Introduksjon

Familiær Multiple Lipomatose (FML, omim% 151,900) er en sjelden autosomal dominant lidelse av hypodermis preget av utvikling av godt innkapslede subkutane knuter på ekstremiteter og trunk.1 Første rapporter om flere adipocytiske svulster ble laget siden 1846 Av Sir Benjamin Brodie.2 senere resultater fra Blaschko (1891) og Alsberg (1892) viste en familiær gjentakelse av lesjonene og observert en økt forekomst blant menn.1,3,4 i senere år publiserte mange andre forfattere familier med egenskaper som tyder på FML, 1,5, 6 og til slutt i 1970 klassifiserte Das Gupta lipomatøse svulster i tre kategorier: ensom eller sporadisk, FML og Multiple Symmetrisk Lipomatose (MSL).7,8

Solitære lipomer regnes som den vanligste godartede neoplasma av bløtvev hos voksne, men flere lipomer forekommer hos 5% av individer.9,10 den eksakte forekomsten AV FML er ukjent, men det er anslått å være 0,002%.8,11,12 Alder av knuter er mellom 30 og 40 år, og når maksimal topp på 50-tallet.6,8,13,14 det har vært utbredt at denne lidelsen viser en preferanse for menn, men et stort antall arbeider viser at begge kjønn er like berørt.15-17 selv om det er ansett som en godartet sykdom, kan kosmetiske bekymringer vises i enkelte individer, svekke deres livskvalitet. Videre er det også utbredt i overvektige individer.9

hittil har tilgjengelig forskning i FML vært eksplisitt fokusert på kliniske aspekter, og molekylære problemer blir vanligvis ikke undersøkt. Litteraturen antyder at minst 70% av sporadiske lipomer skyldes cytogenetiske omarrangementer som involverer 12q13-15-båndet, noe som kan føre til et deregulert uttrykk FOR HMGA2-genet (High Mobility Group AT-hook 2). Dette genet koder for ikke-histoner kromatinproteiner som er ansvarlige FOR DNA-konformasjonsendringer, avvikende celleproliferasjon og utvikling av godartede mesenkymale svulster.18-20

Erkjennelsen av den molekylære base av genetiske tilstander og implementering av høy gjennomstrømning sekvensering teknologier har tillatt å utforske og belyse andre mekanismer som er involvert i etiologien av flere genodermatosis. Derfor forsøkte denne studien å utføre en klinisk og molekylær karakterisering av syv personer med FML for å oppdage varianter i seks kandidatgener relatert til lipomatose ved Hjelp Av Sanger og neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS).

Materialer og Metoder

Pasienter og Etiske Aspekter

denne undersøkelsen ble utført i samsvar med Prinsippene I Helsinkideklarasjonen. Godkjenning ble innhentet fra Institutional Review Board før studien (Forskningsetikkutvalget VED FCM-UNICAMP, fil N° 1.313.164) og alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke. Vi gjennomførte studien i poliklinikken for medisinsk genetikk på Klinisk Sykehus Ved Universitetet I Campinas (HC-UNICAMP) I Sã Paulo, Brasil. Totalt syv personer som tilhører fem ikke-relaterte familier (navngitt Fra A Til E) var kvalifisert. Primære inklusjonskriterier for seleksjon av forsøkspersonene var som følger: i) alder over 18 år, ii) klinisk og histopatologisk diagnose av lipom eller angiolipom og iii) familiær residiv som tyder på autosomal dominant arv. Hoved kliniske aspekter ble samlet fra medisinske poster ved hjelp av en strukturert form. Fysisk vurdering involvert deltakelse av både hudlege og genetiker spesialiteter. Patologiavdelingen ved HC-UNICAMP ga de histopatologiske prøvene. Kliniske funn er beskrevet i Tabell 1.

Tabell 1 Klinisk Sammendrag av Pasienter med FML

sanger-sekvensering av hmga2-genet

genomisk dna ble ekstrahert fra perifere edta-blodprøver av syv pasienter i henhold til den konvensjonelle fenol-kloroform-prosedyren som ble brukt av sambrook et al21

en polymerasekjedereaksjon (pcr) ble utført for å forsterke fem koding exons Og intron-exon Veikryss Regioner av hmga2 gene. Ved hjelp av To elektroniske bioinformatiske verktøy, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) og OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), designet Vi det spesifikke paret primere, som oppsummert i Tabell 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies hryvnias) følger produsentens instruksjoner. Kromatogrammer ble undersøkt ved Bruk Av Chromas v. 2.6.5. Resultatene ble sammenlignet MED HMGA2 Ensembletranskriptnummer ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Vi sjekket de nye varianter i tre offentlige datasett: I) Global Alliance For Genomics And Health (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) og, iii) Online Arkiv Av Brasilianske Mutasjoner (http://abraom.ib.usp.br/). For å evaluere pathogenicity score og skadeeffekter av nye varianter i kandidat HMGA2 gen, brukte vi forskjellige i silico prediksjon modeller SOM VEP (Variant Effect Predictor), 22 FATHMM (Funksjonell Analyse Gjennom Skjulte Markov Modeller),23 UMD-predictor,24 SIFT (Sortering Intolerant Fra Tolerant),25 PROVEAN (Protein Variasjon Effekt Analyzer),26 Og Mutation Taster.27

