Articles

botmineraal: nieuwe inzichten in de chemische samenstelling

Identificatie van HPO4 2-ionen in botmineraal

directe solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) detectie van protonen gelokaliseerd in botmineraal uit een intact botweefsel monster is niet mogelijk. Dit is toe te schrijven aan de aanwezigheid van de extracellulaire organische matrijs waarvan de verschillende signalen het 1h enige impuls (SP) ssnmr spectrum van een botweefselsteekproef domineren54. De mogelijkheid om atomaire ruimtelijke proximiteiten tussen waterstof-en fosforkernen te onthullen in het tweedimensionale (2D) {1H}31P Heteronucleaire correlatie (hetcor) ssnmr-experiment maakt het echter mogelijk om botmineraalwaterstofomgevingen te onderzoeken door de analyse van de F1-dimensie (Fig. 1 bis). Helaas is dit experiment tijdrovend en geeft het aanleiding tot een 1h projectie van de verticale (F1) dimensie met een relatief slechte signaal-ruisverhouding (S/N) en een lage digitale resolutie (Fig. 1 ter). Om deze beperkingen te overwinnen, gebruikten we het eendimensionale (1D) {1H-31P}1h double cross polarisatie (CP) ssNMR experiment. Het bestaat uit een dubbele CP overdracht uitgevoerd op een “daar-en-terug” manier (1H→31P→1H) (Fig. S1). Ten eerste, dit experiment liet ons toe om 31P-gefilterd 1h ssNMR spectra van bot mineraal te verkrijgen uit een intacte, corticale 2 jaar oude schapen botweefsel monster met een uitstekende S/N ondanks een relatief korte acquisitietijd (d.w.z., 9 uur) (Fig. 1C, D). De verschillende 1h chemische omgevingen van botmineraal zijn nu gemakkelijk waarneembaar en kunnen veilig met precisie worden geanalyseerd. Met betrekking tot de interne kristallijne kern van botmineraaldeeltjes worden de hydroxylionen in het kristalrooster van het hydroxyapatiet waargenomen in de vorm van een complexe resonantie gecentreerd bij δ(1H) = 0,0 ppm. Met betrekking tot hun amorfe oppervlaktelaag zijn structurele watermoleculen en zure fosfaatsoorten aanwezig in niet-apatitische omgevingen waarneembaar in de vorm van een enkele resonantie gecentreerd bij δ(1H) = 5.2 ppm en een brede resonantie variërend van δ(1H) = 7 tot 17 ppm32, respectievelijk.

Figure 1
figure1

detectie van waterstofhoudende species in botmineraal. 1H-31P cross polarisatie (CP) gebaseerd magic angle spinning (MAS) solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectra van een droge 2-jarige schapen bot weefsel Monster. (A) tweedimensionaal (2D) {1H}31P Heteronucleaire correlatie (hetcor) spectrum (contacttijd, TCP = 1000 µs). De signaalintensiteit neemt toe van blauw naar rood. B) 1H-projectie van de verticale (F1) dimensie van het onder A) getoonde 2D {1H}31P HetCor-spectrum. {1H-31P}1H dubbele CP MAS-spectra opgenomen met de volgende contacttijden: (C) tCP1 = tcp2 = 1000 µs; en, (D) tCP1 = tcp2 = 15000 µs. De totale experimentele tijd was in elk experiment hetzelfde (d.w.z. 9 uur).

