Eksperimentell design og prøveinnsamling

forsøket ble satt opp i 1982 I Mengcheng county, Anhui-provinsen, Kina (33° 13′ N, 116° 35′ E, 42 m høyde) med typisk kalk concretion svart jord. Den årlige temperaturen er 14.8 °C og den årlige nedbør er 872 mm. Fem befruktningsbehandlinger med hvete-soyabønnevekstrotasjon ble sammenlignet i en helt randomisert blokkdesign med fire replikater (hver tomt er 70 m2) : (1) kontroll, ikke-befruktning; (2) NPK, NPK kjemisk gjødsel bestående av urea (180 kg N ha−1 år−1), superfosfat (90 kg P2O5 ha−1 år−1) og kaliumklorid (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK kjemisk gjødsel pluss 7500 kg hvetestrå ha−1 år−1; (4) npk + pm, npk kjemisk gjødsel pluss 15.000 kg fersk grisgjødsel ha−1 år−1; (5) NPK + CM, NPK kjemisk gjødsel pluss 30.000 kg fersk ku gjødsel ha-1 år-1. I NPK + WS-behandlingen ble alt hvetestrå returnert til feltet, grisgjødsel i NPK + PM-behandlingen og kugjødsel i NPK + CM hadde tilsvarende mengde organisk karbon med tilsatt hvetestrå. Dessuten har disse kontrasterende typer gjødsel som inngår i våre befruktningsbehandlinger forskjellige nivåer av tilgjengelighet for planter og mikrober, for eksempel fra mer labil (grisgjødsel) til mer tilbakevendende (hvetestrå og kugjødsel). Vi brukte et bredt spekter av befruktningsbehandlinger med sikte på å gjøre resultatene representative og anvendelige for kontrasterende forvaltningspraksis.

vi gravde rundt hvetegruppen (som inneholdt 30 til 40 hveteplanter under hvetefyllingsstadiet 20. April 2017) for å holde rotsystemene så intakte som mulig. Rhizosfæren jord som var tett festet til røttene ble deretter børstet. Samtidig ble jordjorden (0-15 cm dyp) samlet som bulkjord ved hjelp av en snekker corer (ca 20 cm unna plantene). Den oppsamlede jorda ble siktet gjennom et 2 mm nett for å fjerne urenheter som røtter og steiner. Noe av jordsmonnet ble lagret på 4 °C for kjemiske analyser, og resten ble lagret på-40 °C FOR DNA-ekstraksjon.

fysisk-kjemisk analyse av Jord

en pH-måler (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Tyskland) ble brukt til å måle jordens pH i et forhold mellom jord og destillert vann på 1:5 (vekt/volum). Jordfuktigheten ble bestemt gravimetrisk ved å tørke 5 g fersk jord ved omtrent 105-108 °C for å nå en konstant vekt og deretter beregne vektforholdet (fordampet vann til tørket jord). Jordens totale karbon (TC) og totale nitrogen (TN) innhold ble bestemt ved forbrenning av lufttørket jord ved hjelp AV EN cns-2000 analysator (LECO, St. Joseph, MI, USA), etter å ha siktet jorda gjennom et 0,15 mm nett. Totalt fosfor (TP) og totalt kalium (tk) innholdet i jorda ble ekstrahert etter hf-HClO4 fordøyelse og målt ved hjelp av molybden blå metode og flammespektrofotometri metode (fp640, INASA, Kina), henholdsvis. Oppløst organisk karbon (DOC) ble ekstrahert ved å tilsette 50 mL destillert vann til 5 g fersk jord, risting i 1 time og vakuumfiltrering gjennom Et g4 glassfiberfilter med en porerom på 1,2 µ( Fisher), og deretter ble karboninnholdet i ekstraktene bestemt av en total organisk karbonanalysator (multi N/C 3000, Analytik Jena, Tyskland). Nitrat (NO3 — N), ammonium (NH4 + – N) og oppløst totalt nitrogen (DTN) ble ekstrahert i et forhold på 5 g frisk jord til 50 mL 2 M KCl. Etter shacking i 1 h ble ekstraktene filtrert gjennom Et G4 glassfiberfilter med et porerom på 1,2 µ (Fisher), og deretter ble et kontinuerlig strømningsanalysesystem (San++ system, Skalar, Holland) brukt til å analysere innholdet I NO3–N, NH4+-N og DTN. Oppløst organisk nitrogen (DON) ble beregnet ved hjelp av følgende formel: DON = DTN − NH4+-N − NO3–n. tilgjengelig fosfor (AP) i jorda ble ekstrahert med 0.5 M NaHCO3 og bestemt ved hjelp av molybden blå metode. Tilgjengelig kalium (ak) ble ekstrahert av 1 M ammoniumacetat og bestemt av flammefotometer (FP640, INASA, Kina) (Tilleggsfil 3: Vedlegg 1).