Target Multi-Gene Panel

et tilpasset panel ble utført for å vurdere genene involvert i syndromisk lipomatose. For å utføre denne teknikken oppnådde vi genomisk DNA fra spyttprøver av fem pasienter (A, B, C, D og E) ved Hjelp Av oragene® DNA selvinnsamlingssett (DNA Genotek, Inc.(En) Kategori: Ottawa , Ontario-Bilder, Video Eller Lyd På Wikimedia Commons Prøver ble deretter beriket og hybridisert mot målspesifikke sekvenser. Fangsten ble gjort ved hjelp av Neste generasjons Illumina® MiSeq (TruSeq Capture) sequencer i 150bp parret-end-modus i henhold til standardprotokollen for denne plattformen. Dybde på dekning av målregioner var høyere enn 50x. Berikelse og analyse var fokusert på kodingssekvensene av fem transkripsjoner(AKT1 NM_005163 .2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 og PTEN NM_000314. 4), 10bp av introniske sekvenser og andre regioner som antagelig forårsaker sykdom. Eksoniske slettinger, duplikasjoner og spleiseplassvariasjoner ble også vurdert under undersøkelsen. Lesninger ble justert og sammenlignet med human genome reference (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) ble valgt for å validere varianter som nevnt av Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

Datatilgjengelighet

Sekvenser ble sendt Til GenBank (tiltredelsesnummer: BankIt2217069 Seq1-MK875826). Datasett relatert til denne artikkelen er tilgjengelig På European Bioinformatics Institute EMBL-EBI gjennom ena-depot med studietilknytningsnummer PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

Resultater

Klinisk Analyse

Syv individer fra fem ikke-relaterte familier (A, B1, B2, C, D1, D2 og E) ble inkludert, som vist i Figur 1. Vi identifiserte ikke foreldrenes konsanguinitet mellom deltakerne. Etnisk opprinnelse ble selvrapportert som blandet av hver proband. I en generell oversikt, familier A Og B ble observert å ha tre påfølgende eller flere generasjoner involvert. Mann til kvinne kjønn forholdet ble estimert i 1: 6. Gjennomsnittlig alder ved inklusjon var 42 år (SD 11,8), mens gjennomsnittlig alder ved oppstart av lesjoner var 28 år (SD 11,8). Kvinner rapporterte en topp forekomst av knuter etter deres svangerskap. Klassiske kliniske trekk ved FML inkluderte myke knuter som var svært variable i antall og størrelse, lokalisert i subkutant fett og begrenset til stammen og ekstremiteter, som vist i Figur 2. Ubehag og markert ømhet til palpasjon ble kun observert hos individuelle a. Comorbide gastrointestinale sykdommer var tilstede hos pasienter A, C og D2. De rapporterte divertikulitt og polypper, alvorlig kronisk forstoppelse og kolorektal kreft henholdsvis. Fire pasienter hadde histologisk evaluering av subkutane lesjoner. Tilstedeværelsen av modne adipocytter avrundet av mange kapillærer bekreftet angiolipomdiagnostikk, som referert Til Av Bancroft Og Fletcher et al10,28 (Figur 2). Andre relevante funn er beskrevet I Tabell 1.

Figur 1 Oversikt over stamtavlene til familier som er studert (A–E). Legg merke til hvordan kvinner og menn er like involvert og autosomal dominant arv mønster med nesten to påfølgende generasjoner berørt. Familie a hadde det høyeste antall generasjoner som utviklet flere lipomer (a). Proband A (III 2) var den eneste i hennes familiegruppe og i casuistry i refererende smerte da ble undersøkt (a). Piler indikerer probands.

figur 2 kliniske kjennetegn ved fml og histopatologiske aspekter ved lipomer (han flekker (10×). Primære funn inkluderer myke, mobile og omskrive smertefrie knuter, som ligger i subkutant fett. Den vanligste topografiske fordelingen omfatter øvre lemmer (A, B og D), fremre bukvegg, rygg og lår (C). Lipoma presenterer vanligvis et lobulert mønster av hvite adipocytter med ensartede kjerner og en tynn fibrøs kapsel (E). Angiolipomer består av modent fett i forbindelse med mange små blodkar, som hovedsakelig er kapillærer. Fibrin trombi (piler) er svært vanlig (F). Bilder gjengitt av Institutt For Patologi Og Medisinsk Genetikk, School Of Medical Sciences, UNICAMP.