ten tweede maakt dit experiment het onderzoek van de 1h-gedetecteerde CP-dynamiek mogelijk om selectief de aard van de 1h-kernen in de buurt van 31P-kernen aan het licht te brengen. Hiertoe werd de contacttijd 1 (tcp1) op 1000 µs gehouden, terwijl de contacttijd 2 (tcp2) varieerde van 75 µs tot 1000 µs (Fig. 2). Een gelijkmatige toename van de magnetisatie wordt waargenomen voor zowel de resonanties gecentreerd bij δ(1H) = 0,0 en δ(1H) = 5,2 ppm (zie de zwartgestreepte lijnen), eerder toegeschreven aan OH− ionen en structurele H2O moleculen volgens hun respectieve 1h NMR chemische verschuiving. Daarentegen vertoont de ontwikkeling van het brede signaal in het bereik van δ(1H) = 7-17 ppm aanvankelijk een snelle toename van de magnetisatie (tot tcp2 = 300 µs) en wordt gevolgd door de aanwezigheid van een oscillerend gedrag (tot tcp2 = 1250 µs – zie de zwarte stippellijn). Dit oscillerende gedrag is kenmerkend voor 1h-31P dipolaire (DP-H) oscillaties55,56. De montage van de corresponderende {1H-31P}1H ssNMR spectra op verschillende tCP2 is niet eenvoudig vanwege de overlapping van verschillende resonanties. Terwijl synthetische ha-monsters meestal een symmetrische OH-resonantie32 vertonen; we tonen hier aan dat de OH− resonantie van botmineraal bijzonder complex is en als volgt kan worden toegepast: een hoofdpiek bij δ ( 1H) = 0,0 ppm omgeven door twee schouders pieken bij δ(1H) = -0,7 en 0,9 ppm (Fig. S3). De resterende structurele waterresonantie kan goed worden uitgerust met een enkele piek gecentreerd bij δ(1H) = 5,2 ppm (Fig. S4). Daarentegen kan het brede signaal van de zure fosfaatsoorten die in het bereik δ(1H) = 7-17 ppm kunnen worden waargenomen, niet voldoende worden uitgerust met een enkele piek met vaste positie en lijnbreedte, vooral bij korte contacttijden (zie de best passende resultaten voor de verschillende tcp2-waarden in Fig. S4 – linkerkolom). De montageresultaten zijn echter nauwkeurig wanneer twee verschillende pieken worden gebruikt met vaste posities en vaste lijnbreedtes (respectievelijk 6,2 ± 0,1 en 5,0 ± 0,1 ppm) (Fig. S4 – rechterkolom). We kunnen niet beweren dat dit brede signaal slechts bestaat uit twee pieken die overeenkomen met twee verschillende protonomgevingen, maar het is waarschijnlijk samengesteld uit een brede distributie van chemische omgevingen die leiden tot een distributie van NMR chemische verschuivingen. Dienovereenkomstig, Fig. 3A toont de vier pieken die werden gebruikt om de 31P-gefilterde 1H ssNMR spectra van botmineraal te analyseren voor elke tcp2-waarden: (I) een samengestelde piek gecentreerd bij δ (1H) = 0,0 (paars) en een enkele piek gecentreerd bij δ(1H) = 5,2 (grijs) ppm beide gekenmerkt door een relatief langzame en uniforme groei van hun magnetizaties; en (ii) twee pieken bij δ(1H) = 9,8 (blauw) en 14,0 (groen) ppm die beide dipolaire oscillaties vertonen (Fig. 3B). Met betrekking tot deze laatste twee pieken, de precieze match van het Hartmann-Hahn (H-H) profiel (Fig. S2) maakt numerieke modellering mogelijk van de CP opbouwcurves volgens het model van een enkel spinpaar dat dipolaire oscillaties veroorzaakt door coherente polarisatieoverdracht en de impact van 1h spin diffusion57:

$${\rm{m}}({\rm{t}})={{\rm{M}}}_{0}.\ exp (- \, {{\rm{t}}}_{{\rm{CP}}} / {{\rm{T}}}_{1{\rm {\rho }}}({}^{{\rm{1}}} {\rm{H}})). en de positie van hydroxylionen in F1 is opgeteld. C) 1D 31P CP MAS ssNMR spectrum (TCP = 1000 µs) van een synthetisch octacalciumfosfaat (OCP) Monster. P1 tot P6 komen overeen met de zes verschillende fosfaatgroepen aanwezig in het OCP kristalrooster volgens het werk van Davies et al.60. De rode stippellijn markeert de meest intense resonantie in het signaal van OCP die niet wordt gedetecteerd in botmineraal (B).

kwantificering van HPO4− 2− ionen in botmineraal

de kwantificering van de hpo42-ionen in botmineraal werd uitgevoerd. Daartoe, de lijnvorm en de lijnbreedte van de individuele 31P NMR signalen van de OH− en PO43–bevattende interne kristallijnen kern en de H2O en HPO42–bevattende niet-apatitische omgevingen (amorfe oppervlaktelaag) die werden geopenbaard in Fig. 4B, werden gebruikt in de montage van de kwantitatieve 31P single pulse (SP) MAS ssNMR spectrum van een verse 2-jarige schapen botweefsel Monster (Fig. 5A). Het Molaire percentage van HPO42 – en PO43− ionen in botmineraal bleek ongeveer 50/50 ± 5% te zijn. Zoals gesuggereerd door onze waarnemingen in Fig S9 en S10, werd deze berekening gemaakt in de veronderstelling dat de molaire verhouding van HPO42− ionen in de interne kristallijne kern van de deeltjes dicht bij 0% lag. Zo ‘ n hoog molair aandeel van HPO42− ionen aanwezig in de amorfe oppervlaktelaag weerspiegelt de kleine grootte van botmineraaldeeltjes: 1 1-5 nm in dikte, 10 10-40 nm in breedte en ∼20-100 nm in lengte1, 61,62,63. Aangezien we hebben aangetoond dat de HPO42− ionen geconcentreerd zijn in de amorfe oppervlaktelaag, kunnen we nu de gemiddelde dikte van deze laag schatten voor een 2 jaar oud schapenbodemmonster. Hier beschouwen we een nanosized bloedplaatje met een dikte van 4,0 nm, en we gaan ervan uit dat de dichtheid van fosfaatatomen aanwezig in het kristalrooster van het hydroxyapatiet en in de amorfe oppervlaktelaag gelijkwaardig zijn. In een dergelijk scenario is de dikte van de interne kristallijne kern ongeveer 2,4 nm (d.w.z. de dikte van de buitenste amorfe oppervlaktelaag kan worden geschat op ongeveer 0,8 nm (dit komt dus overeen met de grootte van de hexagonale eenheidscel van hydroxyapatiet langs a en b, en komt dus overeen met het stapelen van slechts twee fosfaationen). Men moet zich ervan bewust zijn dat dit gemiddelde waarden zijn die overeenkomen met de som van de bijdragen van alle anorganische fosfaationen aanwezig in onze 2-jarige schapenbodemmonster. Deze resultaten zouden kunnen verschillen voor oudere specimens waarin het aandeel van de niet-apatitische omgevingen minder zou kunnen zijn65 als gevolg van botmineraal rijping: de progressieve transformatie van de amorfe oppervlaktelaag in apatitische omgevingsen15. Niettemin is de dikte van de hier bepaalde oppervlaktelaag (0,8 nm) in goede overeenstemming met de geschatte grootte die in sommige eerdere studies wordt voorgesteld: ongeveer de grootte van één fosfaateenheid in fluorapatiet-gelatine mesocrystals66; en ongeveer 1-2 nm in synthetische hydroxyapatites32,67,68.

