Experimental design and study system

in 2012 werden 300 zaden van snel cyclende Brassica rapa planten (Wisconsin Fast Plants Standard Seed, with high genetic variation) verkregen uit Carolina biologische voorraden, en gekweekt in een fytotron onder gestandaardiseerde bodem -, licht-en wateromstandigheden. Deze planten zijn volledig outcrossing (self incompatible) en Herbergen voldoende staande genetische variatie om gemakkelijk te reageren op selectie58,59. Van deze 300 planten werden 108 volledige sib-zaadfamilies gegenereerd door kunstmatige kruisingen (alleen zaadfamilies van kruisingen waar beide ouders vruchten produceerden werden gebruikt). Deze 108 volledige sib zaadfamilies werden gebruikt als de startpopulatie voor het experiment.

voor de eerste generatie van het experiment werden drie behandelingsgroepen vastgesteld met behulp van de 108 families, zodat elke familie in elke behandeling vertegenwoordigd was om het genotype onder de behandelingen onder controle te houden (aanvullende Fig. 1). Elke behandeling bestond daarom uit 108 planten (die 108 zaadfamilies vertegenwoordigen), die we onderverdeeld in drie replicaten (A,B, C) die elk 36 planten bevatten. De replicaten binnen de behandelingen werden gehouden als geïsoleerde lijnen gedurende 9 generaties (er werden geen kruisingen tussen replicaten gedaan) om onafhankelijke, herhaalbare evolutionaire veranderingen te kunnen beoordelen. De planten van alle replicaten in alle behandelingen werden geteeld in het phytotron onder gestandaardiseerde grond (Einheitserde classic), licht (24 uur licht) en bewatering omstandigheden. Alle planten werden elke tweede generatie fenotypeerd, te beginnen met Generatie 1. Floral geurgegevens van generaties 1 en 3 gingen verloren als gevolg van technische problemen; in plaats daarvan werd geurgegevens verzameld van generatie 4. Bloemengeurgegevens van generatie 1 werden na het einde van het experiment verkregen door planten van de beginnende generatie opnieuw te kweken en geur te verzamelen van één plant uit elk van de 108 zaadfamilies. Zo werden van de eerste generatie in totaal 108 planten (36 van elk replicaat) bemonsterd voor bloemengeur op hetzelfde moment als planten van Generatie 9.

experimentele behandelingen voor evolutie en bestuiving

in onze studie gebruikten we drie bestuivingsbehandelingen: hommels (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Zwitserland), zweefvliegen (‘HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Duitsland) en handbestuiving. Beide insecten bezoeken gemakkelijk bloemen van vele soorten Brassicaceae in de natuur, maar vertegenwoordigen verschillende functionele bestuiver categorieën, en zijn aangetoond dat ze in overvloed variëren in natuurlijke habitats46. Het gebruik van enkele bestuiversoorten bootst bestuiversomgevingen na waarin de meest voorkomende bestuivers functioneel verschillend zijn. Bij de controlebehandeling (“CO”) werden willekeurig gekozen planten met de hand gekruist.

de bestuiving vond plaats 23 dagen na het zaaien in een vliegkooi (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) in de kas onder gestandaardiseerde lichtomstandigheden met hommels en zweefvliegen. Experimenten werden uitgevoerd tussen 0900 uur en 1500 uur. Hommels werden in een aparte vliegkooi in de kas gehouden. Zweefvliegen werden aangekocht als poppen en gekweekt tot het uitkomen waarna mannelijke en vrouwelijke vliegen werden gescheiden. Bestuivers mochten foerageren op fast cycling B. rapa planten (planten van de controlegroep van de respectievelijke generatie) en gevoed met extra pollen tot 3 dagen voor de bestuiving behandeling; daarna werden alleen pollen en suikeroplossing verstrekt; 16 uur voor de bestuiving, bestuivers werden uitgehongerd.

