wprowadzenie

Halofile to interesująca grupa organizmów kwitnących przy wysokim zasoleniu . Organizmy te można ogólnie sklasyfikować na podstawie ich optymalnego zasolenia do wzrostu na łagodne halofile (1-6%, w/v NaCl), umiarkowane halofile (7-15%) i ekstremalne halofile (15-30%) (Madigan i Martinko, 2006). Szeroko zakrojone badania wykazały, że halofile nie są ograniczone do żadnej z domen życia, mogą być eukariotami(Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), czyli prokarioty należące do domen bakterii i archeonów. Glony z rodzaju Dunaliella i solanka Artemia (Boetius and Joye, 2009) są przykładami halofilnych eukariotów, podczas gdy Halobacterium i Salinibacter są przykładami halofilnych prokariotów. Sukces halofili w przetrwaniu w wysoce słonych środowiskach jest spowodowany unikalnymi adaptacjami fizjologicznymi, takimi jak strategia pompowania jonów i akumulacji substancji organicznych (Oren, 2006; Madigan i Martinko, 2006). Na poziomie genomowym i proteomicznym halofile charakteryzują się wysoką zawartością GC, a białka niską hydrofobowością, nadmierną reprezentacją reszt kwaśnych, niższymi skłonnościami do tworzenia helisy i wyższymi skłonnościami do struktury cewki (Paul i in., 2008).

Halofile zyskują obecnie większy dostęp do mikrobiologii przemysłowej i biotechnologii, ponieważ halofile rosną w wysokim stężeniu soli, co minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia podczas uprawy (Oren, 2006). Nielicznymi przykładami zastosowań biotechnologicznych jest zastosowanie Micrococcus varians do produkcji nukleazy H (Kamekura el Al., 1982) i zastosowanie halofilowych szczepów Tetragenococcus w produkcji sosu sojowego i produkcji niektórych enzymów, w tym hydrolaz (amylazy, nukleazy, fosfatazy i proteazy) (Oren, 2006). Halofile są również ważne w biodegradacji i bioremediacji, ponieważ wiele halofili jest w stanie degradować węglowodory i inne toksyczne związki (Ventosa i wsp., 1998). Halofile mogą również wytwarzać polimery stosowane jako wzmacniacze odzyskiwania oleju ze względu na ich aktywność powierzchniowo czynną i właściwości bioemulgujące (Oren, 2006).

Halofile rozwijają się w środowiskach, w których zasolenie osiąga wysoki poziom, takich jak oceany, salterny słoneczne i naturalne słone jeziora (Oren, 2007). Morze Martwe Jordanii jest jednym z największych śródlądowych słonych jezior na świecie (Boetius i Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan i Martinko, 2006). Oprócz wysokiego zasolenia; sól, stężenie ponad 340 g L-1 (Oren, 2007), Morze Martwe jest wyjątkowy ze względu na wysokie ciśnienie barometryczne (800 mmHg) ze względu na bardzo niską wysokość poniżej poziomu morza, częściowe ciśnienie tlenu (PIO2) o 8% więcej niż na poziomie morza, unikalne promieniowanie UV, niską wilgotność (poniżej 40%) i brak opadów (Avriel et al., 2011).

To badanie zostało przeprowadzone w celu sklasyfikowania halofilnych heterotroficznych gatunków bakterii kwitnących w strefie przybrzeżnej Morza Martwego w Jordanii. Klasyfikacja drobnoustrojów opiera się na morfologii kolonialnej i komórkowej, a także podobieństwie genu 16S rRNA.

materiały i metody

pobieranie próbek: próbki wody z Morza Martwego Pobrano z czterech stref przybrzeżnych (rys. 1) W marcu, czerwcu i październiku 2011 r. Współrzędne geograficzne i wysokość miejsc pobierania próbek przedstawiono w tabeli 1. Współrzędne geograficzne i wysokość zostały określone dla każdej lokalizacji przez (eTrex Legend C, Tajwan). Próbki wody z Morza Martwego zebrano w 1 L czystej sterylnej szklanej butelce, pozostawiając wystarczającą ilość miejsca na głowę w butelce i natychmiast przetransportowano do laboratorium.