Figuur 5
figure5

kwantificering van hpo42− en CO32− ionen aanwezig in botmineraal. (A) kwantitatief 31P single pulse (SP) magic angle spinning (MAS) solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectrum van een verse 2-jarige schapen botweefsel Monster (blauwe lijn) en de bijbehorende fitting (rode stippellijn) met twee pieken. Deze twee pieken, waarvan de lijnvorm en de lijnbreedte werden geopenbaard in Fig. 4B, komt overeen met de po43-bevattende interne kristallijne kern in de vorm van hydroxyapatiet (oranje piek) en de HPO42-bevattende niet-apatitische omgevingen in de vorm van een amorfe oppervlaktelaag (paarse piek). B) Fourier Transform-Infrared (FT-IR) spectrum van de ν2(CO3) trillingsmodus voor een monster van 2 jaar oud schapenbodemweefsel (blauwe lijn) en de bijbehorende fitting (rode stippellijn). Type B CO32− ionen bezetten de PO43− plaatsen binnen het kristalrooster van het hydroxyapatiet; type A CO32− ionen bezetten de OH-plaatsen binnen het kristalrooster van het hydroxyapatiet; terwijl niet-apatitische CO32-aanwezig zijn in de amorfe oppervlaktelaag die botmineraaldeeltjes bedekt.

Update on bot mineral chemical composition

de resultaten die hier en elders worden gepresenteerd 45 suggereren dat de gemiddelde chemische samenstelling van rijpe corticale botmineraal voorgesteld door Legros et al.27, Ca8. 3□1,7(PO4)4.3(HPO4 of CO3)1,7 (OH of ½ CO3)0,3□1,7, moet opnieuw worden bekeken. Inderdaad, deze formule negeert niet alleen de aanwezigheid van de amorfe oppervlaktelaag waarvan de chemische samenstelling sterk varieert met betrekking tot de apatitische omgevingen aanwezig in de interne kristallijne kern van de deeltjes, maar onderschat ook de molaire verhouding van HPO42− ionen. Om een up-to-date formule voor te stellen van onze 2 jaar oude schapen botweefsel Monster, moesten we eerst het gewicht aandeel van CO32− ionen bepalen. Een waarde van 4,8% met een belangrijke bijdrage in B-type carbonaten werd gevonden door middel van FT-IR-analyses49 (Fig. 5B), die in overeenstemming is met de waarden die zijn gevonden voor andere minerale botmonsters 3. Bovendien werden de volgende parameters in aanmerking genomen: i) de deeltjes moeten elektrisch neutraal blijven (zowel de interne kristallijn kern als de amorfe oppervlaktelaag); ii) het Molaire aandeel van HPO42− ionen ten opzichte van de totale hoeveelheid anorganische fosfaationen wordt volgens deze studie beperkt tot bijna 50%; iii) de mate van carbonatie moet dicht bij de experimentele waarde liggen (4,8% M/M); iv) de totale Ca/(P + C) molaire verhouding moet aanvaardbaar blijven voor een botweefselmonster, i.e. in het bereik van 1,2-1,53 en, laatste, (v) de verhouding van A-type, B-type en niet-apatitische carbonaationen aanwezig in de amorfe oppervlaktelaag moet in overeenstemming blijven met de FT-IR gegevens. Zodra al deze beperkingen zijn samengevoegd, kan de gemiddelde chemische samenstelling van het rijpe corticale botmineraal uit ons 2 jaar oude monster van het botweefsel van schapen als volgt worden benaderd: Ca7.5(PO4)2,8(HPO4)2,6(CO3)0,6(OH)0,2. Men dient op te merken dat deze gemiddelde chemische samenstelling alleen overeenkomt met ons specifieke botweefsel monster volgens onze eigen experimentele resultaten. Daarom is deze formule niet universeel, aangezien de variabiliteit tussen de beendermonsters met name afhankelijk is van de soort, de leeftijd, de voedselvoorziening en hun rijpingsgraad.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *