inleiding

Halofielen zijn interessante groepen organismen die bloeien bij een hoog zoutgehalte. Deze organismen kunnen breed worden geclassificeerd op basis van hun optimale zoutgehalte voor de groei in milde halofielen (1-6%, w/v NaCl), matige halofielen (7-15%) en extreme halofielen (15-30%) (Madigan and Martinko, 2006). Uitgebreid onderzoek heeft aangetoond dat halofielen niet beperkt zijn tot een van de levensdomeinen, ze kunnen eukaryoten zijn (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), of prokaryoten behorend tot de domeinen van bacteriën en Archaea. Het algengeslacht Dunaliella en de pekelgarnaal Artemia (Boetius and Joye, 2009) zijn voorbeelden van halofiele eukaryoten, terwijl Halobacterium en Salinibacter voorbeelden zijn van halofiele prokaryoten. Het succes van halofielen in het overleven in zeer zoute omgevingen is te danken aan unieke fysiologische aanpassingen, zoals ionenpompstrategie en organische oplossingsaccumulatie (Oren, 2006; Madigan and Martinko, 2006). Op de genomic en proteomic niveaus, worden halofielen gekenmerkt door hoog GC-gehalte en proteã nen gekenmerkt door lage hydrophobicity, over-vertegenwoordiging van zure residuen, lagere neigingen van spiraalvorming en hogere neigingen van spoelstructuur (Paul et al., 2008).

Halofielen krijgen nu meer toegang tot industriële microbiologie en biotechnologie omdat halofielen groeien met een hoge zoutconcentratie en dit minimaliseert het risico van contaminatie tijdens de teelt (Oren, 2006). Enkele voorbeelden van biotechnologische toepassingen zijn het gebruik van Micrococcus varians om nuclease H (Kamekura el al te produceren., 1982) en het gebruik van de halofiele Tetragenococcus stammen bij de productie van sojasaus en de productie van enkele enzymen waaronder hydrolasen (amylasen, nucleasen, fosfatasen en proteasen) (Oren, 2006). Halofielen zijn ook belangrijk in biologische afbraak en bioremediatie omdat veel halofielen in staat zijn om koolwaterstoffen en andere toxische verbindingen (Ventosa et al., 1998). Halofielen kunnen ook polymeren produceren die worden gebruikt als versterkers van olieterugwinning vanwege hun oppervlakteactieve activiteit en bioemulserende eigenschappen (Oren, 2006).

Halofielen floreren in omgevingen waar het zoutgehalte een hoog niveau bereikt, zoals oceanen, zonnezouten en natuurlijke zoutmeren (Oren, 2007). De Dode Zee van Jordanië is een van de grootste werkelijk hypersalinezutmeren in het binnenland ter wereld (Boetius and Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan and Martinko, 2006). Naast een hoog zoutgehalte; zout, concentratie van meer dan 340 g L-1 (Oren, 2007), de Dode Zee is uniek door zijn hoge barometerdruk (800 mmHg) als gevolg van zeer lage hoogte onder zeeniveau, partiële zuurstofdruk (PIO2) van 8% meer dan op zeeniveau, unieke UV-straling, lage luchtvochtigheid (onder 40%) en weinig regen (Avriel et al., 2011).

Deze studie werd uitgevoerd om de halofiele heterotrofe bacteriesoorten te classificeren die gedijen in de kustzone van de Dode Zee van Jordanië. De microbiële classificatie is gebaseerd op koloniale en celmorfologie, evenals gelijkenis in 16S rRNA gen.

materialen en methoden

bemonstering: monsters van dood zeewater werden verzameld in vier kustzones (Fig. 1) in Maart, juni en oktober 2011. De geografische coördinaten en de hoogte van de bemonsteringsplaatsen zijn weergegeven in Tabel 1. Geografische coördinaten en hoogte werden voor elke locatie bepaald door (eTrex Legend C, Taiwan). Dode Zeewatermonsters werden verzameld in 1 l schone steriele glazen fles met voldoende kopruimte in de fles en onmiddellijk naar het lab getransporteerd.