Molekylær

Sanger-sekvensering avslørte to nye varianter i ekson 5 AV HMGA2-genet. Begge variantene ble identifisert i pasient A og B1. DEN første var en synonymt heterozygot variant c.327C>T p.(Asp=) betraktet som lav effekt eller nøytral, basert på flere prediksjonsverktøy (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). I kontrast var den andre endringen en nonsensendring heterozygot variant c. 328T>C (s.*110glnext*16) som forårsaker en stoppkodonsubstitusjon av glutaminaminosyre og den påfølgende forlengelsen av endelig protein (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Figur 3 skjematizes strukturen AV HMGA2 genet, protein bindende domener, og de nye varianter.

Figur 3 Struktur av DET humane HMGA2-genet. (A) LIGGER på 12q14.3, HMGA2 genet spenner over mer enn 140 kb og omfatter fem exons. Ekson 1, 2 og 3 (blå bokser) kode for EN at-krok domene (blå sirkler). Den fjerde exon (lilla) koder for en spacer region. Exon 5 (rosa boks)koder For Det c-terminale domenet til proteinet av 109 aminosyrer. (B) Elektroferogram fra pasienter A, B1 og referanse. To identiske nye varianter ble funnet hos disse pasientene. En synonymt heterozygot variant c. 327C>T (S.Asp=) Og en no-stop endring heterozygot variant c.328t>C (s.*110glneste*16).

varianten c.328t>C (s.*110glnext*16) ble definert som 100% patogen eller høy effekt i henhold til nevnt i siliko-algoritmer. Mutation Forsmak prediksjon system viste imidlertid et avvik mellom de to variantene beskrevet, som vist i Tabell 3. Det målrettede multi-genpanelet AV AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA og PTEN i familier A, B, C, D og E, oppdaget ikke skadelige endringer i sekvenser evaluert.

Tabell 3 Varianter Funnet I Individer A Og B1 og Sammenligning Mellom Prediksjonsverktøy

diskusjon

den nåværende studien satt ut for å identifisere molekylære baser av fml gjennom integrering av moderne sekvensering teknikker som sanger sekvensering og ngs kombinert med tradisjonelle kliniske tilnærminger.

etter tidligere studier viser dagens forskning noen avvik når det gjelder epidemiologiske data. Vi observerte at det er en vanlig misforståelse om klassifisering og diagnose av ulike typer lipomatose.7,10,15 Flere forfattere understreker at menn har en høy tendens til å presentere flere lipomer,11, 29, 30 men våre resultater viser en tilsynelatende høy frekvens AV FML hos kvinner. Det er mulig at dette funnet bare gjenspeiler en utvalgsskjevhet på grunn av liten utvalgsstørrelse, eller kan også forklares av det faktum at kvinner er mer sannsynlig å søke helsehjelp på grunn av kosmetiske bekymringer.31 likevel indikerer stamtavlene at andelen individer som er berørt av begge kjønn var lik, noe som fører til et kjønnsforhold nær 1:1 (10 menn vs 13 kvinner) som kan undervurdere den sanne forekomsten AV FML.6,8,16 Interessant var det totale antall lipomer notert hos kvinner høyere sammenlignet med den unike mannlige undersøkelsen.1,14

Faktorer som overvekt og forverret vekst av knuter under og etter svangerskap tyder på at eksogene faktorer (diett), metabolske endringer (dyslipidemi eller endringer i fettsyreavmetning) og hormonelle mekanismer kan være involvert i adipocytthyperplasi.32,33 Yee et al sammenlignet forskjeller i enzymatisk desaturering av stearoyl-CoA mellom individer med sjeldne adipose lidelser (RAD) og obese kontrollgruppe og konkluderte med at personer MED FML og fedme viste de høyeste nivåene av desaturering, og dermed øke lipogeneseprosessen.32,34

et uventet funn var at pasient A var den eneste innen den casuistiske og hennes familiegruppe som viste smerte, daglig svakhet, tretthet og psykiatrisk komorbiditet (kronisk depresjon og angstlidelse). Disse symptomene er sterkt forbundet Med Dercums Sykdom, som regnes som en differensialdiagnose eller en variant AV FML.35 Basert på den nye dercums sykdomsklassifisering foreslått Av Hansson et al, 36 identifiserte vi i denne pasienten den generaliserte nodulære formen, preget av intens smerte på overflaten av fettvevet og rundt lipomer. En annen studie som støtter denne hypotesen ble publisert Av Campen et al37 de beskrev en familie på ni medlemmer diagnostisert med flere lipomer som viste variable symptomer varierte fra total funksjonshemming til asymptomatiske knuter. Det kan derfor antas at segregeringen følger et autosomalt dominant mønster med variabel uttrykksevne og muligens representerer en ekstrem manifestasjon AV FML.

