klinisch en moleculair onderzoek van familiale multipele lipomatose: varianten in het Hmga2-Gen
introductie
familiale multipele lipomatose (FML, OMIM% 151.900) is een zeldzame autosomaal dominante aandoening van hypodermis die wordt gekarakteriseerd door de ontwikkeling van goed ingekapselde subcutane knobbeltjes op de extremiteiten en de romp.1 De eerste rapporten van veelvoudige adipocytic tumors werden gemaakt sinds 1846 door Sir Benjamin Brodie.2 latere resultaten van Blaschko (1891), en Alsberg (1892) toonden een familiale herhaling van de laesies en waargenomen een verhoogde incidentie bij mannen.In de daaropvolgende jaren publiceerden veel andere auteurs families met kenmerken die sterk suggestief waren voor FML, 1, 5, 6 en tenslotte classificeerde Das Gupta in 1970 lipomateuze tumoren in drie categorieën: solitair of sporadisch, FML en Multiple Symmetric Lipomatosis (MSL).7,8
Solitaire lipomen worden beschouwd als het meest voorkomende goedaardige neoplasma van zachte weefsels bij volwassenen, maar meerdere lipomen komen voor bij 5% van de individuen.De exacte prevalentie van FML is onbekend, maar wordt geschat op 0,002%.8,11,12 leeftijd-begin van knobbeltjes is tussen 30 en 40 jaar, het bereiken van de maximale piek bij de jaren ‘ 50.6,8,13,14 het is algemeen aangenomen dat deze aandoening vertonen een voorkeur voor mannen, echter, een groot aantal werken aantonen dat beide geslachten even worden beïnvloed.15-17 hoewel het wordt beschouwd als een goedaardige ziekte, cosmetische zorgen kunnen verschijnen in sommige individuen, afbreuk doen aan hun kwaliteit van leven. Bovendien is het ook overwegend bij zwaarlijvige individuen.9
tot nu toe is het beschikbare onderzoek in FML expliciet gericht op klinische aspecten, en worden moleculaire kwesties meestal niet onderzocht. De literatuur suggereert dat ten minste 70% van de sporadische lipomen het resultaat zijn van cytogenetische herschikkingen waarbij de 12q13-15 band betrokken is, wat kan leiden tot een gedereguleerde expressie van het hmga2 (High Mobility Group AT-hook 2) gen. Dit gen codeert niet-histones chromatine proteã nen verantwoordelijk voor de conformational veranderingen van DNA, afwijkende celproliferatie, en ontwikkeling van goedaardige mesenchymal tumors.18-20
De erkenning van de moleculaire basis van genetische aandoeningen en de toepassing van high-throughput sequencing technologieën heeft het mogelijk gemaakt om andere mechanismen die betrokken zijn bij de etiologie van verschillende genodermatosis te onderzoeken en te verduidelijken. Daarom was deze studie gericht op het uitvoeren van een klinische en moleculaire karakterisatie van zeven individuen met FML om varianten in zes kandidaatgenen met betrekking tot lipomatose te ontdekken met behulp van sanger en next-generation sequencing (NGS) technieken.
materialen en methoden
patiënten en ethische aspecten
Dit onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. Goedkeuring werd verkregen van de Institutional Review Board voor de studie (De Research Ethics Committee van FCM-UNICAMP, file n° 1.313.164) en alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming. We hebben de studie uitgevoerd in de polikliniek van de medische genetica service in het Klinisch Ziekenhuis van de Universiteit van Campinas (HC-UNICAMP) in São Paulo, Brazilië. Een totaal van zeven individuen behorend tot vijf niet-verwante families (genoemd van A tot en met E) kwamen in aanmerking. De primaire inclusiecriteria voor de selectie van de proefpersonen waren: i) leeftijd boven 18 jaar, ii) klinische en histopathologische diagnose van lipoom of angiolipoom en iii) familiaire recidief die autosomaal dominante overerving suggereert. De belangrijkste klinische aspecten werden verzameld uit medische dossiers met behulp van een gestructureerde vorm. Fysieke beoordeling omvatte de deelname van zowel dermatoloog en geneticus specialiteiten. De afdeling pathologie van HC-UNICAMP leverde de histopathologische monsters. De klinische bevindingen worden gedetailleerd weergegeven in Tabel 1.