fysisch-chemische analyse van de monsters: Temperatuur, pH, totaal opgeloste vaste stoffen (TDS) en biologisch zuurstofverbruik (BOD) van watermonsters werden bepaald. Watertemperatuur, pH en zoutgehalte werden in situ gemeten. Watertemperatuur en pH werden gemeten met een draagbare pH meter (Microcomputer pH meter T19000, Trans Instruments). Het zoutgehalte werd gemeten met een refractometer. BOD werd gemeten in (Water, Milieu en droge regio ‘ s research Center aan Al al-Bayt University, Jordanië). Watermonsters werden overgebracht naar een nieuwe glazen fles, daarna werden 1 mL fosfaatbuffer, magnesiumsulfaat, calciumchloride, ijzerchlorideoplossingen per liter watermonster toegevoegd. Het monster werd vervolgens op een temperatuur van 20±3°C gebracht en verzadigd met organisch-vrije gefilterde lucht. De pH van het monster werd gecontroleerd. Als het monster niet in het bereik van 6,5-7,5 lag, werd zwavelzuur of natriumhydroxide toegevoegd om het monster op het vereiste pH-bereik (6,5-7,5) te brengen en de toegevoegde concentratie verdunde het monster niet meer dan 0,5%. Het monster werd op temperatuur gebracht 20°C alvorens verdunningen. Vervolgens werd een passend volume van het monster overgebracht naar BOD-flessen. De fles was gevuld met voldoende verdunningswater om alle lucht te verdringen en er bleven geen belletjes achter. Opgeloste zuurstof (DO) werd bepaald met behulp van een Do analyzer en eventuele verplaatste inhoud werd vervangen door verdunning water en stop strak. De fles werd gedurende 5 dagen bij 20°C geïncubeerd. daarna werd DO bepaald en werd BOD berekend als volgend op het verschil tussen de initiële en de uiteindelijke do over volume.

verrijking, isolatie en gramkleuring: Om de watermonsters te verrijken, werd dood zeewater (10 mL) overgebracht naar 90 mL vloeibaar medium met een hoog zoutgehalte en geïncubeerd bij 30°C in het donker met schudden (100 tpm). Na ongeveer 12 uur werd een loopvol verrijkingskweek gestreept op gemodificeerd vast mineraal zoutmedium en de gescheiden kolonies werden vervolgens gesubcultureerd. Glycerolvoorraden van de isolaten werden ook bereid en opgeslagen bij -20°C voor verdere analyse. De cellen waren Gramkleurig en onder de microscoop onderzocht.

16S rRNA gensequencing en analyse: 16S rRNA gensequentie amplificatie en sequencing werd uitgevoerd door Macrogen Inc., Seoul, Korea, volgens de volgende methode: jonge kolonies van de bacteriestammen werden gesuspendeerd in een centrifugebuis van 1,5 mL met 0,5 mL steriele zoutoplossing en vervolgens gecentrifugeerd bij 10.000 rpm gedurende 10 min.het supernatant werd verwijderd en de pellet werd gesuspendeerd in 0,5 mL InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA) en gedurende 30 min geïncubeerd bij 56°C en vervolgens verhit tot 100°C gedurende 10 min. Na verhitting werd supernatant gebruikt voor PCR. PCR werd uitgevoerd door 1 µL malplaatjedna te mengen met 20 µL PCR-reactieoplossing. 27F / 1492R primers (27F: 5 ‘- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5 ‘- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) werden gebruikt voor versterking en dan 35 versterkingscycli werden uitgevoerd bij 94°C gedurende 45 sec, 55°C gedurende 60 sec en 72°C gedurende 60 sec. Unincorporated PCR primers en dNTPs werden verwijderd uit PCR producten door Montage PCR Clean-up kit (Millipore). De gezuiverde PCR-producten van ongeveer 1.400 bp werden gesequenced door 518f / 800R-primers (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Het rangschikken werd uitgevoerd door de grote cyclus van de kleurstofbeindator te gebruiken die uitrusting v. 3. 1 rangschikken (Toegepaste BioSystems, de V. S.). Sequencing producten werden opgelost op een Applied Biosystems model 3730XL geautomatiseerd DNA sequencing systeem (Applied BioSystems, USA) bij de Macrogen, Inc. Seoul, Korea.

de sequenties werden geanalyseerd en vergeleken met de publieke nucleotide database met behulp van de NCBI BLAST website (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). De opeenvolgingen van de dichtste verwanten werden toen opgehaald uit de database en gebruikt om een fylogenetische boom te construeren gebruikend MEGA5 (Tamura et al., 2011). GC content de sequenties werden berekend door Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

resultaten

fysisch-chemische eigenschappen van de monsters: de monsters van dood zeewater waren zeer zout, variërend van (36-38%). De pH-waarden van de monsters waren laag en variëren van 5,6 tot 6,3. Dit wijst op de licht zure eigenschap van zeewater. De BOD-waarde was zeer laag (1-2 mg O2 L-1), hetgeen wijst op een zeer laag gehalte aan organisch materiaal in het monster. De fysisch-chemische eigenschappen zijn weergegeven in Tabel 2.

