wprowadzenie

rodzinna Lipomatoza Mnogia (FML, OMIM% 151,900) jest rzadkim autosomalnym dominującym zaburzeniem tkanki podskórnej charakteryzującym się rozwojem dobrze kapsułkowanych guzków podskórnych na kończynach i tułowiu.1 pierwsze doniesienia o wielu guzach adipocytowych zostały sporządzone od 1846 roku przez Sir Benjamina Brodiego.2 późniejsze wyniki Blaschko (1891) i Alsberg (1892) wykazały rodzinny nawrót zmian i zaobserwowano zwiększoną częstość występowania wśród mężczyzn.1,3,4 w kolejnych latach wielu innych autorów opublikowało rodziny o cechach wysoce sugerujących FML, 1,5,6 i wreszcie w 1970 Das Gupta sklasyfikował guzy lipomatozy w trzech kategoriach: samotne lub sporadyczne,FML i wielorakie symetryczne lipomatozy (MSL).7,8

pojedyncze tłuszczaki są uważane za najczęstszy łagodny nowotwór tkanek miękkich u dorosłych, ale liczne tłuszczaki występują u 5% osób.9,10 dokładna częstość występowania FML nie jest znana, ale oszacowano ją na 0,002%.8,11,12 początek wieku guzków wynosi od 30 do 40 lat, osiągając maksymalny szczyt w latach 50. 6,8,13,14 powszechnie uważa się, że zaburzenie to wykazuje preferencje dla mężczyzn, jednak duża liczba prac pokazuje, że obie płcie są jednakowo dotknięte.15-17 chociaż uważa się, że jest to choroba łagodna, u niektórych osób mogą pojawić się problemy kosmetyczne, pogarszające jakość ich życia. Ponadto występuje również u osób otyłych.9

do tej pory dostępne badania w FML były wyraźnie skoncentrowane na aspektach klinicznych, a kwestie molekularne zwykle nie są badane. Literatura sugeruje, że co najmniej 70% sporadycznych tłuszczaków jest wynikiem zmian cytogenetycznych obejmujących pasmo 12Q13-15, co może prowadzić do deregulacji ekspresji genu HMGA2 (High Mobility Group AT-hook 2). Gen ten koduje białka chromatyny niehistonowe odpowiedzialne za zmiany konformacyjne DNA, nieprawidłową proliferację komórek i rozwój łagodnych guzów mezenchymalnych.18-20

rozpoznanie molekularnej podstawy warunków genetycznych i wdrożenie wysokoprzepustowych technologii sekwencjonowania pozwoliło na zbadanie i Wyjaśnienie innych mechanizmów zaangażowanych w etiologię kilku genodermatoz. Dlatego badanie to miało na celu przeprowadzenie klinicznej i molekularnej charakterystyki siedmiu osób z FML w celu wykrycia wariantów w sześciu genach kandydujących związanych z lipomatozą przy użyciu technik Sanger i sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

materiały i metody

pacjenci i aspekty etyczne

badania przeprowadzono zgodnie z zasadami deklaracji Helsińskiej. Zatwierdzenie uzyskano od instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej przed badaniem (komitet etyki badań w FCM-UNICAMP, plik nr 1.313.164), a wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę. Badanie przeprowadziliśmy w ambulatorium służby Genetyki Medycznej w Szpitalu Klinicznym Uniwersytetu Campinas (HC-UNICAMP) w São Paulo w Brazylii. Uprawnionych było łącznie siedem osobników należących do pięciu niepowiązanych rodzin (nazwanych od A do E). Podstawowe kryteria włączenia do badania były następujące: i) wiek powyżej 18 lat, II) diagnostyka kliniczna i histopatologiczna tłuszczaka lub naczyniakomięśniaka oraz III) wznowa rodzinna sugerująca dziedziczenie autosomalne dominujące. Główne aspekty kliniczne zostały zebrane z dokumentacji medycznej przy użyciu ustrukturyzowanej formy. W ocenie fizykalnej uczestniczyli specjaliści dermatolodzy i genetycy. Zakład patologii HC-UNICAMP dostarczył próbki histopatologiczne. Wyniki badań klinicznych przedstawiono szczegółowo w tabeli 1.

