Experimental design and study system

w 2012 r.z Carolina Biological Supplies uzyskano 300 nasion roślin szybkiej cykli Brassica rapa (Wisconsin Fast Plants Standard Seed, with high genetic variation) i uprawiano je w fitotronie w standaryzowanych warunkach glebowych, świetlnych i podlewania. Rośliny te są w pełni wykluwające się (niepasujące do siebie) i posiadają wystarczającą zmienność genetyczną, aby łatwo reagować na selekcję58, 59. Z tych 300 roślin 108 pełnych rodzin nasiennych sib zostało wytworzonych przez sztuczne krzyżówki (wykorzystano tylko rodziny nasienne z krzyżówek, w których oboje rodzice produkowali owoce). Te 108 pełne rodziny nasion sib zostały wykorzystane jako populacja wyjściowa do eksperymentu.

dla pierwszej generacji eksperymentu ustalono trzy grupy leczenia przy użyciu 108 rodzin, tak aby każda rodzina była reprezentowana w każdym leczeniu w celu kontroli genotypu wśród zabiegów (dodatkowe rys. 1). Każdy zabieg składał się zatem ze 108 roślin (reprezentujących 108 rodzin nasiennych), które podzieliliśmy na trzy replikaty (A,B,C), każdy zawierający 36 roślin. Replikaty w ramach zabiegów były trzymane jako izolowane linie przez 9 pokoleń (nie wykonano krzyżowania między replikatami), aby móc ocenić niezależne, powtarzalne zmiany ewolucyjne. Rośliny wszystkich replikatów we wszystkich zabiegach były uprawiane w fitotronie w Warunkach znormalizowanej gleby (Einheitserde classic), światła (światło 24 h) i podlewania. Wszystkie rośliny były fenotypowane co drugie pokolenie, począwszy od pierwszego pokolenia. Dane o zapachu kwiatowym z pokolenia 1 i 3 zostały utracone z powodu problemów technicznych; zamiast tego zebrano zapach z pokolenia 4. Dane o zapachu kwiatowym pierwszego pokolenia uzyskano po zakończeniu eksperymentu poprzez ponowne wyhodowanie roślin z początkowego pokolenia i zbieranie zapachu z jednej rośliny z każdej ze 108 rodzin nasion. Tak więc z pierwszego pokolenia w sumie 108 roślin (36 z każdej replikacji) pobrano próbki dla zapachu kwiatowego w tym samym czasie, co rośliny z pokolenia 9.

eksperymentalna ewolucja i kuracja zapylająca

w naszych badaniach wykorzystaliśmy trzy kuracje zapylające: trzmiele (’BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Szwajcaria), muchówki (’HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Niemcy) i zapylanie ręczne. Oba owady chętnie odwiedzają kwiaty wielu gatunków z rodziny kapustowatych (Brassicaceae), ale reprezentują różne funkcjonalne kategorie zapylaczy i wykazano, że w naturalnych siedliskach różnią się pod względem liczebności46. Zastosowanie pojedynczych gatunków zapylaczy naśladuje środowiska zapylaczy, w których najliczniejsze gatunki zapylaczy różnią się funkcjonalnie. W leczeniu kontrolnym („CO”) losowo wybrane rośliny zapylano krzyżowo ręcznie.

zapylanie przeprowadzono 23 dni po wysiewie w klatce lotnej (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) w szklarni w standardowych warunkach oświetleniowych z trzmielami i muchami. Eksperymenty przeprowadzono między godziną 09: 00 a 15: 00. Trzmiele trzymano w oddzielnej klatce w szklarni. Hoverflies zostały zakupione jako poczwarki i hodowane do wylęgu, po czym samce i samice much zostały rozdzielone. Zapylacze mogły żerować na roślinach B. rapa (rośliny z grupy kontrolnej odpowiedniego pokolenia) i karmione dodatkowym pyłkiem do 3 dni przed zabiegiem zapylania; następnie dostarczano tylko pyłek i roztwór cukru; 16 h. przed zapyleniem zapylacze głodowano.

w celu zapylenia wszystkie rośliny z jednego replikatu losowo umieszczano w kwadracie 6 × 6 roślin w odległości 20 cm od siebie w klatce lotu. Pięć zapylaczy dodawano pojedynczo i kolejno, a każdy owad mógł odwiedzać maksymalnie trzy różne rośliny, a następnie usuwano z klatki; każdy owad był używany tylko raz. W sumie 12-15 roślin na replikację otrzymało jedną lub więcej wizyt od zapylaczy. Ogólna średnia (±s.d.) liczba wizyt (w odwiedzonych roślinach) wynosiła 1,35±0,63 dla roślin zapylanych trzmielami i 1,28±0,53 dla roślin zapylanych muchami. W przypadku roślin, które były odwiedzane, zanotowano liczbę wizyt i liczbę odwiedzanych kwiatów. W grupie kontrolnej losowo wybrano 12 roślin na replikację, a 5 kwiatów z każdej rośliny zostało ręcznie zapylonych przez jedną losowo wybraną roślinę ojca; ojcowie zostali wybrani spośród tych samych 12 roślin. Każda roślina mogła być dawcą pyłku dla więcej niż jednej rośliny, ale otrzymywała pyłek tylko z jednej rośliny. Po zapyleniu zaznaczano odwiedzane kwiaty, a rośliny trzymano w klatce przez dodatkowe 30 dni, aż do momentu zebrania owoców. Zliczono nasiona i obliczono względny zestaw nasion dla każdej rośliny, dzieląc pojedynczy zestaw nasion przez średni zestaw nasion w replikacie. Ponadto obliczono liczbę nasion na owoce dla każdej odwiedzanej rośliny. Dla każdej rośliny oceniano sprawność męską na podstawie przewidywanego ojcostwa (liczba przypadków eksportu pyłku).

ze wszystkich nasion wytwarzanych przez zapylone kwiaty do uprawy następnego pokolenia wykorzystano podzbiór nasion reprezentatywny dla produkcji nasion każdego osobnika. Im więcej nasion roślina wyprodukowała, tym więcej nasion przyczyniła się do następnego pokolenia, które ponownie składało się z 36 roślin na każdy replikat. Udział nasion każdej odwiedzanej rośliny w następnym pokoleniu został obliczony dla każdego replikatu jako: 36 / (Replikuj sumę nasion / indywidualny zestaw nasion). Wartości poniżej 0,5 zaokrąglono do 1.

depresja chowu wsobnego

depresja chowu wsobnego podczas całego eksperymentu została określona ilościowo przez pomiar masy nasion i szybkości kiełkowania, ten ostatni jako procent nasion kiełkujących na replikację. Do kontroli za granicę-zmiany w związku z zdegenerowanych, wsobne depresja, nasiona produkowane przez rośliny 9. generacji były uprawiane (przedstawiciel 10. generacji) i ręcznie przekraczającego granicę między rozmnaża się wewnątrz procedury, tak, że rośliny z każdej replikacji zostały dawcą pyłku i pyłku odbiorcy dla roślin dwóch różnych повторностей (♀A-♂Z, ♀B-♂I ♀Z-♂B). Przejścia w obrębie tych kombinacji replik były losowe. Z uzyskanych nasion (jedenaste pokolenie) jeden osobnik z rodziny nasion uprawiano (36 roślin na replikację) w takich samych warunkach jak podczas eksperymentu. Spośród tych krzyżówek międzylaboratoryjnych ponownie zmierzono cechy i wykorzystano je do ostatecznego porównania cech między grupami leczonymi.

cechy roślin

większość cech, w tym zapach kwiatowy, mierzono przed zapyleniem, 19-21 dni po wysiewie. Szerokość płatka, Długość, Długość słupka i średnica kwiatu trzech losowo wybranych kwiatów na roślinę mierzono za pomocą elektronicznego zacisku (Cyfrowy Zacisk 0-150 mm,Narzędzie). Nektar z trzech kwiatów zebrano za pomocą 1 µl mikro rurek kapilarnych (Blaubrand, Wertheim, Niemcy), a objętość określono przez pomiar długości kolumny nektaru w mikropipetce za pomocą suwmiarki. Do kwantyfikacji użyto średniej trzech kwiatów. Dla 157 roślin równomiernie podzielonych w ramach obróbki oznaczono zawartość cukru w nektarze za pomocą derywatyzacji i analizy chromatograficznej gazowej. W tym celu nektar był przenoszony do papieru filtracyjnego przechowywanego w żelu krzemionkowym. Sektor papieru filtracyjnego zawierającego nektar odcinano od reszty papieru filtracyjnego i eluowano nektar w 1 ml wody Mili-Q o wysokiej czystości, wstrząsając rozcieńczeniem przez 90 minut przy 400 obr. / min w temperaturze 60 °C na wytrząsarce laboratoryjnej. Następnie 50 µl roztworu suszy się w temperaturze 60 °C i derywatyzuje 100 µl mieszaniny bezwodnej pirydyny (Fisher Scientific, Geel, Belgia), heksametylosilazanu (Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria) i trimetylochlorosilanu (Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria) (10:5:3). Następnie próbki zostały przeprowadzone przez GC-MS zgodnie z opisem w ref. 32. Obliczyliśmy całkowitą ilość cukru na kwiat i kwiatostan jako sumę wszystkich różnych cukrów (fruktozy, glukozy, sacharozy i sorbitolu). Korelacja między zawartością cukru w nektarze a objętością nektaru była dodatnia i wysoka (r156=0,732, P<0,001), zatem dla pozostałych roślin oznaczono tylko objętość nektaru. Kolekcja zapachów kwiatowych została wykonana przed badaniem biologicznym w sposób nieniszczący ze wszystkich kwiatostanów roślin, gdy tylko co najmniej pięć kwiatów zostało otwartych. Wykorzystaliśmy sorpcję headspace z systemem push-pull59, 60. Kwiatostany roślin były zamknięte w szklanych cylindrach wcześniej pokrytych sigmacote (Sigma-Aldrich) i zamknięte płytką Teflonową. Liczba otwartych kwiatów była liczona dla każdej rośliny. Powietrze z otoczenia było wypychane z szybkością przepływu 100 ml filtrów z węglem aktywnym min−1 do szklanego cylindra. Jednocześnie powietrze było wyciągane ze szklanego cylindra o natężeniu przepływu 150 ml min-1 przez szklaną rurkę wypełnioną ∼30 mg Tenax TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Powietrze z pustych szklanych cylindrów było zbierane jako sterowanie powietrzem. Substancje lotne kwiatowe zbierano przez dwie godziny w fitotronie w standardowych warunkach oświetleniowych i temperaturowych. Oznaczanie ilościowe substancji lotnych przeprowadzono metodą chromatografii gazowej z detekcją selektywną masową (GC-MSD). Próbki były wstrzykiwane do GC (Agilent 6890n; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) za pomocą wielofunkcyjnego próbnika (MPS; Gerstel, Müllheim, Niemcy) za pomocą termicznego urządzenia desorpcyjnego Gerstel (TDU; Gerstel) z systemem wtrysku na zimno (CIS; Gerstel). W przypadku termodesorpcji TDU ogrzewano od 30 do 240 °c z szybkością 60 °C min-1 i utrzymywano w temperaturze końcowej przez 1 min. CIS ustawiono na -150 °C podczas wychwytywania związków elutujących z TDU. W przypadku wstrzyknięcia CIS ogrzewano do 250 °c z szybkością 12 °C s-1, A temperaturę końcową utrzymywano przez 3 minuty. GC był wyposażony w kolumnę HP-5 (średnica 0,25 mm, grubość warstwy 0,25 µm, długość 15 m), a Hel był używany jako gaz nośny o natężeniu przepływu 2 ml min−1. Identyfikacja i kwantyfikacja związków zostały przeprowadzone w następujący sposób: 60 za pomocą programu Agilent MSD ChemStation. Oznaczanie ilościowe związków uzyskano poprzez pomiar obszarów szczytowych wybranych jonów docelowych specyficznych dla poszczególnych związków zapachowych. Specyficzne jony docelowe uzyskano ze wzorców syntetycznych wszystkich związków; obszary szczytowe przekształcono w wartości bezwzględne za pomocą krzywych kalibracyjnych wcześniej uzyskanych dla każdego związku przy użyciu związków syntetycznych w trzech różnych stężeniach. W analizie uwzględniono tylko związki zapachowe, które występowały w znacznie większych ilościach niż w kontroli powietrza (łącznie 14 związków zapachowych). Wszystkie ilości substancji lotnych obliczono w pg na kwiat L-1.