heterotrofe levensvatbare bacterietelling: de resultaten van het levensvatbare kiemgetal toonden een zeer laag aantal kolonievormende eenheden in elk monster aan (200-6000 CFU mL-1). Het aantal CFU ‘ s wordt in meer details weergegeven in Tabel 3.

isolatie en classificatie van halofiele heterotrofe bacteriën: in deze studie hebben we 44 halofiele heterotrofe bacteriestammen geïsoleerd. Elf van de 44 bacteriestammen werden als verschillend beschouwd op basis van koloniale morfologie, gramkleuring en celmorfologie. Zeven van de elf verschillende stammen waren Gram-positief en vier van de zeven waren Gram-negatief. De bacteriële stammen werden geà dentificeerd gebaseerd op 16S rRNA genanalyse en zij werden gevonden om tot het domein van bacteriën te behoren. Het dichtstbijzijnde familielid van elke geïsoleerde bacteriestam is weergegeven in Tabel 4 en Fig. 2. Alle sequenties vertoonden een relatief hoog GC-gehalte (tot 58%).

discussie

de fysisch-chemische eigenschappen van dode zeewatermonsters werden bepaald en geanalyseerd. Het zoutgehalte bleek zeer hoog te zijn (tot 38%). Dit is een typisch kenmerk van dood zeewater waardoor het een van de beroemde “athalassohaline” brines (Oren, 2007) is. De pH van dood zeewater bleek licht zuur (5,6-6,3) in vergelijking met pH (7,5-8) in thalassohaliene brines (Oren, 2007). BOD van de monsters waren zeer laag (1-2 mg O2 L-1) als gevolg van laag organisch materiaal in water dat kan worden gebruikt door heterotrofe bacteriën. Deze Fysisch-chemische omstandigheden hebben ongetwijfeld een negatieve invloed op de microbiële diversiteit. Daarom was het aantal levensvatbare cellen in de geteste monsters zeer laag (niet meer dan 6×102 CFU mL-1) in vergelijking met open zeewater. Tellingen van heterotrofe bacteriën in mariene wateren zijn meestal in de Orde van 105 tot 106 bacteriën mL-1 (Zweifel en Hagstrom, 1995; Madigan en Martinko, 2006). Deze aantallen worden afgeleid van niet-specifieke fluorescente kleuringtechnieken (Zweifel en Hagstrom, 1995) die gewoonlijk hogere aantallen dan levensvatbare kiemgetal methode geeft. De eerste publicaties over het aantal bacteriën in Dode Zee werden gedaan door microscopie. Het mobiele nummer was ongeveer 1.9×106 cellen mL1 en tijdens een bloei van rode halobacteriën bereikte de populatiedichtheid 1, 9×107 maar daalde na nachtvlinders tot 5×106 (Oren, 1983).

onderzoek naar halofiele organismen die in Dode Zee leven begon zeer vroeg in 1892 toen bacteriën uit modder werden geïsoleerd uit het geslacht Clostridium (Oren, 2002). Later, in een kort artikel gepubliceerd in 1936, gaf de eerste beschrijving van een inheemse microbiële gemeenschap aangepast aan de extreem barre omstandigheden van de Dode Zee (Oren and Ventosa, 1999). Sinds die tijd breidt en accumuleert onze kennis over de biologische aspecten van de Dode Zee. We hebben dit onderzoek uitgevoerd om onze kennis over de halofiele heterotrofe bacteriën die gedijen in de kustzone van de Jordaanse Dode Zee uit te breiden. We hebben verschillende bacteriesoorten geïsoleerd. Vervolgens hebben we 11 verschillende soorten halofiele bacteriën geà soleerd en geïdentificeerd. De meeste isolaten waren Gram-positief (7 van de 11). Hoewel Grampositieve bacteriën belangrijke aanpassingen hebben, kunnen ze omgevingsstress zoals een hoog zoutgehalte aanpakken (battistuzzi en Hedges, 2009). Het is in de literatuur niet duidelijk of Grampositieve bacteriën of gramnegatieve bacteriën dominant zijn in hypersalineomgevingen. In een studie over prokaryotische halofielen teruggevonden uit sedimenten van het ondiepe El-Djerid zoutmeer in Tunesië, Hedi et al. (2009) vond dat de dominante bacteriële populatie behoort tot Gram-positieve sporenvormende bacteriën.