Tabela 1 Podsumowanie kliniczne pacjentów z FML

sekwencjonowanie Sangera genu hmga2

genomowy dna wyekstrahowano z obwodowych próbek krwi EDTA siedmiu pacjentów zgodnie z konwencjonalną procedurą fenolowo-chloroformową stosowaną przez sambrooka i al21

przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). aby wzmocnić pięć kodujących eksonów i połączenia intron-ekson regionów Hmga2 gene. Korzystając z dwóch internetowych narzędzi bioinformatycznych, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) I OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), zaprojektowaliśmy konkretną parę starterów, jak podsumowano w tabeli 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) zgodnie z instrukcjami producenta. Chromatogramy zbadano za pomocą chromatografii V.2.6.5. Wyniki porównano z transkrypcją Hmga2 Enst00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Sprawdziliśmy nowe warianty w trzech publicznych zbiorach danych: i) Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) oraz iii) online Archive of Brazilian Mutations (http://abraom.ib.usp.br/). Do oceny wyników patogeniczności i efektów uszkodzeń nowych wariantów w kandydującym Genie HMGA2 wykorzystaliśmy różne modele predykcji in silico, takie jak VEP (Variant Effect Predictor),22 FATHMM (Functional Analysis Through Hidden Markov Models),23 UMD-predictor,24 SIFT (Sorting Nietolerant from Tolerant),25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer),26 i Mutation Taster.

docelowy Panel Wielogenowy

przeprowadzono panel niestandardowy w celu oceny genów zaangażowanych w lipomatozę zespołową. Aby wykonać tę technikę, otrzymaliśmy genomowe DNA z próbek śliny pięciu pacjentów (A, B, C, D i E) za pomocą zestawu do samodzielnej kolekcji DNA Oragene® (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Kanada). Próbki następnie wzbogacano i hybrydyzowano z sekwencjami specyficznymi dla celu. Przechwytywanie zostało wykonane przy użyciu sekwencera nowej generacji Illumina® MiSeq (TruSeq Capture) w trybie sparowania 150bp zgodnie ze standardowym protokołem dla tej platformy. Głębokość pokrycia regionów docelowych była wyższa niż 50x. wzbogacanie i analiza koncentrowały się na sekwencjach kodujących pięć transkryptów (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 i PTEN NM_000314.4), 10bp sekwencji intronicznych i innych regionów przypuszczalnie powodujących chorobę. Delecje egzoniczne, duplikacje i zmiany w miejscu splotu były również brane pod uwagę podczas badania. Odczyty zostały wyrównane i porównane z odniesieniem do ludzkiego genomu (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) został wybrany do walidacji wariantów, jak wspomniano przez Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

dostępność danych

została przekazana do Genbanku (numer dostępu: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Zbiory danych związane z tym artykułem są dostępne w Europejskim Instytucie bioinformatyki EMBL-EBI za pośrednictwem repozytorium ENA o numerze przystąpienia do badania PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

wyniki

analiza kliniczna

uwzględniono siedem osób z pięciu niepowiązanych rodzin (A, B1, B2, C, D1, D2 i E), jak przedstawiono na fig.1. Nie zidentyfikowaliśmy pokrewieństwa rodziców między uczestnikami. Pochodzenie etniczne było zgłaszane jako mieszane przez każdy proband. W ogólnym przeglądzie rodziny A i B miały trzy kolejne lub więcej pokoleń. Stosunek płci męskiej do żeńskiej oszacowano na 1: 6. Średni wiek włączenia wynosił 42 lata (SD 11, 8), podczas gdy średni wiek wystąpienia zmian wynosił 28 lat (SD 11, 8). Kobiety zgłaszały maksymalną częstość występowania guzków po ciąży. Klasycznymi cechami klinicznymi FML były miękkie guzki o bardzo zmiennej liczbie i wielkości, zlokalizowane w tłuszczu podskórnym i ograniczone do tułowia i kończyn, jak pokazano na fig. 2. Dyskomfort i wyraźna tkliwość dotykowa obserwowano tylko u osób z grupy A. współistniejące zaburzenia żołądkowo-jelitowe występowały u pacjentów z grupy A, C i D2. Zgłaszali zapalenie uchyłków i polipy, ciężkie przewlekłe zaparcia i raka jelita grubego. U czterech pacjentów przeprowadzono histologiczną ocenę zmian podskórnych. Obecność dojrzałych adipocytów zaokrąglonych przez liczne naczynia włosowate potwierdzona diagnostyka angiolipoma, o której wspominają Bancroft i Fletcher i wsp. 10,28 (fig. 2). Inne istotne wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Rysunek 1 Przegląd rodowodów rodzin badanych (A–E). Zauważ, jak kobiety i mężczyźni są równo zaangażowani i autosomalny dominujący wzór dziedziczenia z prawie dwoma kolejnymi pokoleniami dotkniętymi. Rodzina A miała największą liczbę pokoleń rozwijających się wielu tłuszczaków (a). Proband a (III 2) był jedynym w swojej grupie rodzinnej i w kazuistyce w bólu odsyłającym, gdy był badany (a). Strzałki wskazują probandy.