voor de bestuiving werden alle planten van één replicaat willekeurig in een vierkant van 6 × 6 planten op een afstand van 20 cm van elkaar in de vliegkooi geplaatst. Vijf bestuivers werden afzonderlijk en opeenvolgend toegevoegd en elk insect mocht maximaal drie verschillende planten bezoeken en vervolgens uit de kooi worden verwijderd; elk insect werd slechts één keer gebruikt. In totaal kregen 12-15 planten per Replica een of meer bezoeken van bestuivers. Het totale gemiddelde (±s.d.) aantal bezoeken (bij bezochte planten) was 1,35±0,63 voor door hommels bestoven planten en 1,28±0,53 voor door zweefvliegen bestoven planten. Voor de planten die werden bezocht, werden het aantal bezoeken en het aantal bezochte bloemen geregistreerd. In de controlegroep werden 12 planten willekeurig gekozen per replicaat en 5 bloemen van elke plant werden met de hand bestoven door een willekeurig gekozen vaderplant; vaders werden gekozen uit dezelfde 12 planten. Elke plant kan stuifmeeldonor zijn aan meer dan één plant, maar kreeg slechts stuifmeel van één plant. Na de bestuiving werden bezochte bloemen gemarkeerd en werden planten nog eens 30 dagen in een kooi gehouden totdat de vruchten werden verzameld. Zaden werden geteld en relatieve zaadverzameling werd berekend voor elke plant door het individuele zaadverzameling te delen door het gemiddelde zaadverzameling in het replicaat. Bovendien werd voor elke bezochte plant het aantal zaden per vrucht berekend. Voor elke plant werd de mannelijke geschiktheid geschat op basis van het voorspelde vaderschap (aantal pollenexportgebeurtenissen).

van alle zaden die door de bestoven bloemen worden geproduceerd, werd een deelgroep van zaden gebruikt die representatief is voor de zaadproductie van elk individu om de volgende generatie te kweken. Hoe meer zaden een plant produceerde, hoe meer zaden het bijdroeg aan de volgende generatie, die opnieuw bestond uit 36 planten voor elk replicaat. De zaadbijdrage van elke bezochte plant in de volgende generatie werd berekend voor elk replicaat als: 36/(repliceer de som van de zaden/individuele set zaden). Waarden onder 0,5 werden naar boven afgerond op 1.

Inteeltdepressie

Inteeltdepressie gedurende het gehele experiment werd gekwantificeerd door het zaadgewicht en het kiempercentage te meten, dit laatste als percentage gekiemde zaden per replicaat. Om te controleren voor trait-veranderingen als gevolg van de inteelt depressie, zaden worden geproduceerd door planten van de 9e generatie werden geteeld (vertegenwoordiger van de 10e generatie) en handmatig gekruist tussen de duplo ‘ s binnen de behandelingen, zodat planten van elke repliceren waren stuifmeel van de donor en de pollen ontvanger voor het planten van twee verschillende replicaties (♀A-♂C, ♀B-♂A, ♀C-♂B). Kruisingen binnen deze combinaties van replicaten waren willekeurig. Van de resulterende zaden (de elfde generatie) werd één individu per zaadfamilie gekweekt (36 planten per Replica) onder dezelfde omstandigheden als tijdens het experiment. Van deze inter-replicate kruisingen werden eigenschappen opnieuw gemeten en gebruikt voor de uiteindelijke vergelijking van eigenschappen tussen behandelingsgroepen.

