experimenteel ontwerp en monsterverzameling

Het experiment werd opgezet in 1982 in Mengcheng county, Anhui Provincie, China (33° 13′ N, 116° 35′ E, 42 m hoogte) met typische kalkbeton zwarte grond. De jaarlijkse temperatuur is 14.8 °C en de jaarlijkse neerslag is 872 mm. Vijf bevruchting behandelingen met tarwe-soja vruchtwisseling werden vergeleken in een volledig randomized block design met vier duplo ‘ s (elk perceel is 70 m2) : (1) controle, niet-bemesting; (2) NPK -, NPK-chemische meststoffen bestaande uit ureum (180 kg N ha−1 jaar−1), superfosfaat (90 kg P2O5 ha−1 jaar−1) en kaliumchloride (86 kg K2O ha− 1 j−1); (3) NPK + WS, NPK kunstmest plus 7500 kg tarwe stro ha−1 jaar−1; (4) NPK + PM, NPK kunstmest plus van 15.000 kg verse mest ha−1 jaar−1; (5) NPK + CM, NPK chemische meststoffen plus 30.000 kg verse koemest ha−1 jaar−1. In de NPK + WS-behandeling werd al het tarwestro terug naar het veld gebracht, de varkensmest in de NPK + PM-behandeling en de koemest in de NPK + CM hadden dezelfde hoeveelheid organische koolstof met het toegevoegde tarwestro. Bovendien hebben deze contrasterende soorten meststoffen die deel uitmaken van onze bemestingsbehandelingen verschillende niveaus van beschikbaarheid voor planten en microben, bijvoorbeeld van labieler (varkensmest) tot meer recalcitrant (tarwestro en koemest). We gebruikten een breed scala aan bevruchtingsbehandelingen om onze resultaten representatief te maken en toepasbaar te maken op contrasterende managementpraktijken.

we groeven rond de tarwegroep (met 30 tot 40 tarweplanten tijdens de tarwevulling op 20 April 2017) om de wortelsystemen zo intact mogelijk te houden. De bodem van de wortelzone die stevig aan de wortels vastzat, werd vervolgens geborsteld. Tegelijkertijd werd de bovengrond (0-15 cm diep) verzameld als bulkgrond met behulp van een vijzelkern (ongeveer 20 cm van de planten verwijderd). De verzamelde grond werd gezeefd door een 2 mm gaas om onzuiverheden zoals wortels en stenen te verwijderen. Een deel van de bodem werd opgeslagen bij 4 °C voor chemische analyses, en de rest werd opgeslagen bij − 40 °C voor DNA-extractie.

bodemfysicochemische analyse

een pH-meter (FE20 Fiveasy™, Mettler Toledo, Duitsland) werd gebruikt om de pH van de bodem te meten bij een bodem/gedestilleerd waterverhouding van 1:5 (gewicht / volume). Het vochtgehalte van de grond werd gravimetrisch bepaald door 5 g verse grond bij ongeveer 105-108 °C te drogen om een constant gewicht te bereiken en vervolgens de gewichtsverhouding te berekenen (verdampt water tot gedroogde grond). Het totale koolstofgehalte (TC) en het totale stikstofgehalte (TN) van de bodem werden bepaald door verbranding van luchtgedroogde grond met behulp van een CNS-2000 analyzer (LECO, St.Joseph, MI, USA), na het zeven van de bodem door een 0,15 mm Maas. Het totale fosforgehalte (TP) en het totale kaliumgehalte (TK) van de bodem werden geëxtraheerd na de vertering van HF-HClO4 en gemeten met respectievelijk de molybdeenblauwmethode en de vlamspectrofotometriemethode (FP640, Inasa, China). Opgeloste organische koolstof (DOC) werd geëxtraheerd door 50 mL gedestilleerd water toe te voegen aan 5 g verse grond, gedurende 1 uur te schudden en vacuüm te filteren door een G4 glasvezelfilter met een porieruimte van 1,2 µm (Fisher), en vervolgens werd het koolstofgehalte in de extracten bepaald door een totale organische koolstofanalysator (multi N/C 3000, Analytik Jena, Duitsland). Nitraat (NO3-N), ammonium (NH4+-n) en opgeloste totale stikstof (DTN) werden geëxtraheerd in een verhouding van 5 g verse grond tot 50 mL 2 M KCl. Na 1 uur shacken werden de extracten gefilterd door een G4 glasvezelfilter met een porieruimte van 1,2 µm( Fisher), en vervolgens werd een continuous flow analytisch systeem (San++ system, Skalar, Holland) gebruikt om de inhoud van NO3-N, NH4+ – N en DTN te analyseren. Opgeloste organische stikstof (DON) werd berekend met behulp van de volgende formule: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. de beschikbare fosfor (AP) in de bodem werd geëxtraheerd met 0.5 M NaHCO3 en bepaald met behulp van de molybdeenblauwmethode. Beschikbaar kalium (AK) werd geëxtraheerd met 1 M ammoniumacetaat en bepaald met vlamfotometer (FP640, Inasa, China) (aanvullend dossier 3: aanhangsel 1).