Analiza fizykochemiczna próbek: Oznaczono temperaturę, pH, całkowite rozpuszczone ciała stałe (TDS) i biologiczne zapotrzebowanie na tlen (BOD) próbek wody. Temperaturę wody, pH i zasolenie mierzono in situ. Temperaturę wody i pH mierzono za pomocą przenośnego pH-metru (Microcomputer pH meter T19000, Trans Instruments). Zasolenie mierzono za pomocą ręcznego refraktometru zasolenia. BOD mierzono w (Water, Environment and Arid Regions research Center at Al al-Bayt University, Jordania). Próbki wody przeniesiono do nowej szklanej butelki, a następnie dodano 1 mL buforu fosforanowego, siarczanu magnezu, chlorku wapnia, roztworów chlorku żelaza na litr próbki wody. Następnie próbkę doprowadzono do temperatury 20±3°C i nasycono wolnym od organicznych, przefiltrowanym powietrzem. Sprawdzono pH próbki. Jeśli próbka nie była w zakresie 6,5-7,5, dodano kwas siarkowy lub wodorotlenek sodu w celu doprowadzenia próbki do wymaganego zakresu pH (6,5-7,5), A dodane stężenie nie rozcieńczało próbki więcej niż 0,5%. Próbkę doprowadzono do temperatury 20°C przed rozcieńczeniem. Odpowiednia objętość próbki była następnie przenoszona do butelek BOD. Butelka została napełniona wystarczającą ilością wody rozcieńczającej, aby wyprzeć całe powietrze, nie pozostawiając pęcherzyków. Tlen rozpuszczony (DO) oznaczano za pomocą analizatora DO, a wszelkie przemieszczone treści zastąpiono szczelnie wodą rozcieńczającą i korkiem. Butelkę inkubowano przez 5 dni w temperaturze 20°C. Następnie oznaczano DO i obliczano BOD według różnicy między początkowym i końcowym DO nad objętością.

wzbogacanie, izolacja i barwienie gramem: Aby wzbogacić próbki wody, wodę z Morza Martwego (10 mL) przeniesiono do 90 mL ciekłego pożywki o wysokim zasoleniu i inkubowano w temperaturze 30°C w ciemności z wytrząsaniem (100 obr. / min). Po około 12 h, zapętlono pętlę Kultury wzbogacającej na zmodyfikowanym stałym podłożu soli mineralnej, a następnie wyodrębniono kolonie subkulturalne. Wytworzono również zapasy glicerolu izolatów i przechowywano je w temperaturze -20°C do dalszej analizy. Komórki zostały zabrudzone gramami i zbadane pod mikroskopem.

sekwencjonowanie i analiza genu 16S rRNA: amplifikację sekwencji genu 16S rRNA i sekwencjonowanie przeprowadzono przez Macrogen Inc., Seul, Korea, zgodnie z następującą metodą: Młode kolonie szczepów bakteryjnych zawieszono w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mL zawierającej 0,5 mL jałowego roztworu soli fizjologicznej, a następnie odwirowano przy 10 000 obr. / min przez 10 minut supernatant usunięto i osad zawieszono w 0,5 mL matrycy Instagenowej (Bio-Rad, USA) i inkubowano w temperaturze 56°C przez 30 min, a następnie ogrzewano do 100°C przez 10 min. Po podgrzaniu do PCR użyto supernatantu. PCR przeprowadzono przez zmieszanie 1 µL wzorcowego DNA z 20 µL roztworu reakcyjnego PCR. Podkłady 27F / 1492r (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: Do wzmocnienia użyto 5’-Tac GGY Tac CTT GTT ACG ACT T-3′), a następnie wykonano 35 cykli wzmocnienia w temperaturze 94°C przez 45 sek, 55°C przez 60 sek i 72°C przez 60 sek. niezakłócone startery PCR i dNTPs usunięto z produktów PCR za pomocą zestawu montażowego PCR Clean up kit (Millipore). Oczyszczone produkty PCR o wartości około 1400 bp zsekwencjonowano za pomocą starterów 518f / 800R (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu Big Dye terminator cycle sequencing kit v.3. 1 (Applied BioSystems, USA). Produkty sekwencjonowania zostały rozwiązane na Applied Biosystems model 3730xl automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA) w Macrogen, Inc., Seul, Korea.

sekwencje analizowano i porównywano z publiczną bazą nukleotydów za pomocą strony NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sekwencje najbliższych krewnych zostały następnie pobrane z bazy danych i wykorzystane do skonstruowania drzewa filogenetycznego przy użyciu MEGA5 (Tamura et al., 2011). Zawartość GC sekwencje zostały obliczone za pomocą kalkulatora Oligo (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

wyniki

właściwości fizykochemiczne próbek: próbki wody z Morza Martwego były bardzo zasolone w zakresie od (36-38%). Wartości pH próbek były niskie i wynosiły od 5,6 do 6,3. Wskazuje to na lekko kwaśną właściwość wody morskiej. Wartość BOD była bardzo niska (1-2 mg O2 L-1), co wskazuje na bardzo niską zawartość materiału organicznego w próbce. Właściwości fizykochemiczne przedstawiono w tabeli 2.