planteneigenschappen

De meeste eigenschappen, waaronder bloemgeur, werden gemeten vóór de bestuiving, 19-21 dagen na het zaaien. Bloemblaadbreedte, lengte, stamperlengte en bloemdiameter van drie willekeurig gekozen bloemen per plant werden gemeten met een Elektronische Schuifmaat (Digitale Schuifmaat 0-150 mm, TOOLCRAFT). Nectar van drie bloemen werd verzameld met 1 µl micro capillaire buizen (Blaubrand, Wertheim, Duitsland) en het volume bepaald door het meten van de lengte van de nectarkolom in de micropipet met een schuifmaat. Voor de kwantificering werd het gemiddelde van drie bloemen gebruikt. Voor 157 planten, gelijkmatig verdeeld over de behandelingen, werd het suikergehalte van de nectar bepaald met behulp van derivatisering en gaschromatografische analyse. Om dit te doen, werd nectar overgebracht naar filtreerpapier opgeslagen in silicagel. De sector op het filtreerpapier dat de nectar bevat, werd uit de rest van het filtreerpapier gesneden en de nectar werd geëlueerd in 1 ml Mili-Q-water met hoge zuiverheid door de verdunning gedurende 90 minuten met 400 rpm bij 60 °C op een laboratoriumschudapparaat te schudden. Daarna werd 50 µl van de oplossing gedroogd bij 60 °C en afgeleid met 100 µl van een mengsel van watervrij pyridine (Fisher Scientific, Geel, België), hexamethylsilazaan (Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland) en trimethylchlorosilaan (Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland) (10:5:3). Vervolgens werden de monsters uitgevoerd door GC-MS zoals beschreven in ref. 32. We hebben de totale suikerhoeveelheden per bloem en bloeiwijze berekend als de som van alle verschillende suikers (fructose, glucose, sucrose en sorbitol). De correlatie tussen het nectarsuikergehalte en het nectarvolume was positief en hoog (r156=0,732, P<0,001), zodat voor de overige planten alleen het nectarvolume werd bepaald. Floral scent collection werd gedaan voordat bioassays op een niet-destructieve manier van alle planten bloeiwijzen zodra ten minste vijf bloemen open waren. We gebruikten Headspace sorptie met een push-pull systeem59, 60. De bloeiwijzen van de planten waren ingesloten in glazen cilinders die eerder waren bekleed met sigmacote (Sigma-Aldrich) en afgesloten met een teflon plaat. Voor elke plant werd het aantal open bloemen geteld. Lucht uit de omgeving werd met een debiet van 100 ml min−1 Via geactiveerde koolfilters in de glazen cilinder geduwd. Tegelijkertijd werd lucht uit de glazen cilinder met een debiet van 150 ml min−1 getrokken door een glazen buis gevuld met ∼30 mg Tenax TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Lucht uit lege glazen cilinders werd verzameld als luchtregelaars. Florale vluchtige stoffen werden gedurende twee uur verzameld in een fytotron onder gestandaardiseerde licht-en temperatuuromstandigheden. De kwantificering van vluchtige stoffen werd uitgevoerd met behulp van gaschromatografie met mass selective detection (GC–MSD). Monsters werden geïnjecteerd in een GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) door een MultiPurpose Sampler (MPS; Gerstel, Müllheim, Duitsland) met behulp van een Gerstel thermal desorption unit (TDU; Gerstel) met een cold injection system (CIS; Gerstel). Voor thermodesorptie werd de TDU verwarmd van 30 tot 240 °C met een snelheid van 60 °C min-1 en op een eindtemperatuur gehouden gedurende 1 min. Het CIS werd ingesteld op -150 °C tijdens het vangen van elutingverbindingen uit het TDU. Voor injectie werd het CIS verwarmd tot 250 °C met een snelheid van 12 °C s-1, en de uiteindelijke temperatuur werd 3 minuten vastgehouden. De GC was uitgerust met een HP-5 kolom (0,25 mm diameter, 0,25 µm filmdikte, 15 m lengte), en helium werd gebruikt als draaggas met een debiet van 2 ml min−1. De samenstelling identificatie en kwantificering werden gedaan volgend op60 met het Agilent MSD ChemStation programma. De kwantificering van verbindingen werd verkregen door meting van piekgebieden van geselecteerde doelionen die specifiek zijn voor de afzonderlijke geurverbindingen. Specifieke doelionen werden verkregen uit synthetische standaarden voor alle verbindingen; piekgebieden werden omgezet in absolute hoeveelheden met behulp van kalibratiekrommen die eerder voor elke verbinding werden verkregen met behulp van synthetische verbindingen in drie verschillende concentraties. Alleen geurverbindingen die in aanzienlijk hogere hoeveelheden aanwezig waren dan in de luchtcontrole werden in de analyse opgenomen (in totaal 14 geurverbindingen). Alle hoeveelheden vluchtige stoffen werden berekend in pg per bloem L-1 bemonsterde lucht.

drieëntwintig dagen na het zaaien, op dezelfde dag als de bestuiving, werden het aantal open bloemen en de hoogte van elke plant geregistreerd. Na bestuiving (maar op dezelfde dag) werden de kleurreflectiespectra van drie bloemblaadjes van verschillende niet-vervuilde (indien mogelijk) bloemen per plant geregistreerd met behulp van een fiberoptische spectrofotometer (AvaSpec-2048).; Avantes, Apeldoorn, Nederland) en een xenon gepulste lichtbron (AvaLight-XE; Avantes). Een blaadje per keer werd onder de spectrofotometer geplaatst (specifiek gericht op het distale deel van het blaadje) en het percentage reflectie (ten opzichte van een witte standaard) tussen 200 en 900 nm elke 0,6 nm werd geregistreerd in de transmissiemodus. Van het gemeten spectrum werd bij de analyse alleen het gemiddelde van de reflectiewaarden per 10 nm van 260 tot 650 nm van de drie bloemblaadjes gebruikt. In planten van de elfde generatie werd een subgroep van ca 20 planten per replicaat geanalyseerd op kleur, omdat geen van de kleur-PCs tijdens het experiment onder selectie bleek te staan. Het oppervlak van het ultraviolet absorberende en reflecterende oppervlak van de bloemblaadjes werd alleen gemeten in plant van Generatie 11 met een ultraviolet-gevoelige digitale camera met kwartslens. Foto ‘ s van bloemen werden genomen en het ultraviolet absorberend gebied werd gekwantificeerd met behulp van het softwarepakket ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/).

bestuivervoorkeuren

tests voor bestuivervoorkeuren werden uitgevoerd voor elk replicaat met beide soorten bestuivers. Voor elk replicaat werden twee gedragstesten uitgevoerd (één voor elke bestuiver-behandeling). Hommel-en Zweefvlieg-bestoven planten (Generatie 11) van elk replicaat werden willekeurig gekoppeld en naast elkaar geplaatst (ca 30 cm afstand) in een vliegkooi (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Eén bestuiver werd in de kooi geplaatst en mocht één plant bezoeken. Bestuivers werden meteen gevangen nadat ze hun keuze hadden gemaakt. Elk plantenpaar werd onderzocht met één bestuiver.

Zelfcompatibiliteit en autonome zelftoepassing

om zelfcompatibiliteit te testen, kweekten we planten van de eerste (15 planten per replicaat) en de elfde generatie (30 planten per replicaat). Eén zaad per zaadfamilie (uit willekeurig gekozen families) werd gekweekt en twee bloemen per plant Zelfgemaakt tijdens anthesis. Het gemiddelde aantal geproduceerde zaden per zelfgemaakte bloem voor elke individuele plant werd gebruikt als een meting van de zelfcompatibiliteit.

om te testen op autonome zelfvorming, kweekten we ca 12 planten (één zaad per familie) per replicatie van elke behandeling van Generatie 11 en 1 (in totaal 162 planten). Na 30 dagen wanneer ongeveer 20 bloemen waren geopend, werden de resterende knoppen in elke plant zorgvuldig gesneden en werd het aantal geopende bloemen geregistreerd. De plant mocht vervolgens vruchten ontwikkelen zonder dat er insecten bij de planten kwamen. Na het rijpen van de vruchten werden zaden verzameld en het aantal zaden werd geteld en gewogen voor elke plant. Het aantal vruchten per open bloem en zaad per vrucht werd gebruikt als een meting voor autonoom self-maken. Omdat een paar planten een zeer hoog aantal vruchten per open bloemen hadden, hebben we deze uitschieters verwijderd voor de uiteindelijke vergelijking van autonome zelfvorming. Het volgende aantal uitschieters werd geschrapt: 1 in Generatie 1; in G11: 2 in BB, 3 in HF, 2 in CO.