Bestemmelse av nitrogenfikseringshastigheter

15n2-merkingsmetoden er en av de vanligste og mest anvendte metodene som brukes til å måle n fikseringshastigheter . Fem gram jord ble plassert i 18 × 150 mm Balch rør, og topprommet ble erstattet med syntetisk luft inneholdende 80% 15N2 og 20% O2. Kontrollene ble fylt Med umerket n2-gass og behandlet parallelt. Rørene ble inkubert horisontalt i mørket ved romtemperatur i 22 dager. Atomet % 15n av jordprøver ble bestemt ved hjelp av et stabilt isotopforhold massespektrometer (Flash 2000 HT / Conflo IV / Delta V, Thermo Fisher Scientific, Tyskland). Deretter beregnet vi nettopotensialet N fikseringshastighet ved å sammenligne forskjellen på totalt 15n i jord som mottar 15N2 i forhold til kontroll.

høy gjennomstrømning sekvensering og bioinformatikk analyse

FOR DNA-ekstraksjon, 0.5 g frisk jord ble brukt Med Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). Nifh-genene ble forsterket ved bruk av primerpar nifH-F / nifH-R (5 ‘- AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3’) / (5 ‘- TTGTTSGCSGCCCATCAT-3’). PCR-reaksjoner ble utført i en 20 µL reaksjon som inneholder 4 µL 5 × FastPfu buffer, 2 µL av 2,5 mM dntp, 0.8 µL av 5 mikrometer forward primer, 0.8 µL av 5 mikrometer revers primer, 0.4 µL av fastPfu Polymerase, 10 ng av templat-DNA, og dobbel-destillert vann (ddH2O). Forsterkningen ble utført ved 95 °C i 3 minutter, med 35 sykluser av 95 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 45 sekunder og utvidelse ved 72 °C i 10 minutter. PCR amplicons ble renset Av Agarose Gel DNA rensing kit (TaKaRa Bio), og tre eksemplarer PCR amplifikasjoner for hver prøve ble utført og samlet SOM EN PCR produkt og deretter sekvensert på plattformen Av Illumina MiSeq PE300 (Majorbio Selskap I Shanghai, Kina). Etter sekvensering ble nifH-nukleotidsekvensene analysert VED HJELP AV qiime-1.9.1-rørledningen (http://qiime.sourceforge.net/) . For det første ble lavkvalitets sekvenser (de med kvalitetspoeng < 20, som inneholdt tvetydige nukleotider, eller ikke samsvarer med primer og strekkode) fjernet, og de resterende sekvensene ble videre omdannet til aminosyresekvenser ved hjelp Av FunGene-Rørledningen til Ribosomal Databaseprosjektet . Sekvensene som koder for proteiner som ikke samsvarer med nifh-proteinsekvensen eller som inneholdt termineringskodoner, ble kassert. De resterende sekvensene ble justert mot nifh-gendatabasen , og fjernet både de mislykkede og kimære sekvensene. De resterende sekvensene av høy kvalitet ble gruppert i operasjonelle taksonomiske enheter (Otuer) ved 95% likhet MED UCLUST som kjører i de novo-modus, og alle singleton Otuer ble slettet.

Co-forekomst nettverksanalyse

vi konstruerte en co-forekomst nettverk med alle prøvene (rhizosphere og bulk jord) og identifisert de viktigste økologiske klynger av sterkt assosiert OTUs. De øverste OTUs, som sto for mer enn 80% av den relative overflod i det totale samfunnet, ble valgt . Alle par-wised Spearman korrelasjoner mellom OTUs ble beregnet, og korrelasjonene med En Spearmans koeffisient på mindre enn 0,65 og En p-verdi på mer enn 0,01 ble fjernet. Dette tillot oss å fokusere bare På OTUs som sterkt samvirket og var mer sannsynlig å samhandle med hverandre. Hovedmodulene (økologiske klynger) i nettverket ble visualisert ved Hjelp Av Gephi (https://gephi.org/). Den relative overflod av hver økologisk klynge ble beregnet ved å gjennomsnittlig standardisert relativ overflod (z-score) av arten som tilhørte den (Tilleggsfil 3: Vedlegg 3).