bepaling van stikstoffixatiesnelheden

De 15n2-etiketteringsmethode is een van de meest gebruikte en meest gebruikte methoden voor het meten van n-fixatiesnelheden . Vijf gram aarde werd geplaatst in 18 × 150 mm Balch buizen, en de kopruimte werd vervangen door synthetische lucht met 80% 15N2 en 20% O2. De controles werden gevuld met niet gelabeld N2-gas en parallel verwerkt. De buizen werden horizontaal in het donker bij kamertemperatuur gedurende 22 dagen geïncubeerd. Het atoom % 15N van bodemmonsters werd bepaald met behulp van een stabiele isotopenverhouding massaspectrometer (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Duitsland). Vervolgens hebben we de netto potentiële n-fixatiesnelheid berekend door het verschil van totaal 15N in bodems die 15N2 ontvangen ten opzichte van de controle te vergelijken.

high-throughput sequencing en bioinformatic analysis

voor de DNA-extractie, 0.5 g verse grond werd gebruikt met de Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). De genen van nifH werden versterkt met primerparen nifH-F/nifH-R (5 ‘- AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′) / (5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’). PCR reacties werden uitgevoerd in een 20 µL reactie met 4 µL van 5 × FastPfu buffer, 2 µL van 2,5 mM dNTPs, 0,8 µL van 5 µM forward primer, 0,8 µL van 5 µM reverse primer, 0,4 µL van Fastpfu Polymerase, 10 ng van template DNA, en dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Versterking werd uitgevoerd bij 95 °C gedurende 3 min, met 35 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s, en 72 °C gedurende 45 s, en verlenging bij 72 °C gedurende 10 min. PCR amplicons werden gezuiverd door Agarose Gel DNA zuivering kit (TaKaRa Bio), en drievoudige PCR versterkingen voor elk monster werden uitgevoerd en samengevoegd als een PCR product en vervolgens gerangschikt op het platform van Illumina MiSeq PE300 (Majorbio bedrijf in Shanghai, China). Na het sequencen werden de nifh nucleotidesequenties geanalyseerd met behulp van de qiime-1.9.1 pijplijn (http://qiime.sourceforge.net/) . Ten eerste werden de sequenties van lage kwaliteit (die met een kwaliteitsscore < 20, die dubbelzinnige nucleotiden bevatten of niet overeenkomen met de primer en barcode) verwijderd en werden de resterende sequenties verder omgezet in aminozuursequenties met behulp van de FunGene pijpleiding van het Ribosomal Database Project . De opeenvolgingen die proteã NEN coderen die niet overeenkwamen met de eiwitopeenvolging van nifH of die beëindigingscodon bevatten werden verworpen. De resterende opeenvolgingen werden tegen het nifH-gengegevensbestand afgestemd , die zowel de ontbroken als chimeric opeenvolgingen verwijderen. De resterende opeenvolgingen van hoge kwaliteit werden geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTUs) bij 95% gelijkenis met UCLUST die in de novo wijze lopen, en alle Singleton OTUs werden geschrapt.

Co-occurrence network analysis

we construeerden een co-occurrence netwerk met alle monsters (rhizosfeer en bulk bodem) en identificeerden de belangrijkste ecologische clusters van sterk geassocieerde OTUs. De top OTUs, goed voor meer dan 80% van de relatieve overvloed in de totale gemeenschap, werd gekozen . Alle pair-wised Spearman correlaties tussen OTUs werden berekend, en de correlaties met een Spearman ‘ s coëfficiënt van minder dan 0,65 en een P waarde van meer dan 0,01, werden verwijderd. Dit stelde ons in staat om ons alleen te concentreren op de OTUs die sterk co-optrad en die meer kans hadden om met elkaar te interageren. De belangrijkste modules (ecologische clusters) in het netwerk werden gevisualiseerd met behulp van Gephi (https://gephi.org/). De relatieve abundantie van elke ecologische cluster werd berekend door middel van het gemiddelde van de gestandaardiseerde relatieve abundanties (Z-score) van de soorten die tot de cluster behoorden (aanvullend bestand 3: Bijlage 3).

statistische analyse

ANOVA en paarsgewijze t-tests werden gebruikt om de bodemvariabelen, dominante microbiële taxa en de microbiële alfadiversiteit tussen verschillende bemestingsbehandelingen te vergelijken (aanvullend dossier 3: Bijlage 1). Deze tests werden uitgevoerd met behulp van SPSS 21. De Mantel test werd gebruikt om de correlaties tussen de diazotrofe gemeenschap en fysisch-chemische eigenschappen te analyseren (aanvullend dossier 3: Bijlage 2). Dit werd uitgevoerd met behulp van het” veganistische ” pakket in R × 32 (3.2.2). Een principal coordinate analysis (PCoA) werd gebruikt om significante verschillen in diazotrofe gemeenschappen tussen steekproefgroepen te vinden (aanvullend dossier 3: Bijlage 2). De PCoA werd uitgevoerd met behulp van het” labdsv”pakket R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

fylogenetische analyses

het nifh-gen biedt voldoende fylogenetische resolutie in ecologische studies. De fylogenetische boom voor de 481 dominante diazotrofe phylotypen in de ecologische clusters werd gebouwd met behulp van FastTree, en gevisualiseerd met behulp van GraPhlAn . De phylogenetic bemonsteringstheorie kan analytisch worden aangewend (uitgaande van de willekeurige bemonstering van de phylogenetic boom als de voorspelde phylogenetic diversiteit in een lokale gemeenschap en dan het vergelijken van de waargenomen phylogenetic diversiteit met die voorspellingen) om de mate te bepalen waaraan de diazotrophic gemeenschap willekeurig (tussen − 2 en + 2), over-verspreid (boven + 2), of geclusterd (onder − 2) lijkt. Phylogenetic sampling theory werd uitgevoerd met behulp van het R-pakket “picante”. Een voordeel van willekeurig steekproef de regionale phylogenetic boom is dat het kan worden gebruikt om steekproeven van ongelijke grootte te vergelijken die op het binomial steekproefmodel worden gebaseerd . De verschillen tussen waargenomen en verwachte fylogenetische diversiteit werden bepaald door het berekenen en vergelijken van z-scores voor elke ecologische cluster. Wanneer de waargenomen phylogenetic diversiteit minder is dan de verwachte diversiteit (onder − 2), wordt de microbiële gemeenschap in de ecologische cluster beschouwd om phylogenetically geclusterd te zijn, wat betekent dat de nauw verwante taxa waarschijnlijker zullen worden bemonsterd en actief door het milieu worden geselecteerd .

Structural equation modeling analysis

De SEM werd uitgevoerd met behulp van IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Het werd gebruikt om de directe en indirecte effecten van de fysisch-chemische eigenschappen van de bodem en de relatieve abundantie van de belangrijkste ecologische clusters op de n-fixatiesnelheden te evalueren. De fysiochemische eigenschappen van de bodem omvatten bodem pH, totaal koolstof, totaal stikstof en totaal fosfor. In het model waren de behandelingen (control, NPK, NPK + WS, NPK + PM en NPK + CM) categorische variabelen met twee niveaus: 1 (een bepaalde behandeling) en 0 (de overige beschouwde behandelingen). Daarnaast werd bootstrapping gebruikt om de waarschijnlijkheid te testen dat Path coëfficiënten verschilden van nul, omdat een paar van de variabelen normaal niet verdeeld waren. We berekenden ook de gestandaardiseerde totale effecten (Stes) van de bodemeigenschappen, bemestingsbehandelingen en rhizosfeer-effect op de n-fixatiesnelheid om de interpretatie van de SEM te helpen.

Random Forest modeling analysis

Random Forest regressie (R pakket “randomForest”) werd gebruikt om de genormaliseerde OTUs in verschillende behandelingen regresseren. De 10-voudige kruisvalidatiemethode werd gebruikt om de optimale set OTUs te bepalen die gecorreleerd is aan de n-fixatiesnelheden . Gerangschikt lijsten van OTUs in volgorde van Random Forests gerapporteerde feature importance scores werden bereikt op basis van de toename in gemiddelde kwadraatfout van stikstoffixatiesnelheden voorspeld over 100 iteraties van het algoritme. De 50-marker OTUs werden gekozen op basis van de minimale gemiddelde kruisvalidatiemean-kwadraatfouten, die werden verkregen uit vijf onderzoeken met de 10-voudige kruisvalidatie.