alle geïsoleerde stammen in deze studie behoren tot het domein van bacteriën. Ze behoren tot 7 verschillende geslachten in het domein. Vijf van de zeven Gram positieve bacteriële isolaten behoren tot het geslacht Bacillus. Dit geslacht werd in 1872 opgericht om drie soorten te omvatten, maar nu zijn er 142 benoemde Bacillus soorten opgenomen in Bergey ‘ s Manual of Systematic Bacteriology (Logan and De Vos, 2009). Bacillus stammen zijn typisch bodemstammen. De in dit onderzoek geïsoleerde Bacillus stammen behoren tot de volgende soorten: B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis en B. cereus. Deze stammen werden aangetroffen in verschillende zoute omgevingen (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Bijvoorbeeld, B. licheniformis werd eerder teruggevonden in mariene sedimenten door Miranda et al. (2008), terwijl B. pumilus werd geïsoleerd uit mariene organismen zoals oesters, Krab en vis in aanvulling op sedimenten door Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis werd teruggewonnen uit zeewater van de Oostzeezee en de Gele Zee in Korea (Yoon et al., 2004). En tenslotte B. cereus, een veel voorkomende bodembacterie, werd aangetroffen in rioolwater maar met halofiele eigenschappen (Al-ZaZaee et al., 2011). Dikke celwand, hoog peptidoglycaangehalte (meer dan 90% van de celwand) (Madigan and Martinko, 2006), hoog GC-gehalte en resistente sporenvorming zijn de belangrijkste redenen voor Bacillus-overleving in zware omstandigheden zoals een hoog zoutgehalte. Opgemerkt moet worden dat Stam DSD32 (geïdentificeerd als B. cereus) de zeer lage gelijkenis heeft met zijn naaste verwant B. cereus. Deze stam kan een nieuwe soort in het geslacht Bacillus vertegenwoordigen op basis van het 16S rRNA-gen.

de andere twee Grampositieve bacteriën zijn stammen van Arthrobacter sp. en Kocuria rosea. Arthrobacter soorten zijn wijd verspreid in de natuur vooral in de bodem (Funke et al., 1996) maar komt niet veel voor in hypersalineomgevingen. Kocuria rosea wordt beschouwd als matig halofiele soorten en het werd teruggevonden uit verschillende zoute omgevingen zoals zout open ondiep water en sommige stammen van Kocuria rosea groeien optimaal bij NaCl concentratie van 30% (Wright and Tanaka, 2002).

gramnegatieve bacteriën kwamen minder vaak voor in onze monsters (4 van de 11). Niettemin blijkt uit gepubliceerde literatuur dat deze isolaten niet ongewoon zijn in een zoute omgeving. Een van de geïsoleerde stammen werd geïdentificeerd als Vibrio alginolyticus. Deze laatste soort komt eigenlijk veel voor in zeemonsters (Molitoris et al., 1985) en werd aangetroffen in zeewater. De stam heeft medisch belang omdat het gecompliceerde huid-en weke delen-infecties kan veroorzaken (Sganga et al., 2009). Belangrijker nog, sommige stammen van Vibrio alginolyticus bleken tetrodotoxine, een sterk neurotoxine (Noguchi et al., 1987). Een andere gramnegatieve bacterie die in deze studie wordt geïdentificeerd is Chromohalobacter salexigens. Deze soort werd eerst geïsoleerd en beschreven als de matig halofiele soort Halomonas elongata en vervolgens voorgesteld als nieuwe soort van Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli is een andere in deze studie geïdentificeerde soort. Deze stam is ook niet ongewoon voor zoute habitats. Het werd onlangs geïsoleerd uit de getijdenvlakte van de Gele Zee in Korea en het werd beschreven als halofiele soorten door Yoon et al. (2005). De laatste stam behoort tot Salinivibrio costicola. Deze soort werd voor het eerst beschreven als Vibrio costicola, maar zijn fenotypische en genotypische kenmerken onderscheiden hem van soorten van het geslacht Vibrio. Daarom werd de stam geplaatst in een nieuw apart geslacht genaamd Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola is matig halofiel en werd oorspronkelijk geïsoleerd uit gezouten voedsel en groeit optimaal in media die 10% zouten bevatten (Mellado et al., 1996). Een lid van het geslacht Salinibacter, S. ruber, is een interessant model voor de studie van de aanpassing van micro-organismen aan het leven bij hoge zoutconcentraties (Oren, 2007).

conclusie

dood zeewater uit de kustzone wordt gekenmerkt door een hoog zoutgehalte, een lage pH, een laag gehalte aan organisch materiaal (laag BOD) en beperkt verschillende soorten heterotrofe bacteriën die behoren tot zowel Gram-positieve als Gram-negatieve geslachten, waaronder Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus en Erythrobacter.

Erkenning

deze studie werd ondersteund door de vakmanschap van academisch onderzoek aan de Al Al-Bayt University, Jordanië, besluit van de Scientific Research Council in vergadering nummer 2/2010/2011. Zo wil de auteur graag de financiële steun van de Universiteit waarderen.