Eksperimentell design og studiesystem

I 2012 ble 300 frø av rask sykling Brassica rapa planter (Wisconsin Fast Plants Standard Frø, med høy genetisk variasjon) hentet fra Carolina Biologiske Forsyninger, og vokst i en fytotron under standardiserte jord -, lys-og vanningsforhold. Disse plantene er fullt outcrossing (selv inkompatible) og havn nok stående genetisk variasjon å lett svare på selection58, 59. Fra disse 300 plantene ble 108 fulle sib-frøfamilier generert av kunstige kryssinger (bare frøfamilier fra kryss hvor begge foreldrene produserte frukt ble brukt). Disse 108 fulle sib-frøfamiliene ble brukt som startpopulasjon for forsøket.

for første generasjon av forsøket ble tre behandlingsgrupper etablert ved hjelp av de 108 familiene, slik at hver familie var representert i hver behandling for å kontrollere genotype blant behandlinger (Supplerende Fig. 1). Hver behandling besto derfor av 108 planter (som representerer 108 frøfamilier), som vi delte inn i tre replikater (A,B, C) som hver inneholdt 36 planter. Replikatene i behandlingene ble holdt som isolerte linjer i løpet av 9 generasjoner (ingen kryss mellom replikater ble gjort) for å kunne vurdere uavhengige, repeterbare evolusjonære endringer. Plantene til alle replikater i alle behandlingene ble dyrket i fytotronen under standardisert jord (Einheitserde classic), lys (24 h lys) og vanningsforhold. Alle planter ble fenotypet hver andre generasjon starter med generasjon 1. Floral duft data fra generasjon 1 og 3 gikk tapt på grunn av tekniske problemer; i stedet, duft ble samlet inn fra generasjon 4. Blomsterduftdata fra generasjon 1 ble oppnådd etter slutten av forsøket ved å dyrke planter fra startgenerasjonen og samle duft fra en plante fra hver av de 108 frøfamiliene. Dermed ble fra første generasjon totalt 108 planter (36 fra hver replikat) samplet for blomsterduft samtidig som planter av generasjon 9.

Eksperimentell evolusjon og pollinering behandlinger

i vår studie brukte vi tre pollinator behandlinger: humler (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Sveits), hoverflies (‘HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Tyskland), og hånd pollinering. Begge insekter besøker lett blomster av Mange Brassicaceae-arter i naturen, men representerer forskjellige funksjonelle pollinatorkategorier, og har vist seg å variere i overflod i naturlige habitats46. Bruken av enkelt pollinator arter etterligner pollinator miljøer der de mest tallrike pollinatorer er funksjonelt forskjellige. I kontrollbehandlingen (‘CO’) ble tilfeldig valgte planter kryssbestemt for hånd.

Pollinering ble utført 23 dager etter sådd ut i et flybur (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) i drivhuset under standardiserte lysforhold med humle og hoverflies. Eksperimenter ble utført mellom 0900 timer og 1500 timer. Humle ble holdt i et eget fly bur i drivhuset. Hoverflies ble kjøpt som pupper og oppdrettet til klekking etter som mannlige og kvinnelige fluer ble separert. Pollinatorer fikk lov til å mate på rask sykling b. rapa planter (planter av kontrollgruppen i respektive generasjon) og matet med ekstra pollen til 3 dager før pollinasjonsbehandlingen; etterpå ble bare pollen og sukkeroppløsning gitt; 16 h.før pollinering ble pollinatorer sultet.

for pollinering ble alle planter av ett replikat tilfeldig plassert i et kvadrat på 6 × 6 planter med en avstand på 20 cm fra hverandre i flyburet. Fem pollinatorer ble tilsatt individuelt og sekvensielt, og hvert insekt fikk lov til å besøke maksimalt tre forskjellige planter og deretter fjernet fra buret; hvert insekt ble bare brukt en gang. Totalt mottok 12-15 planter per replikat ett eller flere besøk av pollinatorer. Det totale gjennomsnittet (±s.d.) antall besøk (i besøkte planter) var 1.35±0.63 for humlebestøvede planter og 1.28±0.53 for hoverflybestøvede planter. For plantene som ble besøkt, ble antall besøk og antall besøkte blomster registrert. I kontrollgruppen ble 12 planter valgt tilfeldig per replikat og 5 blomster av hver plante ble håndbestøvet av en tilfeldig valgt farplante; fedre ble valgt blant de samme 12 plantene. Hver plante kan være pollen donor til mer enn en plante, men bare mottatt pollen fra en plante. Etter pollinering ble besøkte blomster merket og planter ble holdt i et bur i ytterligere 30 dager til fruktene ble samlet. Frø ble talt og relativ frøsett ble beregnet for hver plante ved å dele det enkelte frøsettet med det gjennomsnittlige frøsettet i replikatet. I tillegg ble antall frø per frukt beregnet for hver besøkte plante. For hver plante ble mannlig kondisjon estimert som spådd faderskap (antall polleneksporthendelser).

fra alle frø produsert av de pollinerte blomstene, ble en delmengde av frø som var representativ for frøproduksjonen av hver enkelt, brukt til å vokse neste generasjon. Jo flere frø en plante produserte, desto flere frø bidro den til neste generasjon, som igjen besto av 36 planter for hver replikering. Frøbidraget fra hver besøkte plante til neste generasjon ble beregnet for hver replikere som: 36/(replikere summen av frø / individuelle frø sett). Verdier under 0,5 ble rundet opp til 1.

innavlsdepresjon

Innavlsdepresjon gjennom hele forsøket ble kvantifisert ved å måle frøvekt og spirehastighet, sistnevnte som prosentandel av frø som spirer per replikat. For å kontrollere for trekk-endringer som følge av innavlsdepresjon, frø produsert av planter av 9. generasjon ble dyrket (som representerer den 10. generasjon) og manuelt krysset mellom replikater innenfor behandlinger, slik at planter av hver replikere var pollen donor og pollen mottaker for planter av to forskjellige replikater (♀En-♂C, ♀B-♂En, ♀C-♂B). Kryssinger innenfor disse kombinasjonene av replikater var tilfeldige. Av de resulterende frøene (ellevte generasjonen) ble en person per frøfamilie dyrket (36 planter per replikat) under de samme forhold som under forsøket. Av disse interreplikatoveringene ble trekk igjen målt og brukt til den endelige sammenligningen av trekk mellom behandlingsgrupper.

Plantetrekk

De fleste trekk, inkludert blomsterduft, ble målt før pollinering, 19-21 dager etter sådd ut. Petal bredde, lengde, pistil lengde og blomst diameter på tre tilfeldig valgte blomster per plante ble målt med en elektronisk caliper (Digital Caliper 0-150 mm, TOOLCRAFT). Nektar fra tre blomster ble samlet med 1 µ mikrokapillarrør (Blaubrand, Wertheim, Tyskland) og volumet bestemt ved å måle lengden på nektarkolonnen i mikropipetten med en tykkelse. For kvantifisering ble gjennomsnittet av tre blomster brukt. For 157 planter jevnt fordelt over behandlingene ble sukkerinnholdet i nektar bestemt ved hjelp av derivatisering og gasskromatografisk analyse. For å gjøre dette ble nektar overført til filterpapir lagret i silikagel. Sektoren på filterpapiret som inneholdt nektar ble kuttet fra resten av filterpapiret og nektar ble eluert i 1 ml Mili-q-vann med høy renhet ved å riste fortynningen i 90 minutter med 400 omdreininger per minutt ved 60 °C på en laboratorieskaker. Etterpå ble 50 µ av oppløsningen tørket ved 60 °C og derivatisert med 100 µ av en blanding av vannfri pyridin (Fisher Scientific, Geel, Belgia), heksametylsilazan (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveits) og trimetylklorosilan (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveits) (10:5:3). Deretter ble prøver drevet AV GC-MS som beskrevet i ref. 32. Vi beregnet totale sukkermengder per blomst og blomsterstand som summen av alle forskjellige sukkerarter(fruktose, glukose, sukrose og sorbitol). Korrelasjonen mellom nektar sukkerinnhold og nektar volum var positiv og høy (r156=0.732, p <0.001), og dermed, for de gjenværende plantene, bare nektar volum ble bestemt. Floral duft samlingen ble gjort før bioassays i en destruktiv måte fra alle plante inflorescences så snart minst fem blomster var åpne. Vi brukte headspace sorption med et push-pull system59, 60. Blomstringene av plantene ble innelukket i glassflasker som tidligere var belagt med sigmacote (Sigma-Aldrich) og lukket med En teflonplate. Antall åpne blomster ble talt for hver plante. Luft fra omgivelsene ble presset med en strømningshastighet på 100 ml min-1 gjennom aktive kullfiltre i glasssylinderen. Samtidig ble luft trukket fra glasssylinderen med en strømningshastighet på 150 ml min-1 gjennom et glassrør fylt med ∼30 mg Tenax TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Luft fra tomme glassflasker ble samlet som luftkontroller. Blomsterflyktige stoffer ble samlet i to timer i en fytotron under standardiserte lys-og temperaturforhold. Kvantifisering av flyktige stoffer ble utført ved gasskromatografi med masseselektiv deteksjon (GC–MSD). Prøver ble injisert i En GC (Agilent 6890n; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) ved Hjelp Av En MultiPurpose Sampler (MPS; Gerstel, M@llheim, Tyskland) ved hjelp Av En gerstel termisk desorpsjon enhet (TDU; Gerstel) med en kald injeksjon system (CIS; Gerstel). FOR termodesorpsjon ble TDU oppvarmet fra 30 til 240 °C med en hastighet på 60 °C min−1 og holdt ved en endelig temperatur i 1 min. CIS ble satt til -150 °C under fangst av elueringsforbindelser fra TDU. TIL injeksjon BLE CIS oppvarmet til 250 °C med en hastighet på 12 °C s-1, og den endelige temperaturen ble holdt i 3 min. GC var utstyrt MED EN HP – 5 kolonne (0,25 mm diameter, 0,25 µ filmtykkelse, 15 m lengde), og helium ble brukt som bæregass med en strømningshastighet på 2 ml min−1. Forbindelse identifikasjon og kvantifisering ble gjort following60 Med Agilent MSD ChemStation Program. Kvantifisering av forbindelser ble oppnådd ved måling av toppområder av utvalgte målioner som er spesifikke for de enkelte duftforbindelsene. Spesifikke målioner ble oppnådd fra syntetiske standarder for alle forbindelser; toppområder ble omdannet til absolutte mengder ved bruk av kalibreringskurver som tidligere ble oppnådd for hver forbindelse ved bruk av syntetiske forbindelser i tre forskjellige konsentrasjoner. Bare duftforbindelser som var til stede i signifikant høyere mengder enn i luftkontrollen ble inkludert i analysen (totalt 14 duftforbindelser). Alle mengder flyktige stoffer ble beregnet i pg per blomst l−1 samplet luft.

tjuefem dager etter sådd ut, samme dag som pollinering ble gjort, ble antall åpne blomster og høyde på hver plante registrert. Etter pollinering (men på samme dag) ble fargerefleksjonsspektrene av tre kronblad fra forskjellige upollinerte (når mulig) blomster per plante registrert ved hjelp av et fiberoptisk spektrofotometer (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Nederland) Og En Xenonpulsert lyskilde (Avlight-Xe; Avantes). Ett kronblad om gangen ble plassert under spektrofotometeret (spesielt med fokus på den distale delen av kronbladet) og prosentvis refleksjon (i forhold til en hvit standard) mellom 200 og 900 nm hver 0.6 nm ble registrert i overføringsmodus. Av det målte spekteret ble bare gjennomsnittet av refleksjonsverdiene hver 10 nm fra 260 til 650 nm fra de tre kronbladene brukt i analysen. I planter av ellevte generasjon, en undergruppe av ca 20 planter per replikat ble analysert for farge, fordi ingen av farge-Pcer ble funnet å være under utvalg gjennom hele forsøket. Arealet av den ultrafiolette absorberende og reflekterende petal overflaten ble målt bare i plante av generasjon 11 med et ultrafiolett-følsomt digitalkamera med kvartslinse. Bilder av blomster ble tatt og ultrafiolett absorberende område kvantifisert ved hjelp Av programvarepakken ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

pollinatorpreferanser

Analyser for pollinatorpreferanser ble utført for hver replikat med begge typer pollinatorer. For hver replikat ble det utført to atferdsanalyser (en for hver pollinatorbehandling). Humle-og hoverfly-pollinerte planter (generasjon 11) av hver replikat ble tilfeldig parret og plassert side ved side (ca 30 cm avstand) i et flygebur (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). En pollinator ble plassert i buret og fikk lov til å besøke en plante. Pollinatorer ble umiddelbart fanget etter at de gjorde sitt valg. Hvert plantepar ble analysert med en pollinator.

selvkompatibilitet og autonom selfing

for å teste for selvkompatibilitet vokste vi planter fra den første (15 planter per replikat) og ellevte generasjonen(30 planter per replikat). Ett frø per frø familie (fra tilfeldig utvalgte familier) ble dyrket og to blomster per plante selfed på anthesis. Gjennomsnittlig antall frø produsert per selfed blomst for hver enkelt plante ble brukt som en måling av selvkompatibilitet.for å teste for autonom selfing vokste vi ca 12 planter (ett frø per familie) per replikat fra hver behandling av generasjon 11 og 1 (totalt 162 planter). Etter 30 dager da ca 20 blomster hadde åpnet, ble de resterende knoppene i hver plante forsiktig kuttet og antall åpnede blomster ble registrert. Planten fikk da lov til å utvikle frukt uten at insekter fikk tilgang til plantene. Etter modning av fruktene ble frø samlet og antall frø ble talt og veid for hver plante. Antall frukter per åpen blomst og frø per frukt ble brukt som et mål for autonom selfing. Fordi noen få planter hadde et veldig høyt antall frukter per åpne blomster, slettet vi disse uteliggere for den endelige sammenligningen av autonom selfing. Følgende antall uteliggere ble slettet: 1 i generasjon 1; I G11: 2 I BB, 3 I HF, 2 I CO.