statistische analyse

om fenotypische selectie te analyseren, werden selectieverschillen en gradiënten berekend door de geschiktheid van de plant te regresseren op Eigenschappen 61. Deze analyse werd afzonderlijk gedaan voor de behandelingen, maar voor alle replicaten en generaties gecombineerd. Als geschiktheidsschatting werd ‘aantal bezoeken’ gebruikt, wat een telvariabele was en een Poissonverdeling volgde. Een andere fitness variabele, ‘relative seed set’ had een distibution beïnvloed door de vele nulwaarden; bovendien miste seed set het enige mannelijke fitnesscomponent van de eerste bezochte plant, die geen zaad uit dit bezoek plaatste (omdat bestuivers aanvankelijk geen Brassica pollen droegen). Het aantal bezoeken was echter sterk gecorreleerd met de relatieve seed set (BB: r626=0,694, P<0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Gegeneraliseerde lineaire modellen (met Poisson distributie) werden gebruikt om selectiegradiënten (multivariate) en differentiëlen (univariate) te berekenen voor elke behandeling met het aantal bezoeken als afhankelijke variabele en eigenschappen als covariaten. Daarnaast werden kwadratische selectiegradiënten berekend met alle eigenschappen en de kwadratische term van elke eigenschap toegevoegd aan het model, en vervolgens verdubbelde gradiënten62. Om verschillen in selectie tussen hommels en zweefvliegen na te gaan, werd een veralgemeend lineair model (met poissondistributie) uitgevoerd met het aantal bezoeken als afhankelijke variabele, behandeling als vaste factor, planteneigenschappen als covarianten en de interactie behandeling*planteneigenschappen. Voor de selectieanalyse werden alle variabelen gestandaardiseerd op mean = 0 en s. d. = 1 (Z-waarden) op het replicaatniveau. Een gegeneraliseerd lineair model werd ook gebruikt om visitatiesnelheden te vergelijken tussen hommel – en Zweefvlieg bestoven planten over alle generaties heen. De waarden van de bloemkleurspectrofotometer werden verlaagd door analyse van hoofdcomponenten (PC) met Varimax-rotatie. Alleen PC ‘ s met een eigenwaarde boven één werden gebruikt in de analyse.

evolutionaire verandering in planteneigenschappen werd beoordeeld in planten van de 11e generatie met behulp van multivariate linear discriminant function analysis en univariate general linear models (GLM). Voor GLM werd elke eigenschap gebruikt als de afhankelijke variabele, repliceren als willekeurige factor en behandeling als vaste factor met LSD post-hoc test. Om de impact van natuurlijke selectie te onderscheiden van drift, hebben we onderzocht of verschillen in eigenschappen consistent waren tussen replicaten van een bepaalde bestuivingsbehandeling. In de GLM-analyse wijst een significant ‘behandelingseffect’ op het karakteristieke verschil tussen verschillende bestuivergroepen over alle replicaten, en discrimineert zo bestuiver-specifieke evolutie van drift. Drift zou worden aangegeven door evolutionaire veranderingen in sommige (willekeurige) replicaten alleen, aangegeven door een significantie in de factor “repliceren” of interactie tussen “repliceren” en “behandeling”. Ook de zelfcompatibiliteit en de autonome zelftoepassing werden door GLM beoordeeld, maar de waarden van de eerste generatie-installaties werden in de analyse meegenomen. Voor de analyses van vluchtige stoffen en nectarvolume werden de gegevens ln(1+x) getransformeerd om de normale verdeling te benaderen. Voor de GLM met de kleurvariabelen werd een PC-analyse uitgevoerd zoals hierboven beschreven, maar zonder voorafgaande standaardisatie van de variabelen. De PC-analyse werd uitgevoerd voor alle behandelingen, replicaten en alle generaties samen, wat resulteerde in vier pc ‘ s die 96,9% van de totale variantie verklaren. De frequentie van nectarloze bloemen werd voor elke generatie afzonderlijk geanalyseerd, door gebruik te maken van gegeneraliseerde lineaire modellen met bimodale distributie, met ‘aanwezigheid van nectar’ (ja/nee) als de afhankelijke variabele, en behandeling en repliceren als factoren. Eigenschappen in nectariferous en nectarless bloemen werden vergeleken voor de negende en elfde generatie, door gebruik te maken van algemene lineaire modellen met de eigenschap als de afhankelijke variabele, en ‘aanwezigheid van nectar’ en behandeling als vaste factoren. De voorkeuren voor de eerste keuze van hommels en zweefvliegen werden geanalyseerd door middel van een binomiale test (Test-prop = 0,5; alle duplicaten samengevoegd). Correlaties tussen nectar en planteneigenschappen werden berekend voor alle generaties gecombineerd met Pearson product-moment correlaties met ln-getransformeerde waarden. Statistieken werden uitgevoerd met IMB SPSS-statistieken (versie 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

beschikbaarheid van gegevens