 |
Tabel 1 Klinische gegevens van de Patiënten met een FML |
Sanger Sequencing van de HMGA2 Gen
Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit de perifere EDTA-bloedmonsters van zeven patiënten volgens de conventionele fenol-chloroform-procedure die wordt gebruikt door Sambrook et al21
Een polymerase chain reaction (PCR) werd uitgevoerd in het versterken van vijf coderende exonen en intron-exon kruispunten regio ‘ s van de HMGA2 gen. Met behulp van twee online bioinformatische tools, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm), en OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), ontwierpen we het specifieke paar primers, zoals samengevat in Tabel 2.
 |
Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR |
PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) volgens de instructies van de fabrikant. Chromatogrammen werden onderzocht met behulp van chromen v. 2. 6.5. De resultaten werden vergeleken met Hmga2 Ensembl transcript number ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). We hebben de nieuwe varianten in drie openbare datasets gecontroleerd: i) the Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) The Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) en iii) Online Archive of Brazilian Mutations (http://abraom.ib.usp.br/). Om de pathogeniteitsscores en schade-effecten van nieuwe varianten in kandidaat hmga2 gen te evalueren, hebben we verschillende gebruikt in silico voorspellingsmodellen zoals VEP (Variant Effect Predictor),22 FATHMM (Functional Analysis Through Hidden Markov Models), 23 UMD-voorspeller,24 zift (Sorting Intolerant from Tolerant),25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), 26 en Mutatieproever.
Target Multi-Gen Panel
een aangepast panel werd uitgevoerd om de genen te beoordelen die betrokken zijn bij Syndrome lipomatose. Om deze techniek uit te voeren, verkregen we genomisch DNA van speeksel specimens van vijf patiënten (A, B, C, D en E) met behulp van de Oragene® DNA zelf-collectie kit (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Canada). De steekproeven werden toen verrijkt en gekruist tegen doel-specifieke opeenvolgingen. De opname werd gedaan met behulp van de volgende generatie Illumina ® MiSeq (TruSeq Capture) sequencer in 150bp gepaarde-end modus volgens het standaard protocol voor dit platform. De diepte van dekking van doelgebieden was hoger dan 50x. de verrijking en de analyse werden geconcentreerd op de codageopeenvolgingen van vijf transcripten (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2, en PTEN NM_000314.4), 10bp van intronische sequenties en andere regio ‘ s vermoedelijk veroorzakend van ziekte. Bij het onderzoek werd ook rekening gehouden met exonische schrappingen, duplicaties en variaties op de splice-site. Reads werden uitgelijnd en vergeleken met human genome reference (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) werd gekozen om varianten te valideren zoals vermeld door Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).
beschikbaarheid van gegevens
sequenties werden ingediend bij GenBank (toetredingsnummer: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Datasets met betrekking tot dit artikel zijn beschikbaar bij het European Bioinformatics Institute EMBL-EBI via ENA repository met study accession number PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).
resultaten
klinische analyse
zeven personen uit vijf niet-verwante families (A, B1, B2, C, D1, D2 en E) werden opgenomen, zoals afgebeeld in Figuur 1. We hebben geen ouderlijke verwantschap tussen de deelnemers geïdentificeerd. Etnische afkomst werd zelf gemeld als gemengd door elke proband. In een algemeen overzicht, families A en B werden waargenomen drie opeenvolgende of meer generaties betrokken. De verhouding tussen man en vrouw werd geschat in 1: 6. De gemiddelde leeftijd bij inclusie was 42 jaar (SD 11,8), terwijl de gemiddelde leeftijd voor het ontstaan van laesies 28 jaar was (SD 11,8). Vrouwen meldden een piekincidentie van knobbeltjes na hun zwangerschappen. Klassieke klinische kenmerken van FML omvatten zachte knobbeltjes die zeer variabel zijn in aantal en grootte, in onderhuids vet en beperkt tot de romp en extremiteiten, zoals afgebeeld in Figuur 2. Ongemak en duidelijke gevoeligheid voor palpatie werden alleen waargenomen bij individuele A. comorbide gastro-intestinale stoornissen waren aanwezig bij patiënten A, C en D2. Zij rapporteerden diverticulitis en poliepen, ernstige chronische constipatie, en colorectale kanker respectievelijk. Vier patiënten ondergingen histologische evaluatie van subcutane laesies. De aanwezigheid van rijpe adipocyten afgerond door talrijke haarvaten bevestigde angiolipoma Diagnostisch, zoals verwezen door Bancroft en Fletcher et al10,28 (Figuur 2). Andere relevante bevindingen worden beschreven in Tabel 1.