Statistisk analyse

for å analysere fenotypisk seleksjon ble seleksjonsdifferensialer og gradienter beregnet ved å regressere plantefitness på trekk61. Denne analysen ble gjort separat for behandlingene, men for alle replikater og generasjoner kombinert. Som et treningsestimat ble’ antall besøk ‘ brukt, som var en tellevariabel og fulgte En Poisson-fordeling. En annen treningsvariabel, ‘relativ frøsett’ hadde en distibusjon forspent av de mange nullverdiene; i tillegg savnet frøsettet den eneste mannlige treningsdelen av den første planten som ble besøkt ,som ikke satte frø fra dette besøket (fordi pollinatorer i utgangspunktet ikke hadde brassica pollen). Antall besøk var imidlertid sterkt korrelert med relativ frøsett (BB: r626=0.694, P<0.001; HF: r605=0.597, P<0.001). Generaliserte lineære modeller (Med Poisson-fordeling) ble brukt til å beregne seleksjonsgradienter (multivariate) og differensialer (univariate) for hver behandling med antall besøk som avhengig variabel og trekk som kovariater. I tillegg ble kvadratiske utvalgsgradienter beregnet med alle trekk og kvadrert term for hvert trekk lagt til modellen, og deretter gradienter doblet 62. For å se etter forskjeller i utvalg mellom humler og hoverflies, ble en generalisert lineær modell (Med Poisson-fordeling) med antall besøk som avhengig variabel, behandling som fast faktor, planteegenskaper som kovariater og interaksjonsbehandling*planteegenskaper utført. Før utvalgsanalysen ble alle variablene standardisert til å bety=0 og sd=1 (Z-verdier) på replikatnivå. En generalisert lineær modell ble også brukt til å sammenligne samvær priser mellom humle-og hoverfly-bestøves planter over alle generasjoner. Verdier for blomsterfargespektrofotometer ble redusert gjennom pc-analyse (principal component) med varimax-rotasjon. Bare Pcer med egenverdi over en ble brukt i analysen.Evolusjonær endring i planteegenskaper ble vurdert i planter av 11. generasjon ved hjelp av multivariat lineær diskriminant funksjonsanalyse og univariate general linear models (GLM). FOR GLM ble hvert trekk brukt som den avhengige variabelen, replikert som tilfeldig faktor og behandling som fast faktor med LSD post-hoc test. For å diskriminere virkningen av naturlig utvalg fra drift, vurderte vi om egenskapsforskjeller var konsistente blant replikater av en gitt pollinasjonsbehandling. I GLM-analysen indikerer en signifikant behandlingseffekt egenskapsforskjell mellom ulike pollinatorgrupper på tvers av alle replikater, og diskriminerer dermed pollinatorspesifikk evolusjon fra drift. Drift vil bli indikert av evolusjonære endringer i noen (tilfeldige) replikater bare, indikert av en betydning i faktoren ‘ replikere ‘eller interaksjon mellom’ replikere ‘og’behandling’. Selvkompatibilitet og autonom selfing ble også vurdert AV GLM, men verdier av første generasjons planter ble inkludert i analysen. For analysene av flyktige stoffer og nektarvolum ble data ln(1+x) transformert for å nærme seg normalfordeling. FOR GLM med fargevariablene ble DET UTFØRT EN PC-analyse som beskrevet ovenfor, men uten tidligere standardisering av variablene. PC-analysen ble utført for alle behandlinger, replikater og alle generasjoner sammen, noe som resulterte i fire Pcer som forklarte 96,9% av den totale variansen. Frekvensen av nektarfrie blomster ble analysert separat for hver generasjon, ved å bruke generaliserte lineære modeller med bimodal distribusjon, med ’tilstedeværelse av nektar’ (ja/nei) som den avhengige variabelen, og behandling og replikere som faktorer. Egenskaper i nektariferøse og nektarløse blomster ble sammenlignet for niende og ellevte generasjon sammen, ved å bruke generelle lineære modeller med egenskapen som den avhengige variabelen, og ’tilstedeværelse av nektar’ og behandling som faste faktorer. Førstevalgspreferansene til humle og hoverflies ble analysert ved binomial test (test-prop=0,5; alle replikater samlet). Korrelasjoner mellom nektar og planteegenskaper ble beregnet for alle generasjoner kombinert ved Hjelp Av Pearson-produktmomentkorrelasjoner med ln-transformerte verdier. Statistikk ble utført MED IMB SPSS-Statistikk (Versjon 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

datatilgjengelighet