bone mineral: new insights into its chemical composition
Identyfikacja 2− jonów HPO4 w minerale kości
bezpośrednie wykrywanie protonów zlokalizowanych w minerale kości z nienaruszonej próbki tkanki kostnej nie jest możliwe. Wynika to z obecności pozakomórkowej matrycy organicznej, której różne sygnały dominują w widmie 1h pojedynczego impulsu (SP) ssNMR próbki tkanki kostnej54. Jednak możliwość ujawnienia przestrzennych bliskości w skali atomowej między jądrami wodoru i fosforu w dwuwymiarowym (2D) {1H}31P korelacji Heteronuklearnej (HetCor) eksperyment ssNMR pozwala na badanie środowiska wodorowego mineralnego kości poprzez analizę wymiaru F1 (Fig. 1a). Niestety, ten eksperyment jest czasochłonny i prowadzi do 1h projekcji wymiaru pionowego (F1) ze stosunkowo słabym stosunkiem sygnału do szumu (S/N) i niską rozdzielczością cyfrową (rys. 1B). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, użyliśmy jednowymiarowego (1D) {1H-31P}1h podwójnego polaryzacji krzyżowej (CP) ssNMR eksperyment. Składa się z podwójnego transferu CP przeprowadzonego w sposób „tam i z powrotem” (1h→31P→1H) (rys. S1). Po pierwsze, ten eksperyment pozwolił nam uzyskać 31-filtrowane 1h widma ssNMR minerału kostnego z nienaruszonej, korowej 2-letniej próbki tkanki kostnej owiec z doskonałym S / N pomimo stosunkowo krótkiego czasu akwizycji (tj. 1C, D). Różne środowiska chemiczne 1H od bone mineral są teraz łatwe do zaobserwowania i mogą być bezpiecznie analizowane z precyzją. W odniesieniu do wewnętrznego krystalicznego rdzenia cząsteczek minerałów kostnych, jony hydroksylowe obecne w sieci krystalicznej hydroksyapatytu są obserwowane w postaci złożonego rezonansu o środku δ (1H) = 0,0 ppm. Jeśli chodzi o amorficzną warstwę powierzchniową, strukturalne cząsteczki wody i kwaśne fosforany obecne w środowiskach nieapatytycznych można zaobserwować w postaci pojedynczego rezonansu skupionego przy δ(1h) = 5.2 ppm i szeroki rezonans od δ (1h) = 7 do 17 ppm32, odpowiednio.
wykrywanie gatunków wodorowych w minerałach kostnych. 1h-31P oparte na polaryzacji krzyżowej (CP) Magic angle spinning (MAS) widmo półprzewodnikowego jądrowego rezonansu magnetycznego (ssNMR) suchej próbki tkanki kostnej owiec w wieku 2 lat. A) dwuwymiarowe (2D) {1H}31P widmo korelacji Heteronuklearnej (HetCor) (czas kontaktu, TCP = 1000 µs). Intensywność sygnału wzrasta z niebieskiego na czerwony. B) 1h rzut pionowego (F1) wymiaru widma HetCor 2D {1H}31P pokazanego w lit. a). {1h-31P}1h podwójne widma mas CP rejestrowane z następującymi czasami kontaktu: (c) tCP1 = tCP2 = 1000 µs; oraz (D) Tcp1 = tCP2 = 15000 µs. Całkowity czas eksperymentalny był taki sam w każdym eksperymencie (tj.
Po drugie, ten eksperyment pozwala na zbadanie dynamiki wykrytej 1H CP w celu selektywnego ujawnienia natury jąder 1h w pobliżu jąder 31P. W tym celu Czas kontaktu 1 (Tcp1) utrzymywany był na stałym poziomie 1000 µs, podczas gdy czas kontaktu 2 (Tcp2) zmieniał się od 75 µs do 1000 µs (Fig. 2). Równomierny wzrost namagnesowania obserwuje się zarówno dla rezonansów wyśrodkowanych przy δ(1H) = 0,0, jak i δ(1h) = 5,2 ppm (patrz Czarne przerywane linie), wcześniej przypisywanych jonom OH− i strukturalnym cząsteczkom H2O zgodnie z ich odpowiednim przesunięciem chemicznym 1H NMR. Natomiast ewolucja szerokiego sygnału w zakresie δ(1h) = 7-17 ppm początkowo wykazuje gwałtowny wzrost jego namagnesowania (do tCP2 = 300 µs), po czym następuje występowanie zachowania oscylacyjnego (do tCP2 = 1250 µs – patrz czarna przerywana linia). Oscylacja ta jest charakterystyczna dla oscylacji dipolarnych 1H-31P (DP-h) 55,56. Dopasowanie odpowiednich widm {1h-31P}1h ssNMR w różnych tCP2 nie jest proste ze względu na nakładanie się różnych rezonansów. Podczas gdy syntetyczne próbki HA zwykle wykazują symetryczny rezonans OH32; pokazujemy tutaj, że rezonans OH minerału kostnego jest szczególnie złożony i można go dopasować w następujący sposób: główny pik przy δ(1H) = 0,0 ppm otoczony dwoma pikami ramion przy δ(1h) = -0,7 i 0,9 ppm (rys. S3). Rezydualny strukturalny rezonans wody może być odpowiednio wyposażony w pojedynczy szczyt wyśrodkowany przy δ(1H) = 5,2 ppm (rys. S4). Natomiast szeroki sygnał z