, np. od bardziej niestabilnych (obornik wieprzowy) do bardziej opornych (słoma pszenna i obornik krowy). Zastosowaliśmy szeroką gamę zabiegów nawożenia, aby nasze wyniki były reprezentatywne i miały zastosowanie w kontrastujących praktykach zarządzania.

kopaliśmy wokół grupy pszenicy (zawierającej od 30 do 40 roślin pszenicy podczas etapu napełniania pszenicy 20 kwietnia 2017 r.), aby utrzymać systemy korzeniowe w możliwie Nienaruszonym Stanie. Gleba rhizosphere, która była ściśle przylegająca do korzeni, była następnie szczotkowana. W tym samym czasie wierzchnią warstwę gleby (0-15 cm głębokości) zebrano jako glebę zbiorczą za pomocą ślimaka (w odległości około 20 cm od roślin). Zebraną glebę przesiano przez siatkę o grubości 2 mm, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak korzenie i kamienie. Część gleby przechowywano w temperaturze 4 °C do analiz chemicznych, a resztę przechowywano w temperaturze − 40 °C do ekstrakcji DNA.

analiza fizykochemiczna gleby

do pomiaru pH gleby przy stosunku gleby do wody destylowanej wynoszącym 1:5 (Waga/objętość) wykorzystano pH-meter (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Niemcy). Wilgotność gleby oznaczano grawimetrycznie, susząc 5 g świeżej gleby w temperaturze około 105-108 °c, aby osiągnąć stałą masę, a następnie obliczając stosunek masy (odparowana woda do wysuszonej gleby). Zawartość węgla całkowitego (TC) i azotu całkowitego (TN) w glebie oznaczono poprzez spalanie gleby suszonej powietrzem za pomocą analizatora CNS-2000 (LECO, St.Joseph, MI, USA), po przesianiu gleby przez siatkę 0,15 mm. Zawartość fosforu całkowitego (TP) i potasu całkowitego (TK) w glebie wyekstrahowano po trawieniu HF-HClO4 i mierzono odpowiednio metodą błękitu molibdenowego i metodą spektrofotometrii płomieniowej (FP640, INASA, Chiny). Rozpuszczony węgiel organiczny (DOC) ekstrahowano przez dodanie 50 mL wody destylowanej do 5 g świeżej gleby, wytrząsanie przez 1 h i filtrowanie próżniowe przez filtr z włókna szklanego G4 z przestrzenią porów 1,2 µm (Fisher), a następnie zawartość węgla w ekstraktach oznaczono za pomocą analizatora całkowitego węgla organicznego (multi N/C 3000, Analytik Jena, Niemcy). Azotan (NO3-N), Amon (NH4+-N) i rozpuszczony azot całkowity (DTN) ekstrahowano w stosunku 5 g świeżej gleby do 50 mL 2 m KCl. Po wytłoczeniu przez 1 h ekstrakty filtrowano przez filtr z włókna szklanego G4 z przestrzenią porów 1,2 µm (Fisher), a następnie do analizy zawartości No3-N, NH4+ – n i DTN wykorzystano system analizy ciągłego przepływu (San++ system, Skalar, Holland). Rozpuszczony azot organiczny (DON) obliczono według następującego wzoru: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. dostępny fosfor (AP) w glebie ekstrahowano przez 0.5 M NaHCO3 i oznaczono metodą błękitu molibdenowego. Dostępny potas (AK) ekstrahowano 1 M octanem amonu i oznaczono za pomocą fotometru płomieniowego (FP640, INASA, Chiny) (plik dodatkowy 3: Dodatek 1).

oznaczanie szybkości wiązania azotu

Metoda znakowania 15N2 jest jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru szybkości wiązania N. Pięć gramów gleby umieszczono w Balch tubach o wymiarach 18 × 150 mm, a przestrzeń nad głową zastąpiono powietrzem syntetycznym zawierającym 80% 15N2 i 20% O2. Urządzenia sterujące były napełniane nieoznakowanym gazem N2 i przetwarzane równolegle. Probówki inkubowano poziomo w ciemności w temperaturze pokojowej przez 22 dni. Atom % 15N próbek gleby oznaczono za pomocą spektrometru masowego o stabilnym stosunku izotopów (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Niemcy). Następnie obliczyliśmy współczynnik wiązania potencjału netto N, porównując różnicę całkowitej 15N w glebach otrzymujących 15n2 w stosunku do kontroli.