rycina 2 charakterystyka kliniczna FML i histopatologiczne aspekty tłuszczaków (plama he (10×). Podstawowe ustalenia obejmują miękkie, mobilne i ograniczają bezbolesne guzki, znajdujące się w tłuszczu podskórnym. Najczęstsze rozmieszczenie topograficzne obejmuje kończyny górne (A, B I D), przednią ścianę brzucha, plecy i uda (C). Tłuszczak zwykle przedstawia lobulowany wzór białych adipocytów z jednorodnymi jądrami i cienką włóknistą kapsułką (E). Angiolipomas składają się z dojrzałego tłuszczu w połączeniu z licznymi małymi naczyniami krwionośnymi, które są głównie kapilarami. Skrzepy fibrynowe (strzałki) występują bardzo często (F). Zdjęcie dzięki uprzejmości katedry patologii i Genetyki Medycznej, School of Medical Sciences, UNICAMP.

molekularne

sekwencjonowanie Sangera ujawniło dwa nowe warianty w eksonie 5 genu Hmga2. Oba warianty zostały zidentyfikowane u pacjentów A i B1. Pierwszy z nich był synonimicznym heterozygotycznym wariantem c. 327c>T P.(Asp=) uważany za niski wpływ lub neutralny, oparty na kilku narzędziach predykcyjnych (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). Natomiast drugą zmianą była nonsensowna zmiana heterozygotyczna wariantu c.328t>C (P.*110glnext*16), która powoduje podstawienie kodonu stop przez aminokwas glutaminy i późniejsze przedłużenie końcowego białka (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). 3 schematyzuje strukturę genu HMGA2, domeny wiążące białka i nowe warianty.

Rysunek 3 struktura ludzkiego genu HMGA2. (A) zlokalizowany na 12q14.3 gen HMGA2 obejmuje ponad 140 kb i obejmuje pięć eksonów. Ekson 1, 2 i 3 (niebieskie pola) koduje domenę at-hook (niebieskie kółka). Czwarty Egzon (liliowy) koduje dla obszaru spacerowego. Ekson 5 (pink box)koduje domenę C-końcowego białka 109 aminokwasów. B) Elektroferogram od pacjentów A, B1 i odniesienia. U tych pacjentów stwierdzono dwa identyczne nowe warianty. Synonimiczny wariant heterozygotyczny c. 327c>T (P. Asp=) i bezstopniowy wariant heterozygotyczny C.328t>C (P.*110glnext*16).

wariant c.328t>C (P.*110glnext*16) został zdefiniowany jako 100% patogenny lub duży wpływ zgodnie ze wspomnianymi algorytmami in silico. Jednakże system przewidywania mutacji wykazał rozbieżność między dwoma opisanymi wariantami, jak pokazano w tabeli 3. Ukierunkowany panel wielu genów AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA i PTEN w rodzinach A, B, C, D i E nie wykrywał szkodliwych zmian w ocenianych sekwencjach.

Tabela 3 warianty występujące u osób A i B1 oraz porównanie narzędzi predykcyjnych

dyskusja

obecne badanie ma na celu identyfikację molekularnych podstaw FML poprzez integrację nowoczesnych technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie Sangera i NGS w połączeniu z tradycyjnymi podejściami klinicznymi.

po wcześniejszych badaniach obecne badania wykazują pewne rozbieżności dotyczące danych epidemiologicznych. Zauważyliśmy, że istnieje powszechne błędne przekonanie dotyczące klasyfikacji i diagnozy różnych rodzajów lipomatozy.7,10,15 kilku autorów podkreśla, że mężczyźni mają dużą tendencję do występowania wielu tłuszczaków, 11, 29, 30 jednak nasze wyniki pokazują wyraźną wysoką częstotliwość FML u kobiet. Jest możliwe, że to stwierdzenie odzwierciedla jedynie stronniczość selekcji ze względu na niewielką wielkość próby, lub może być również wyjaśnione faktem, że kobiety są bardziej skłonne do szukania opieki medycznej ze względu na obawy kosmetyczne.Niemniej jednak rodowody wskazują, że odsetek osób dotkniętych chorobą u obu płci był podobny, co prowadzi do stosunku płciowego zbliżonego do 1:1 (10 mężczyzn vs 13 kobiet), co może lekceważyć faktyczną częstość występowania FML.6,8,16 co ciekawe, całkowita liczba tłuszczaków odnotowanych u kobiet była wyższa w porównaniu do unikalnego badanego mężczyzny.1,14