heterotroficzna żywotna liczba bakterii: wyniki żywotnej liczby płytek wykazały bardzo małą liczbę jednostek tworzących kolonie w każdej próbce (200-6000 CFU mL-1). Ilość CFU przedstawiono bardziej szczegółowo w tabeli 3.

izolacja i klasyfikacja halofilnych bakterii heterotroficznych: w tym badaniu wyizolowano 44 halofilne heterotroficzne szczepy bakterii. Jedenaście szczepów bakterii z 44 uznano za różne w oparciu o morfologię kolonialną, barwienie gramami i morfologię komórek. Siedem z jedenastu różnych szczepów było Gram-dodatnich, a 4 z 7-Gram-ujemnych. Szczepy bakterii zidentyfikowano na podstawie analizy genu 16S rRNA i stwierdzono, że należą do domeny bakterii. Najbliższy krewny każdego wyizolowanego szczepu bakterii przedstawiono w tabeli 4 i Fig. 2. Wszystkie sekwencje wykazały stosunkowo wysoką zawartość GC (do 58%).

dyskusja

oznaczono i przeanalizowano właściwości fizykochemiczne próbek wody z Morza Martwego. Odsetek zasolenia okazał się bardzo wysoki (do 38%). Jest to typowa cecha wody z Morza Martwego, co czyni ją jedną ze słynnych solanek “athalassohaline” (Oren, 2007). Stwierdzono, że pH wody z Morza Martwego jest lekko kwaśne (5,6-6,3) w porównaniu z pH (7,5-8) w solankach talasohalinowych (Oren, 2007). BOD próbek były bardzo niskie (1-2 mg O2 L-1) odzwierciedlając Niski Materiał organiczny w wodzie, które mogą być wykorzystane przez bakterie heterotroficzne. Te warunki fizykochemiczne niewątpliwie negatywnie wpływają na różnorodność mikrobiologiczną. W związku z tym liczba żywych komórek w badanych próbkach była bardzo niska (nie więcej niż 6×102 CFU mL-1) w porównaniu z otwartą wodą morską. Liczba bakterii heterotroficznych w wodach morskich wynosi zwykle od 105 do 106 bakterii mL-1 (Zweifel i Hagstrom, 1995; Madigan i Martinko, 2006). Liczby te pochodzą z niespecyficznych technik barwienia fluorescencyjnego (Zweifel i Hagstrom, 1995), które zwykle dają wyższe liczby niż opłacalna metoda liczenia płytek. Pierwsze publikacje na temat liczby bakterii w Morzu Martwym zostały wykonane za pomocą mikroskopu. Numer komórki wynosił około 1.9×106 komórek mL1 i podczas kwitnienia czerwonych halobakterii zagęszczenie populacji osiągnęło 1, 9×107, ale zmniejszyło się po ćmach do 5×106 (Oren, 1983).

badania nad organizmami halofilnymi zamieszkującymi Morze Martwe rozpoczęły się bardzo wcześnie w 1892 roku, kiedy bakterie zostały wyizolowane z rodzaju Clostridium z błota (Oren, 2002). Później, w krótkim artykule opublikowanym w 1936, podał pierwszy opis lokalnej społeczności mikrobiologicznej przystosowanej do ekstremalnie trudnych warunków Morza Martwego (Oren and Ventosa, 1999). Od tego czasu nasza wiedza na temat biologicznych aspektów Morza Martwego rozszerza się i gromadzi. Przeprowadziliśmy te badania, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat halofilnych bakterii heterotroficznych kwitnących w strefie przybrzeżnej Jordańskiego Morza Martwego. Wyizolowaliśmy różne gatunki bakterii. Następnie wyizolowaliśmy i zidentyfikowaliśmy 11 różnych gatunków bakterii halofilnych. Większość izolatów była Gram-dodatnia (7 z 11). Mimo że bakterie Gram-dodatnie posiadają ważne adaptacje, umożliwiają im uleganie stresom środowiskowym, takim jak wysokie zasolenie (Battistuzzi and Hedges, 2009). W literaturze nie jest jasne, czy bakterie Gram-dodatnie czy Gram-ujemne dominują w środowiskach hipersalinowych. W jednym z badań nad prokariotycznymi halofilami odzyskanymi z osadów z płytkiego słonego jeziora El-Djerid w Tunezji, Hedi et al. (2009) stwierdził, że dominująca populacja bakterii należy do Gram-dodatnich bakterii sportotwórczych.