wysokoprzepustowe sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna

do ekstrakcji DNA, 0.Z zestawu Fast DNA SPIN Kit użyto 5 g świeżej gleby (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). Geny nifH Amplifikowano za pomocą par starterowych nifH-F/nifH-R (5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′) . Reakcje PCR przeprowadzono w reakcji 20 µL zawierającej 4 µL buforu 5 × FastPfu, 2 µL 2,5 mm dNTPs, 0,8 µL startera przedniego 5 µM, 0,8 µL startera wstecznego 5 µM, 0,4 µL polimerazy fastPfu, 10 ng wzorcowego DNA i wodę podwójnie destylowaną (ddH2O). Amplifikację przeprowadzono w temperaturze 95 ° C przez 3 minuty, z 35 cyklami 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s I 72 °C przez 45 s i przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 10 min. Amplikony PCR oczyszczano za pomocą zestawu do oczyszczania DNA w żelu agarozowym (Takara Bio), a trzyplikaty amplifikacji PCR dla każdej próbki przeprowadzono i połączono jako produkt PCR, a następnie zsekwencjonowano na platformie Illumina MiSeq PE300 (Majorbio Company w Szanghaju, Chiny). Po zsekwencjonowaniu sekwencje nukleotydów nifH analizowano za pomocą rurociągu QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/) . Po pierwsze, sekwencje niskiej jakości (te z wynikiem jakości < 20, zawierające niejednoznaczne nukleotydy lub niepasujące do startera i kodu kreskowego) zostały usunięte, a pozostałe sekwencje zostały dalej przekształcone w sekwencje aminokwasowe za pomocą rurociągu Fungenowego projektu Rybosomalnej bazy danych . Sekwencje kodujące białka, które nie pasowały do sekwencji białka nifH lub które zawierały kodony terminacji, zostały odrzucone. Pozostałe sekwencje zostały dopasowane do bazy genów nifH, usuwając zarówno nieudane, jak i chimeryczne sekwencje. Pozostałe wysokiej jakości sekwencje zostały zgrupowane w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTUs) przy 95% podobieństwie do UCLUST działających w trybie de novo, a wszystkie singleton OTUs zostały usunięte.

analiza sieci koegzystencji

zbudowaliśmy sieć koegzystencji z wszystkimi próbkami (rhizosphere i masowe gleby) i zidentyfikowaliśmy główne skupiska ekologiczne silnie powiązanych OTUs. Wybrano OTUs górny, stanowiący ponad 80% względnej liczebności w całej Wspólnocie . Obliczono wszystkie parowe korelacje Spearmana między OTUs i usunięto korelacje ze współczynnikiem Spearmana mniejszym niż 0,65 i wartością P większą niż 0,01. Pozwoliło nam to skupić się tylko na Otusach, które silnie współwystępowały i częściej oddziaływały ze sobą. Główne moduły (klastry ekologiczne) w sieci były wizualizowane za pomocą Gephi (https://gephi.org/). Względna obfitość każdego klastra ekologicznego została obliczona poprzez uśrednienie standaryzowanych względnych obfitości (Z-score) gatunków, które do niego należały (plik dodatkowy 3: Załącznik 3).