kwaśnych fosforanów obserwowalny w zakresie δ (1H) = 7-17 ppm nie może być zadowalająco wyposażony w pojedynczy pik o stałej pozycji i szerokości linii, zwłaszcza przy krótkich czasach kontaktu (patrz najlepsze wyniki dopasowania dla różnych wartości tCP2 na Fig. S4-lewa kolumna). Jednak wyniki dopasowania są dokładne, gdy stosowane są dwa różne piki ze stałymi pozycjami i stałymi szerokościami linii (odpowiednio 6,2 ± 0,1 i 5,0 ± 0,1 ppm) (rys. S4-prawa kolumna). Nie możemy twierdzić, że ten szeroki sygnał składa się tylko z dwóch pików odpowiadających dwóm różnym środowiskom protonów, ale prawdopodobnie składa się z szerokiego rozkładu środowisk chemicznych prowadzących do rozkładu przesunięć chemicznych NMR. Odpowiednio, Rys. 3A pokazuje cztery piki, które zostały użyte do analizy przefiltrowanych przez 31P widm 1h ssNMR minerału kostnego dla każdej wartości tcp2: (i) złożony pik wyśrodkowany przy δ (1H) = 0,0(fioletowy) i pojedynczy pik wyśrodkowany przy δ (1H) = 5,2 (szary) ppm, oba charakteryzujące się stosunkowo powolnym i równomiernym wzrostem ich namagnesowania; oraz (ii) dwa piki przy δ(1H) = 9,8 (niebieski) i 14,0 (zielony) ppm, oba wykazujące oscylacje dipolarne (rys. 3b). W odniesieniu do tych dwóch ostatnich pików dokładne dopasowanie profilu Hartmanna-Hahna (H-H) (rys. S2) umożliwia numeryczne modelowanie krzywych narastania CP zgodnie z modelem pojedynczej pary spinów uwzględniającym oscylacje dipolarne wynikające z spójnego transferu polaryzacji i wpływu dyfuzji spin 1h57:
oznaczanie ilościowe 2− jonów HPO4 w minerale kostnym
przeprowadzono oznaczanie ilościowe jonów HPO42 obecnych w minerale kostnym. W tym celu kształt i szerokość linii poszczególnych sygnałów 31P NMR OH-I PO43-zawierających wewnętrzny rdzeń krystaliczny oraz H2o i HPO42-zawierających środowiska nieapatytyczne (amorficzna warstwa powierzchniowa), które zostały ujawnione na Fig. 4B, zostały wykorzystane do dopasowania ilościowego spektrum 31P single pulse (SP) mas ssNMR świeżej próbki tkanki kostnej 2-letniej owiec (Fig. 5A). Stwierdzono, że procent molowy jonów HPO42− i PO43-w minerale kostnym wynosi około 50/50 ± 5%. Jak sugerują nasze obserwacje na fig S9 i S10, obliczenia te zostały wykonane przy założeniu, że udział molowy jonów HPO42 w wewnętrznym jądrze krystalicznym cząstek był bliski 0%. Tak wysoki udział molowy jonów HPO42-obecnych w amorficznej warstwie powierzchniowej odzwierciedla niewielkie rozmiary cząsteczek mineralnych kości: ∼1-5 nm grubości, ∼10-40 nm szerokości i ∼20-100 nm długości1,61,62,63. Ponieważ wykazaliśmy, że jony HPO42 są skoncentrowane w amorficznej warstwie powierzchniowej, możemy teraz oszacować średnią grubość tej warstwy dla próbki tkanki kostnej owiec w wieku 2 lat. Tutaj rozważamy nanoskładkę o grubości 4,0 nm i zakładamy, że gęstości atomów fosforanów obecnych w sieci krystalicznej hydroksyapatytu i w amorficznej warstwie powierzchniowej są równoważne. W takim scenariuszu grubość wewnętrznego rdzenia krystalicznego wynosi około 2,4 nm (tj., co jest około dwukrotnie większe od sześciokątnej komórki jednostkowej hydroksyapatytu64 wzdłuż osi krystalograficznych a i b; a = b = 0,94 nm); podczas gdy grubość zewnętrznej amorficznej warstwy powierzchniowej można oszacować na około 0,8 nm (tj. co odpowiada wówczas wielkości sześciokątnej komórki jednostkowej hydroksyapatytu wzdłuż a i b, a zatem jest równoważne układaniu tylko dwóch jonów fosforanowych). Należy mieć świadomość, że są to wartości średnie, które odpowiadają sumie udziału wszystkich nieorganicznych jonów fosforanowych obecnych w naszej 2-letniej próbce tkanki kostnej owiec. Wyniki te mogą być różne dla starszych okazów, w których udział środowisk nieapatyckich może być mniejszy 65 z powodu dojrzewania minerałów kostnych: stopniowego przekształcania amorficznej warstwy powierzchniowej w środowiska apatyczne15. Niemniej jednak określona tutaj grubość warstwy powierzchniowej (0,8 nm) jest w dobrej zgodzie z szacowanymi rozmiarami zaproponowanymi w niektórych wcześniejszych badaniach: o wielkości jednej jednostki fosforanowej w mezokrystaliach fluoropatyt-żelatyna 66; i o 1-2 nm w syntetycznych hydroksyapatytach32, 67, 68.