wszystkie wyizolowane szczepy w tym badaniu należą do domeny bakterii. Należą do 7 różnych rodzajów w tej dziedzinie. Pięć z siedmiu Gram-dodatnich izolatów bakteryjnych należy do rodzaju Bacillus. Rodzaj ten został ustanowiony w 1872 roku i obejmuje trzy gatunki, ale obecnie istnieją 142 gatunki wymienione w podręczniku systematycznej bakteriologii Bergeya (Logan and de Vos, 2009). Szczepy Bacillus są zwykle szczepami glebowymi. Szczepy Bacillus wyizolowane w tym badaniu należą do następujących gatunków B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis I B. cereus. Szczepy te spotykano w różnych środowiskach słonych (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Na przykład B. licheniformis został wcześniej odzyskany z osadów morskich przez Miranda et al. (2008), podczas gdy B. pumilus został wyizolowany z organizmów morskich, takich jak ostrygi, kraby i ryby, oprócz osadów przez Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis został wydobyty z wody morskiej Morza Wschodniego i Morza Żółtego w Korei (Yoon et al., 2004). I wreszcie B. cereus, pospolita bakteria glebowa, została napotkana w ściekach, ale o właściwościach halofilnych (Al-ZaZaee et al., 2011). Gruba ściana komórkowa, wysoka zawartość peptydoglikanów (ponad 90% ściany komórkowej) (Madigan i Martinko, 2006), wysoka zawartość GC i tworzenie opornych zarodników to główne powody przetrwania Bacillus w trudnych warunkach, takich jak wysokie zasolenie. Należy zauważyć, że szczep DSD32 (zidentyfikowany jako B. cereus) ma bardzo małe podobieństwo do swojego najbliższego krewnego B. cereus. Szczep ten może reprezentować nowy gatunek w rodzaju Bacillus oparty na Genie 16S rRNA.

pozostałe dwie bakterie Gram-dodatnie to szczepy Arthrobacter Sp. i Kocuria rosea. Gatunki Arthrobacter są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, zwłaszcza w glebie (Funke et al., 1996), ale nie występuje zbyt często w środowiskach hipersalinowych. Kocuria rosea jest uważana za gatunek umiarkowanie halofilny i została odzyskana z różnych środowisk solnych, takich jak słona woda na otwartych płytkich wodach, a niektóre szczepy Kocuria rosea rosną optymalnie przy stężeniu NaCl 30% (Wright and Tanaka, 2002).

bakterie Gram-ujemne występowały rzadziej w naszych próbkach (4 z 11). Niemniej jednak, opublikowana Literatura pokazuje, że Izolaty te nie są rzadkością w słonych środowiskach. Jeden z wyizolowanych szczepów zidentyfikowano jako Vibrio alginolyticus. Ten ostatni gatunek jest rzeczywiście powszechne w próbkach morskich (Molitoris et al., 1985) i spotykany był w morskich wodach morskich. Szczep ma znaczenie medyczne, ponieważ może powodować skomplikowane zakażenia skóry i tkanek miękkich (Sganga et al., 2009). Co ważniejsze, stwierdzono, że niektóre szczepy Vibrio alginolyticus wytwarzają tetrodotoksynę, silną neurotoksynę (Noguchi et al., 1987). Inną Gram-ujemną bakterią zidentyfikowaną w tym badaniu jest Chromohalobacter salexigens. Gatunek ten został najpierw wyizolowany i opisany jako umiarkowanie halofilny gatunek Halomonas elongata, a następnie zaproponowany jako nowy gatunek Chromohalobacter(Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli jest kolejnym gatunkiem zidentyfikowanym w tym badaniu. Szczep ten nie jest również rzadkością w siedliskach solankowych. Został niedawno wyizolowany z pływów Morza Żółtego w Korei i został opisany jako gatunek halofilny przez Yoona i wsp. (2005). Ostatni szczep należy do Salinivibrio costicola. Gatunek ten został po raz pierwszy opisany jako Vibrio costicola, ale jego cechy fenotypowe i genotypowe odróżniały go od gatunków z rodzaju Vibrio. Dlatego szczep został umieszczony w nowym odrębnym rodzaju o nazwie Salinivibrio(Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola jest umiarkowanie halofilny i został pierwotnie wyizolowany z solonej żywności i rośnie optymalnie w mediach zawierających 10% soli(Mellado et al., 1996). Członek rodzaju Salinibacter, S. ruber, jest interesującym modelem do badania adaptacji mikroorganizmów do życia w wysokich stężeniach soli (Oren, 2007).

wnioski

woda z Morza Martwego ze strefy litoralu charakteryzuje się wysokim zasoleniem, niskim pH, niską zawartością materiału organicznego (low bod) i powstrzymuje różne gatunki bakterii heterotroficznych należących zarówno do rodzajów Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, w tym Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus i Erythrobacter.

podziękowanie

to badanie zostało wsparte decyzją Rady ds. badań naukowych nr 2/2010/2011 dziekanatu ds. badań naukowych Uniwersytetu Al al-Bayt w Jordanii. W związku z tym autor chciałby docenić pomoc finansową udzielaną przez uczelnię.