analiza statystyczna

testy ANOVA i pairwise T zostały wykorzystane do porównania zmiennych glebowych, dominujących taksonów drobnoustrojów i różnorodności Alfa drobnoustrojów między różnymi zabiegami nawożenia (dodatkowy plik 3: Dodatek 1). Testy te były realizowane przy użyciu SPSS 21. Test mantela wykorzystano do analizy korelacji pomiędzy Wspólnotą diazotroficzną a właściwościami fizykochemicznymi (plik dodatkowy 3: Załącznik 2). Przeprowadzono to przy użyciu pakietu „vegan” w R × 32 (3.2.2). Zastosowano podstawową analizę współrzędnych (pcoa) w celu znalezienia istotnych różnic w społecznościach diazotropowych między grupami pobierania próbek (dodatkowy plik 3: Dodatek 2). Pcoa przeprowadzono przy użyciu pakietu „labdsv” R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

analizy filogenetyczne

Gen nifH zapewnia wystarczającą rozdzielczość filogenetyczną w badaniach ekologicznych. Drzewo filogenetyczne dla 481 dominujących filotypów diazotroficznych w klastrach ekologicznych zostało zbudowane przy użyciu FastTree, a wizualizowane przy użyciu GraPhlAn . Filogenetyczna teoria pobierania próbek może być analitycznie zatrudniony (zakładając losowe pobieranie próbek z drzewa filogenetycznego jako przewidywanej różnorodności filogenetycznej w lokalnej społeczności, a następnie porównując obserwowaną różnorodność filogenetyczną z tych prognoz) w celu określenia stopnia, w jakim społeczność diazotroficzna pojawiają się losowe (między − 2 i + 2), nad-rozproszone (powyżej + 2), lub skupione (poniżej − 2). Teoria próbkowania filogenetycznego została przeprowadzona przy użyciu pakietu R „picante”. Zaletą losowego pobierania próbek Regionalnego drzewa filogenetycznego jest to, że może być używany do porównywania próbek o nierównych rozmiarach w oparciu o dwumianowy model pobierania próbek . Różnice pomiędzy obserwowaną i oczekiwaną różnorodnością filogenetyczną określono poprzez obliczenie i porównanie z-Score dla każdego klastra ekologicznego. Gdy obserwowana różnorodność filogenetyczna jest mniejsza niż oczekiwana (poniżej − 2), społeczność mikrobiologiczna w klastrze ekologicznym jest uważana za klastrowaną filogenetycznie, co oznacza, że blisko spokrewnione taksony są bardziej narażone na pobieranie próbek i aktywną selekcję przez środowisko .

Analiza modelowania równań strukturalnych

sem przeprowadzono przy użyciu IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Wykorzystano go do oceny bezpośredniego i pośredniego wpływu właściwości fizykochemicznych gleby oraz względnej obfitości głównych skupisk ekologicznych na stopniach utrwalenia N. Właściwości fizykochemiczne gleby obejmowały pH gleby, całkowity węgiel, całkowity azot i całkowity fosfor. W modelu zabiegi (control, NPK, NPK + WS, NPK + PM i NPK + CM) były zmiennymi kategorycznymi o dwóch poziomach: 1 (konkretny zabieg) i 0 (Pozostałe rozważane zabiegi). Ponadto, bootstrapping był używany do testowania prawdopodobieństwa, że współczynniki ścieżki różniły się od zera, ponieważ kilka zmiennych nie było normalnie rozłożonych. Obliczyliśmy również standaryzowane efekty całkowite (Stes) właściwości gleby, zabiegów nawożenia i wpływu rhizosfery na szybkość wiązania N, aby pomóc w interpretacji SEM.

Random Forest modeling analysis

random Forest regression (pakiet r „randomForest”) został użyty do regresji znormalizowanego OTUs w różnych metodach leczenia. 10-krotna metoda walidacji krzyżowej została użyta do określenia optymalnego zestawu OTUs skorelowanych z N stopniami utrwalenia . Listy rankingowe OTUs w kolejności losowych lasów zgłaszanych punktacji znaczenia cech zostały osiągnięte na podstawie wzrostu średniego błędu kwadratowego szybkości wiązania azotu przewidywanych w ponad 100 iteracjach algorytmu. 50 marker OTUs wybrano na podstawie minimalnych średnich błędów cross-walidacji średniej-kwadratowej, które uzyskano w pięciu badaniach 10-krotnej Cross-walidacji.