czynniki takie jak nadwaga i nasilony wzrost guzków podczas i po ciąży sugerują, że czynniki egzogenne (dieta), zmiany metaboliczne (dyslipidemia lub zmiany w desaturacji kwasów tłuszczowych) i mechanizmy hormonalne mogą być zaangażowane w rozrost adipocytów.32,33 Yee i wsp. porównali różnice w enzymatycznym desaturacji stearoilu-CoA między osobami z rzadkimi zaburzeniami tłuszczowymi (RAD) a otyłą grupą kontrolną i doszli do wniosku, że osoby z FML i otyłością wykazywały najwyższe wskaźniki desaturacji, zwiększając tym samym proces lipogenezy.32,34

nieoczekiwanym odkryciem było to, że pacjentka A jako jedyna w grupie kazuistycznej i jej rodzinie wykazywała ból, codzienne osłabienie, zmęczenie i współistniejącą chorobę psychiczną (przewlekłą depresję i zaburzenia lękowe). Objawy te są silnie związane z chorobą Dercuma, która jest uważana za diagnozę różnicową lub odmianę FML.W oparciu o nową klasyfikację choroby Dercuma zaproponowaną przez Hanssona i wsp. 36 zidentyfikowaliśmy u tego pacjenta uogólnioną postać guzkową, charakteryzującą się intensywnym bólem na powierzchni tkanki tłuszczowej i wokół tłuszczaków. Inne badanie, które potwierdza tę hipotezę, zostało opublikowane przez Campen et al37, opisali rodzinę dziewięciu członków z rozpoznaniem wielu tłuszczaków, którzy wykazywali zmienne objawy od całkowitej niepełnosprawności do bezobjawowych guzków. Można zatem przyjąć, że segregacja przebiega według autosomalnego dominującego wzorca ze zmienną ekspresją i ewentualnie stanowi skrajną manifestację FML.

Jeśli chodzi o diagnozę histopatologiczną, wykazaliśmy dwa główne typy: tłuszczak i angiolipoma. Mikroskopowo, najczęstszą zauważalną cechą angiolipoma jest proliferacja drobnych naczyń krwionośnych, które zawierają mikrotrombi fibryny w połączeniu z dojrzałymi adipocytami.10,28 Angiolipomas wydają się mieć wysoką częstość występowania u młodych dorosłych mężczyzn, którzy okazjonalnie przejawiają łagodny ból lub tkliwość. Ten typ nowotworu jest również związane z historią miejscowego urazu lub stosowania terapii steroidowej.13,38 chociaż wielu autorów uznaje obie diagnozy za odmienne byty patologiczne, niektóre opisy przypadków nie dokonują tego rozróżnienia ze względu na bardzo subtelne różnice między nimi.39 w tym kontekście nasza analiza potwierdza, że możliwe jest wystąpienie angiolipomaków z nawrotami rodzinnymi, a diagnoza ta może być częścią szerokiego spektrum FML.40-43 ponadto w kilku rodzinach odnotowano także liczne tłuszczaki z komórek wrzecionowatych, inny typ tłuszczaka.

Chociaż istnieje kilka badań skupionych na ekspresji i bezpośredniej analizie cytogenetycznej sporadycznych tłuszczaków, niewiele badań dotyczy konstytucyjnych przyczyn FML.2 rozległe serie tłuszczaków u dorosłych potwierdzają liczne zmiany strukturalne z częstością od 50 do 75%.10,28,45 wśród tych zrównoważonych zmian chromosomalnych, translokacja t (3; 12) (q27-28; q13-15) jest obserwowana w prawie 25% guzów.9 w większości przypadków punkt przerwania wpływa na gen HMGA2, który składa się z 5 eksonów i wytwarza białko zawierające 109 aminokwasów (rycina 3).18,46,47 Ligon i wsp. opisali przypadek ośmioletniego chłopca z rearanżacją konstytucyjną wpływającą na zespół 12q14.3 (de novo inwersja perycentryczna), z udziałem genu HMGA2. Jednak fenotyp kliniczny charakteryzujący się przerostem somatycznym, zaawansowaniem wieku kości i zębów, guzem móżdżku i mnogimi tłuszczakami, 48 różni się od naszego kazuistycznego.