dwadzieścia trzy dni po wysiewie, w tym samym dniu, w którym dokonano zapylenia, zarejestrowano liczbę otwartych kwiatów i wysokość każdej rośliny. Po zapyleniu (ale tego samego dnia) spektrofotometrem światłowodowym (AvaSpec-2048) zarejestrowano widmo odbicia barwy trzech płatków z różnych niepollinowanych (jeśli to możliwe) kwiatów na roślinę; Avantes, Apeldoorn, Holandia) i ksenonowe źródło światła pulsacyjnego (AvaLight-XE; Avantes). Jeden płatek na raz umieszczono pod spektrofotometrem (szczególnie skupiając się na dalszej części płatka), a procentowy współczynnik odbicia (w stosunku do białego wzorca) między 200 a 900 nm co 0,6 nm zarejestrowano w trybie transmisji. Z mierzonego widma w analizie wykorzystano jedynie średnią wartości odbicia co 10 nm od 260 do 650 nm z trzech płatków. W roślinach jedenastej generacji poddano analizie pod kątem koloru podzbiór około 20 roślin na replikację, ponieważ żaden z barwników nie był poddawany selekcji w całym eksperymencie. Obszar powierzchni płatków pochłaniających i odbijających promieniowanie ultrafioletowe został zmierzony tylko w zakładzie 11 generacji za pomocą czułego na promieniowanie ultrafioletowe aparatu cyfrowego z obiektywem kwarcowym. Wykonano zdjęcia kwiatów i oznaczono obszar pochłaniania promieniowania ultrafioletowego za pomocą pakietu oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

testy preferencji zapylaczy

testy preferencji zapylaczy przeprowadzono dla każdego replikatu z obu typami zapylaczy. Dla każdego replikatu przeprowadzono dwa testy behawioralne (po jednym dla każdego zapylacza). Rośliny zapylane przez trzmiele i muchówki (pokolenie 11) z każdej replikacji zostały losowo sparowane i umieszczone obok siebie (odległość około 30 cm) w klatce lotu (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Jeden zapylacz był umieszczany w klatce i pozwalał odwiedzać jedną roślinę. Zapylacze zostały natychmiast złapane po dokonaniu wyboru. Każda para roślin była oznaczana jednym zapylaczem.

samowystarczalność i selfing autonomiczny

aby przetestować samowystarczalność, wyhodowaliśmy rośliny z pierwszej (15 roślin na replikę) i jedenastej generacji (30 roślin na replikę). Wyhodowano jedno nasiona na rodzinę nasienną (z losowo wybranych rodzin) i dwa kwiaty na roślinę. Średnia liczba nasion wyprodukowanych na samowystarczalny kwiat dla każdej pojedynczej rośliny została wykorzystana jako miara samowystarczalności.

aby przetestować selfing autonomiczny, wyhodowaliśmy około 12 roślin (po jednym nasionie na rodzinę) na replikat z każdego zabiegu pokolenia 11 i 1 (łącznie 162 rośliny). Po 30 dniach, kiedy około 20 kwiatów otworzyło się, Pozostałe pąki w każdej roślinie zostały starannie ścięte i zarejestrowano liczbę otwartych kwiatów. Następnie pozwolono roślinie rozwijać owoce bez dostępu owadów do roślin. Po dojrzewaniu owoców zebrano nasiona, a liczbę nasion policzono i zważono dla każdej rośliny. Liczbę owoców na otwarty kwiat i nasiona na owoce wykorzystano jako pomiar dla autonomicznego selfingu. Ponieważ kilka roślin miało bardzo dużą liczbę owoców na otwarte kwiaty, usunęliśmy te wartości odstające w celu ostatecznego porównania autonomicznego selfingu. Usunięto następującą liczbę odstających: 1 W generacji 1; w G11: 2 w BB, 3 W HF, 2 w CO.