oznaczanie jonów HPO42− i co32− obecnych w minerale kostnym. A) ilościowe spektrum 31P single pulse (SP) magic angle spinning (MAS) półprzewodnikowego jądrowego rezonansu magnetycznego (ssNMR) świeżej próbki tkanki kostnej 2-letniej owiec (Niebieska linia) i jej odpowiednie dopasowanie (czerwona linia przerywana) z dwoma pikami. Te dwa szczyty, których kształt i szerokość linii zostały ujawnione na Fig. 4B, odpowiadają PO43-zawierający wewnętrzny krystaliczny rdzeń w postaci hydroksyapatytu (pomarańczowy pik) i HPO42-zawierający nieapatyckie środowiska w postaci amorficznej warstwy powierzchniowej (fioletowy pik). (B) widmo transformaty Fouriera-podczerwień(FT-IR) trybu wibracji ν2 (CO3) dla próbki tkanki kostnej owiec w wieku 2 lat (Niebieska linia) i odpowiadającego jej dopasowania (czerwona linia przerywana). Jony CO32 typu B zajmują miejsca PO43 w sieci krystalicznej hydroksyapatytu; jony CO32 typu A zajmują miejsca OH w sieci krystalicznej hydroksyapatytu; natomiast NIEAPATYTYCZNE CO32-są obecne w amorficznej warstwie powierzchniowej pokrywającej cząstki mineralne kości.
Update on bone mineral chemical composition
wyniki przedstawione tutaj i w innych artykułach sugerują, że średni skład chemiczny dojrzałego minerału kości korowej zaproponowany przez Legrosa i wsp.27, Ca8.3□1,7(PO4)4.3(HPO4 lub CO3)1.7(OH lub ½ CO3) 0,3 ca 1.7, należy ponownie rozważyć. W istocie, wzór ten nie tylko nie uwzględnia obecności amorficznej warstwy powierzchniowej, której skład chemiczny znacznie różni się w odniesieniu do środowisk apatycznych obecnych w wewnętrznym krystalicznym rdzeniu cząstek, ale także nie docenia proporcji molowej jonów HPO42. Aby zaproponować aktualną formułę naszej próbki tkanki kostnej owiec w wieku 2 lat, musieliśmy najpierw określić proporcję wagową jonów CO32. Wartość 4,8% przy znacznym udziale węglanów typu B stwierdzono w analizach FT-IR 49 (Fig. 5B), co jest zgodne z wartościami znalezionymi dla innych próbek minerałów kostnych3. Ponadto rozważono następujące parametry: (i) cząstki muszą pozostać obojętne elektrycznie (zarówno wewnętrzny rdzeń krystaliczny, jak i amorficzna warstwa powierzchniowa); (ii) stosunek molowy jonów HPO42 w stosunku do całkowitej ilości nieorganicznych jonów fosforanowych jest ograniczony do 50% zgodnie z niniejszym badaniem; (iii) stopień nasycenia dwutlenkiem węgla powinien być zbliżony do wartości Doświadczalnej (4,8% w/w); (iv) ogólny stosunek molowy Ca/(P + C) powinien pozostać dopuszczalny dla próbki tkanki kostnej, i.e. w zakresie 1,2–1,53 i wreszcie (v) proporcja jonów węglanowych typu A, Typu B i nieapatytycznych obecnych w amorficznej warstwie powierzchniowej powinna pozostać zgodna z danymi FT-IR. Po połączeniu wszystkich tych ograniczeń średni skład chemiczny dojrzałego minerału kości korowej z naszej próbki tkanki kostnej owiec w wieku 2 lat może być przybliżony w następujący sposób: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Należy zauważyć, że ten średni skład chemiczny odpowiada wyłącznie naszej konkretnej próbce tkanki kostnej zgodnie z naszymi własnymi wynikami eksperymentalnymi. Dlatego też wzór ten nie jest uniwersalny, ponieważ zmienność występuje wśród okazów kości, w szczególności w zależności od gatunku, wieku, podaży pokarmu i stopnia ich dojrzewania.