analizowaliśmy heterozygotyczne warianty C. 327c>T P.(Asp=) i C.328t>C (P.*110glnext*16) eksonu 5 genu HMGA2 w różnych programach predykcyjnych. Synonimiczna lub cicha zmiana została zinterpretowana jako łagodna, natomiast zmiana w kodonie zatrzymania tłumaczenia została uznana za 100% patogenną lub dużą. W ten sposób może to wskazywać, że zmiany obejmujące region 3ʹ UTR (nieprzetłumaczony) spowodowałyby transformację nowotworową genu HMGA2.Fusco i wsp. podkreślili kluczową rolę genu HMGA2 w guzach mezenchymalnych. Zaproponowali oni, że w genie HMGA2 region 3ʹ UTR jest na ogół wyciszony przez Let-7 miRNA i każda zmiana na tym poziomie, albo obcinanie, albo fuzja z sekwencjami ektopowymi, prowadzi do jego regulacji, a w konsekwencji do nieprawidłowej replikacji komórek.46

zaskakujące jest to, że w rodzinie B wykryliśmy oba nowe warianty tylko u matki (B1). Może to wskazywać, że nie segregują się z fenotypem FML, odrzucając przynajmniej w tej rodzinie przyczynę etiologiczną. Z drugiej strony, pacjent a przedstawił te same dwa nowe warianty, ale wykazał fenotyp wysoce sugerujący chorobę Dercuma. Pomimo tych obiecujących ustaleń, są one nieco trudne do zinterpretowania, ponieważ nie można było ocenić innych krewnych dotkniętych FML.

ogniskowe nacieki tłuszczowe i liczne tłuszczaki mogą występować w kilku zespołach. Zespół proteusa i goździki (wrodzone asymetryczne przerost tkanki tłuszczowej, wady rozwojowe naczyń, znamiona naskórka, anomalie szkieletowe i rdzeniowe) są przykładami mutacji somatycznych, w których występuje lipomatoza.Z kolei zespół Bannayana-Rileya-Rubacalvy, wielorakie nowotwory endokrynologiczne typu 1, zespół Cowdena i zespół Gardnera są schorzeniami wynikającymi z mutacji linii płciowej, które mają współistniejącą lipomatozę.52-55 nawet niektóre mutacje związane z funkcją mitochondriów są związane z nieprawidłowym wzrostem tkanki tłuszczowej głównie w górnej części tułowia i szyi, a najlepszym przykładem jest choroba Madelunga.Jednak negatywny panel AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA i PTEN wyklucza, że są one odpowiedzialne za fenotyp FML, przynajmniej w tym badaniu.

wniosek

FML jest rzadką i niejednorodną chorobą, która może pokrywać się z innymi zespołami dermatologicznymi, takimi jak choroba Dercuma. Historia naturalna FML w tej serii ujawniła, że rozwój zmian był postępujący i osiągnął najwyższą częstość występowania u osób w średnim wieku. FML wpływał na obie płcie i wykazywał rozkład topograficzny z przewagą kończyn i tułowia. Stosunek płci wśród badanych pacjentów wykazywał występowanie kobiet, ale dane dotyczące rodowodu wykazały bardziej zrównoważony rozkład. Rozpoznanie choroby Dercuma rozpoznano również u jednej osoby (pacjent a).

molekularne podejście dostarczyło bardziej dogłębnego wglądu w genetyczne podstawy FML i podjęło próbę dokładnego zbadania największej liczby genów kandydujących z nim związanych. Podkreśliliśmy użyteczność NGS oprócz metody Sangera w zrozumieniu pełnego spektrum FML, ze względu na to, że może stanowić alternatywę dla identyfikacji etiologii i charakterystyki rzadkich warunków genetycznych w warunkach klinicznych. Warianty w eksonie 5 genu HMGA2 nie zostały opisane i do tej pory mają niepewne znaczenie w genezie FML. W celu lepszego określenia jego funkcji biologicznej w FML należy przeprowadzić dalsze badania, obejmujące większą liczbę osób dotkniętych chorobą oraz analizę funkcjonalną nowych wariantów genu HGMA2.