analiza statystyczna

w celu analizy selekcji fenotypowej obliczono różnice i gradienty selekcji poprzez regresję wydolności roślin na cechy61. Analizę tę przeprowadzono oddzielnie dla zabiegów, ale dla wszystkich replikatów i pokoleń łącznie. Jako oszacowanie sprawności wykorzystano „liczbę wizyt”, która była zmienną liczącą i odpowiadała rozkładowi Poissona. Inna zmienna przydatności, „relative seed set”, miała distibution stronniczy przez wiele wartości zerowych; ponadto zestaw nasion brakowało jedynego męskiego składnika przydatności pierwszej odwiedzanej rośliny, który nie ustawił nasion z tej wizyty (ponieważ zapylacze początkowo nie przenosiły pyłku Kapustnego). Liczba wizyt była jednak silnie skorelowana ze względnym zestawem nasion (BB: r626=0,694, P<0,001; HF: r605=0,597, p<0,001). Uogólnione modele liniowe (z rozkładem Poissona) zostały wykorzystane do obliczenia gradientów selekcji (wielowymiarowych) i różnic (univariate) dla każdego leczenia z liczbą wizyt jako zmienną zależną i cechami jako zmiennymi współzmiennymi. Ponadto obliczono kwadratowe gradienty selekcji z uwzględnieniem wszystkich cech i terminu kwadratowego każdej cechy dodanej do modelu, a następnie gradienty podwojone62. Aby sprawdzić różnice w doborze trzmieli i muchówek, przeprowadzono uogólniony model liniowy (z rozkładem Poissona)z liczbą wizyt jako zmienną zależną, leczeniem jako stałym czynnikiem, cechami roślin jako zmiennymi współzmiennymi i interakcją treatment*plant trait. Przed analizą doboru wszystkie zmienne były standaryzowane do średniej = 0 I s. d.=1 (wartości Z) na poziomie replikacji. Zastosowano również uogólniony model liniowy do porównania liczby odwiedzin roślin zapylanych przez trzmiele i muchołówki we wszystkich pokoleniach. Wartości spektrofotometru kolorów kwiatowych zostały zmniejszone poprzez analizę głównego komponentu (PC) z rotacją varimax. W analizie wykorzystano tylko Komputery PC z wartością własną powyżej.

zmiany ewolucyjne cech roślin oceniano w roślinach 11.generacji za pomocą wielowymiarowej liniowej analizy funkcji rozróżniającej i univariate general linear models (GLM). W przypadku GLM każda cecha była stosowana jako zmienna zależna, replikacja jako czynnik losowy i leczenie jako czynnik stały za pomocą testu post-hoc LSD. Aby odróżnić wpływ doboru naturalnego od dryfu, oceniliśmy, czy różnice cechowe były spójne wśród replikatów danego zapylenia. W analizie GLM znaczący efekt „leczenia” wskazuje na różnicę cech między różnymi grupami zapylającymi we wszystkich replikatach, a tym samym odróżnia ewolucję specyficzną dla zapylacza od dryfu. Dryft byłby wskazywany przez zmiany ewolucyjne tylko w niektórych (losowych) replikatach, wskazywane przez znaczenie czynnika „replikacji” lub interakcję między „replikacją” a „leczeniem”. Samowystarczalność i autonomiczny selfing również zostały ocenione przez GLM, ale wartości zakładów pierwszej generacji zostały uwzględnione w analizie. Do analizy substancji lotnych i objętości nektaru, dane zostały przekształcone ln(1 + x), aby zbliżyć się do rozkładu normalnego. W przypadku GLM ze zmiennymi kolorów przeprowadzono analizę PC zgodnie z opisem powyżej, ale bez uprzedniej standaryzacji zmiennych. Analizę PC przeprowadzono dla wszystkich zabiegów, replikatów i wszystkich pokoleń razem, co dało cztery PCs wyjaśniające 96,9% całkowitej wariancji. Częstość występowania kwiatów pozbawionych nektaru analizowano oddzielnie dla każdego pokolenia, stosując uogólnione modele liniowe z rozkładem bimodalnym, z „obecnością nektaru” (tak / nie)jako zmienną zależną, a obróbką i replikacją jako czynnikami. Cechy w kwiatach nektarodajnych i pozbawionych nektaru porównano dla dziewiątego i jedenastego pokolenia razem, stosując ogólne modele liniowe z cechą jako zmienną zależną, a „obecnością nektaru” i leczeniem jako stałymi czynnikami. Preferencje pierwszego wyboru trzmieli i muchówek analizowano za pomocą testu dwumianowego (test-prop=0,5; wszystkie repliki połączone). Korelacje między nektarem a cechami roślin obliczono dla wszystkich pokoleń, wykorzystując korelacje pomiędzy momentem produktu Pearsona a wartościami przekształconymi ln. Statystyki były wykonywane za pomocą IMB SPSS Statistics (Wersja 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

dostępność danych