Statistisk analyse

ANOVA-og parvis t-tester ble brukt til å sammenligne jordvariablene, dominerende mikrobiell taxa og det mikrobielle alfa-mangfoldet mellom ulike befruktningsbehandlinger (Tilleggsfil 3: Vedlegg 1). Disse testene ble implementert ved HJELP AV SPSS 21. Mantel-testen ble brukt til å analysere korrelasjonene mellom det diazotrofiske samfunnet og fysisk-kjemiske egenskaper (Tilleggsfil 3: Vedlegg 2). Dette ble utført med» vegansk » – pakken I R × 32 (3.2.2). En hovedkoordinatanalyse (pcoa) ble brukt til å finne signifikante forskjeller i diazotrofiske samfunn mellom prøvetakingsgrupper (Tilleggsfil 3: Vedlegg 2). PCoA ble utført ved bruk Av» labdsv » – pakken R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

Fylogenetiske analyser

nifh-genet gir tilstrekkelig fylogenetisk oppløsning i økologiske studier. Det fylogenetiske treet for de 481 dominerende diazotrofiske fylotypene i de økologiske klyngene ble bygget Ved Hjelp Av FastTree, og visualisert ved Hjelp Av GraPhlAn . Fylogenetisk prøvetakingsteori kan brukes analytisk (forutsatt tilfeldig prøvetaking fra fylogenetisk treet som spådd fylogenetisk mangfold i et lokalsamfunn og deretter sammenligne den observerte fylogenetisk mangfold med disse spådommer) for å bestemme i hvilken grad diazotrophic samfunnet vises tilfeldig (mellom − 2 og + 2), over-dispergert (over + 2), eller gruppert (under − 2). Fylogenetisk prøvetakingsteori ble utført ved Bruk Av r-pakken «picante». En fordel ved tilfeldig prøvetaking av det regionale fylogenetiske treet er at det kan brukes til å sammenligne prøver av ulik størrelse basert på binomial prøvetakingsmodellen . Forskjellene mellom observert og forventet fylogenetisk mangfold ble bestemt ved å beregne og sammenligne z-score for hver økologiske klynge. Når det observerte fylogenetiske mangfoldet er mindre enn det forventede mangfoldet (under − 2), anses det mikrobielle samfunnet i den økologiske klyngen å være fylogenetisk gruppert, noe som betyr at nært beslektede taxa er mer sannsynlig å bli samplet og aktivt valgt av miljøet .

Analyse Av strukturell ligningsmodellering

SEM ble utført ved HJELP AV IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Det ble brukt til å evaluere de direkte og indirekte effektene av jordens fysisk-kjemiske egenskaper og den relative overflod av de viktigste økologiske klyngene På n-fikseringshastighetene. De fysiokjemiske egenskapene til jorda inkluderte jord pH, totalt karbon, totalt nitrogen og totalt fosfor. I modellen var behandlingene (kontroll, npk, NPK + WS, NPK + PM og NPK + CM) kategoriske variabler med to nivåer: 1 (en bestemt behandling) og 0 (gjenværende vurderte behandlinger). I tillegg ble bootstrapping brukt til å teste sannsynligheten for at banekoeffisientene varierte fra null, da noen av variablene ikke var normalfordelt. Vi har også beregnet de standardiserte totale effekter (STEs) av jordegenskaper, befruktning behandlinger, og rhizosphere effekt På n fiksering rate å hjelpe tolkning AV SEM.

Tilfeldig skogsmodelleringsanalyse

Tilfeldig skogsregresjon (r-pakke «randomForest») ble brukt til å regressere normaliserte Otuer i ulike behandlinger. Den 10-fold kryssvalideringsmetoden ble brukt til å bestemme det optimale settet Av OTUs korrelert Med n-fikseringshastighetene . Rangerte lister Over OTUs i Rekkefølge Av Tilfeldige Skoger rapporterte funksjonsviktige poeng ble oppnådd basert på økningen i gjennomsnittlig kvadratfeil av nitrogenfikseringshastigheter spådd over 100 iterasjoner av algoritmen. De 50 markør OTUs ble valgt basert på minimum gjennomsnittlig kryssvalidering gjennomsnitt-kvadrerte feil, som ble oppnådd fra fem studier av 10-fold kryssvalidering.