 |
figuur 1 overzicht van de stambomen van de bestudeerde families (A–E). Merk op hoe vrouwen en mannen in gelijke mate betrokken zijn en het autosomaal dominante overerving patroon met bijna twee opeenvolgende generaties beïnvloed. Familie A had het hoogste aantal generaties ontwikkelen van meerdere lipomen (a). De proband A (III 2) was de enige binnen haar familiegroep en in de casuïstiek in verwijzend pijn toen werd onderzocht (a). Pijlen geven de probands aan. |
 |
Figuur 2 Klinische kenmerken van de FML en histopathologische aspecten van lipomen (HIJ vlek (10×). De primaire bevindingen omvatten zacht, mobiel, en beschrijven pijnloze knobbeltjes, die in onderhuids vet worden gevestigd. De meest voorkomende topografische verdeling omvat de bovenste ledematen (a, B en D), voorste buikwand, rug en dijen (C). Lipoom presenteert gewoonlijk een lobulated patroon van witte adipocytes met eenvormige kernen en een dunne vezelige capsule (E). Angiolipomen zijn samengesteld uit Rijp vet in samenwerking met talrijke kleine bloedvaten, die hoofdzakelijk haarvaten zijn. Fibrine trombi (pijlen) komt zeer vaak voor (F). Afbeeldingen met dank aan de afdeling Pathologie en Medische Genetica, School of Medical Sciences, UNICAMP. |
moleculaire
Sanger-sequencing onthulde twee nieuwe varianten in exon 5 van het hmga2-gen. Beide varianten werden geïdentificeerd bij patiënt A en B1. De eerste was een synonieme heterozygote variant c.327C>T p.(Asp=) beschouwd als lage impact of neutraal, gebaseerd op verschillende voorspellingsinstrumenten (VEP, FATHMM, UMD-predictor, zift, PROVEAN). De tweede verandering daarentegen was een nonsense verandering heterozygote variant c. 328T>C (p. * 110Glnext * 16) die een stop codon substitutie door glutamine aminozuur en de daaropvolgende uitbreiding van het uiteindelijke eiwit veroorzaakt (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Figuur 3 schematiseert de structuur van het hmga2-gen, de eiwitbindende domeinen en de nieuwe varianten.
 |
De variant c.328T>C (p.*110Glnext*16) werd gedefinieerd als 100% pathogeen of met een hoge impact volgens de silico-algoritmen. Het voorspellingssysteem voor de Mutatieproever toonde echter een discrepantie aan tussen de twee beschreven varianten, zoals weergegeven in Tabel 3. Het gerichte multi-genpaneel van AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA, en PTEN in families A, B, C, D, en E, ontdekte geen schadelijke veranderingen in geëvalueerde opeenvolgingen.
 |
Tabel 3 Varianten Gevonden in de Personen A en B1 en Vergelijking Tussen Voorspelling Gereedschappen |
Discussie
Het huidige onderzoek naar het identificeren van de moleculaire basis van FML door de integratie van moderne sequencing technieken zoals Sanger sequencing en NGS gecombineerd met traditionele klinische benaderingen.
na eerdere studies toont het huidige onderzoek enige verschillen met betrekking tot epidemiologische gegevens. We merkten op dat er een veel voorkomende misvatting is over de classificatie en diagnose van verschillende soorten lipomatose.7,10,15 verschillende auteurs benadrukken dat mannen een hoge neiging hebben om meerdere lipomen te presenteren,11,29,30 echter, onze resultaten tonen een schijnbare hoge frequentie van FML bij vrouwen. Het is mogelijk dat deze bevinding slechts een gevolg is van een selectievooroordeel als gevolg van kleine steekproefgrootte, of kan ook worden verklaard door het feit dat vrouwen meer kans hebben om medische zorg te zoeken vanwege cosmetische problemen.31 niettemin geven de stambomen aan dat het aandeel van de getroffen individuen bij beide geslachten vergelijkbaar was, wat leidde tot een geslachtsverhouding die dicht bij 1:1 lag (10 mannen vs 13 vrouwen), wat de werkelijke prevalentie van FML kan onderschatten.6.8,16 interessant, het totale aantal lipomen genoteerd in vrouwen was hoger in vergelijking met de unieke mannelijke onderzocht.Factoren zoals overgewicht en verergerde groei van knobbeltjes tijdens en na de zwangerschap wijzen erop dat exogene factoren (dieet), metabole veranderingen (dyslipidemie of veranderingen in vetzuurdesaturatie) en hormonale mechanismen betrokken kunnen zijn bij adipocyt hyperplasie.32,33 Yee et al vergeleken verschillen in enzymatische desaturatie van stearoyl-CoA tussen individuen met zeldzame vetafwijkingen (RAD) en obese controlegroep en concludeerden dat individuen met FML en obesitas de hoogste desaturatiepercentages vertoonden, waardoor het lipogeneseproces werd verhoogd.Een onverwachte bevinding was dat patiënt A de enige was binnen de casuistische en haar familiegroep die pijn, dagelijkse zwakte, vermoeidheid en psychiatrische comorbiditeit (chronische depressie en angststoornis) manifesteerde. Deze symptomen worden sterk geassocieerd met de ziekte van Dercum, die wordt beschouwd als een differentiële diagnose of een variant van FML.Op basis van de nieuwe Dercum ‘ s Disease classificatie voorgesteld door Hansson et al,36 we geïdentificeerd bij deze patiënt de gegeneraliseerde nodulaire vorm, gekenmerkt door intense pijn op het oppervlak van het vetweefsel en rond lipomen. Een andere studie die deze hypothese steunt werd gepubliceerd door Campen et al37 zij beschreven een familie van negen leden gediagnosticeerd met veelvoudige lipomen die veranderlijke symptomen vertoonden varieerden van totale onbekwaamheid tot asymptomatische knobbeltjes. Daarom kan worden aangenomen dat de segregatie een autosomaal dominant patroon met variabele expressiviteit volgt en mogelijk een extreme manifestatie van FML vertegenwoordigt.
met betrekking tot de histopathologische diagnose hebben we twee hoofdtypen aangetoond: lipoom en angiolipoom. Microscopisch, is de gemeenschappelijkste merkbare eigenschap van angiolipoma de proliferatie van fijn bloedvat die fibrine microtrombi in samenwerking met rijpe adipocytes bevatten.Angiolipomen lijken een hoge incidentie te hebben bij jonge volwassen mannen die af en toe lichte pijn of gevoeligheid vertonen. Dit type tumor is ook gerelateerd aan de geschiedenis van lokale trauma of het gebruik van steroïde therapie.Hoewel veel auteurs beide diagnoses erkennen als verschillende pathologische entiteiten, maken sommige case reports dit onderscheid niet vanwege zeer subtiele verschillen tussen hen.39 In deze context bevestigt onze Analyse dat het mogelijk is om angiolipomen met familiale recidieven te hebben en dat deze diagnoses deel zouden kunnen uitmaken van het brede spectrum van FML.40-43 Voorts zijn de veelvoudige lipomen van de spindelcel, een ander type van lipoom, ook gemeld in verscheidene families.
hoewel er verschillende studies zijn die gericht zijn op expressie en directe cytogenetische analyse op sporadische lipomen, zijn er weinig studies die zich zorgen maken over de constitutionele oorzaken van FML.2 De uitgebreide lipoomreeks in volwassenen bevestigt veelvoudige structurele herschikkingen met frequenties die zich van 50 tot 75% uitstrekken.10,28,45 onder die evenwichtige chromosomale veranderingen, wordt de translocatie t(3; 12)(q27-28; q13-15) waargenomen in bijna 25% van tumors.9 in de meeste gevallen beïnvloedt breekpunt het hmga2-gen dat bestaat uit 5 exonen en een eiwit van 109 aminozuren genereert (Figuur 3).18,46,47 Ligon et al rapporteerden het geval van een achtjarige jongen met een constitutionele herschikking die de band 12q14.3 (De novo pericentrische inversie) beïnvloedt, waarbij het hmga2-gen betrokken was. Nochtans, verschilt het klinische fenotype door somatische overgroei, de vooruitgang van Been en tandleeftijd, cerebellaire tumor, en veelvoudige lipomen,48 van onze casuistic.
we analyseerden de heterozygote varianten c. 327C>T p.(Asp=) en C.328T>C (p.*110Glnext*16) van exon 5 van het hmga2 gen in diverse voorspellingsprogramma ‘ s. De synonieme of stille wijziging werd geïnterpreteerd als goedaardig, terwijl de verandering in het translation stop codon werd beschouwd als 100% pathogeen of een hoge impact. Op deze manier zou het erop kunnen wijzen dat veranderingen met betrekking tot de 3 ut UTR (onvertaalde) regio de neoplastische transformatie van het hmga2 gen zouden veroorzaken.Fusco et al benadrukte de cruciale rol van het hmga2-gen in mesenchymale tumoren. Zij stelden voor dat in het gen hmga2, het 3 ut UTR gebied over het algemeen door Let-7 miRNA en om het even welke wijziging op dit niveau, of afkappen of fusie met ectopische opeenvolgingen, aandrijving aan zijn up-verordening en bijgevolg aan een abnormale replicatie van cellen tot zwijgen wordt gebracht.46
Het is enigszins verrassend dat we in familie B beide nieuwe varianten alleen in de moeder (B1) hadden ontdekt. Het kan erop wijzen dat ze niet scheiden met FML fenotype, worden weggegooid ten minste in deze familie als een etiologische oorzaak. Aan de andere kant presenteerde patiënt A dezelfde twee nieuwe varianten, maar toonde een fenotype aan dat sterk wees op de ziekte van Dercum. Ondanks deze veelbelovende bevindingen, zijn ze enigszins moeilijk te interpreteren omdat het niet mogelijk was om andere familieleden getroffen met FML te beoordelen.
focale vetinfiltratie en meerdere lipomen kunnen aanwezig zijn in verschillende syndromen. Proteus syndroom en kruidnagel (congenitale lipomateuze asymmetrische overgroei, vasculaire misvormingen, epidermale nevi, skelet, en spinale anomalieën) zijn voorbeelden van somatische mutaties waar lipomatose aanwezig is.50,51 aan de andere kant zijn het syndroom van Bannayan-Riley-Rubacalva, multipele endocriene neoplasie type 1, Het Cowden-syndroom en het Gardner-syndroom aandoeningen die het gevolg zijn van kiembaanmutaties met gelijktijdige lipomatose.52-55 zelfs sommige veranderingen die mitochondrial functie zijn gerelateerd aan abnormale vetweefsel groei meestal in de bovenste romp en nek en het beste voorbeeld is de Madelung ziekte.Het negatieve panel van AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA en PTEN sluit echter uit dat zij verantwoordelijk zijn voor het FML-fenotype, althans in dit onderzoek.
conclusie
FML is een zeldzame en heterogene ziekte die kan overlappen met andere dermatologische syndromen zoals de ziekte van Dercum. De natuurlijke geschiedenis van FML in deze reeks onthulde dat de ontwikkeling van letsels progressief was en zijn hoogste weerslag in individuen van middelbare leeftijd bereikte. FML beà nvloede beide geslachten en presenteerde een topografische verdeling met overwicht in extremiteiten en romp. De geslachtsverhouding onder de geëvalueerde patiënten vertoonde een vrouwelijke prevalentie, maar stamboomgegevens vertoonden een meer evenwichtige verdeling. De diagnose van de ziekte van Dercum werd ook herkend bij één persoon (patiënt A).
De moleculaire benadering heeft een meer diepgaand inzicht verschaft in de genetische basis van FML en heeft geprobeerd het grootste aantal kandidaatgenen die ermee verbonden zijn grondig te onderzoeken. Wij benadrukten het nut van NGS naast de methode van Sanger in het begrip van het volledige spectrum van FML, wegens het zou een alternatief voor de etiologieidentificatie en karakterisering van zeldzame genetische voorwaarden in klinische montages kunnen aanbieden. Varianten in exon 5 van het hmga2 gen zijn niet beschreven, en tot nu toe hebben ze een onzekere betekenis in het ontstaan van FML. Verdere studies, met inbegrip van een significant aantal beà nvloede individuen en functionele analyse van de nieuwe varianten van het gen hgma2, zouden moeten worden ondernomen om zijn biologische functie in FML beter te bepalen.