Når det gjelder den histopatologiske diagnosen, viste vi to hovedtyper: lipom og angiolipom. Mikroskopisk er den vanligste merkbare egenskapen til angiolipom spredning av fine blodkar som inneholder fibrinmikrothrombi i forbindelse med modne adipocytter.10,28 Angiolipomer ser ut til å ha høy forekomst hos unge voksne menn som av og til manifesterer mild smerte eller ømhet. Denne typen svulst er også relatert til historien om lokal traumer eller bruk av steroidbehandling.13,38 selv om mange forfattere gjenkjenner begge diagnosene som forskjellige patologiske enheter, gjør noen saksrapporter ikke dette skillet på grunn av svært små forskjeller mellom dem.39 i denne sammenheng bekrefter vår analyse at det er mulig å ha angiolipomer med familiær tilbakefall, og disse diagnosene kan være en del av det brede spekteret AV FML.40-43 videre har flere spindelcelle lipomer, en annen type lipom, også blitt rapportert i flere familier.44

Selv om det er flere studier med fokus på ekspresjon og direkte cytogenetisk analyse av sporadiske lipomer, har få studier vært opptatt av konstitusjonelle årsaker TIL FML.2 Omfattende lipomserier hos voksne bekrefter flere strukturelle omarrangementer med frekvenser fra 50 til 75%.10,28,45 blant de balanserte kromosomale endringene, observeres translokasjon t(3; 12)(q27-28; q13-15) hos nesten 25% av svulstene.9 i de fleste tilfeller påvirker brytepunktet HMGA2-genet som består av 5 eksoner og genererer et protein på 109 aminosyrer (Figur 3).18,46,47 Ligon et al rapportert tilfelle av en åtte år gammel gutt med en konstitusjonell omorganisering påvirker bandet 12q14. 3 (de novo pericentric inversion) dermed, involverer HMGA2 genet. Imidlertid er den kliniske fenotypen preget av somatisk overvekst, fremskritt av bein og tannalder, cerebellar tumor og flere lipomer, 48 forskjellig fra vår casuistiske.

vi analyserte heterozygote varianter c.327C>T p.(Asp=) Og c.328t>C (s.*110glnext * 16) av ekson 5 AV HMGA2 genet i ulike prediksjonsprogrammer. Den synonyme eller stille endringen ble tolket som godartet, mens endringen i oversettelsen stoppkodon ble ansett som 100% patogen eller høy effekt. På denne måten kan det tyde på at endringer som involverer 3ʹ UTR (uoversatt) – regionen, vil utløse den neoplastiske transformasjonen AV HMGA2-genet.49 Fusco et al fremhevet DEN avgjørende rollen TIL HMGA2-genet i mesenkymale svulster. DE foreslo at I HMGA2-genet er 3ʹ UTR-regionen generelt tavlet Av Let-7 miRNA, og enhver endring på dette nivået, enten avkorting eller fusjon med ektopiske sekvenser, driver til oppregulering og følgelig til en unormal replikasjon av celler.46

det er noe overraskende at i familie B hadde vi oppdaget begge nye varianter bare i moren (B1). Det kan tyde på at DE ikke adskiller SEG MED fml fenotype, blir kassert i det minste i denne familien som en etiologisk årsak. På den annen side presenterte pasient A de samme to nye varianter, men viste en fenotype som sterkt tyder på Dercums sykdom. Til tross for disse lovende funnene er de noe vanskelige å tolke fordi det ikke var mulig å vurdere andre slektninger som var berørt av FML.

Fokal fettinfiltrasjon og flere lipomer kan være tilstede i flere syndromer. Proteus syndrom og NELLIK (Medfødt lipomatøs asymmetrisk Overvekst, vaskulære misdannelser, Epidermal nevi, Skjelett-og spinalanomalier) er eksempler på somatiske mutasjoner der lipomatose er til stede.50,51 På den annen Side Er Bannayan-Riley-Rubacalva Syndrom, Multippel Endokrin Neoplasi type 1, Cowden syndrom og Gardner syndrom tilstander som skyldes germline mutasjoner som har samtidig lipomatose.52-55 selv noen mutasjoner som involverer mitokondriell funksjon er relatert til unormal vekst av fettvev, hovedsakelig i overkroppen og nakken, og Det beste eksempelet Er Madelungesykdommen.56 det negative panelet AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA og PTEN utelukker imidlertid at DE er ansvarlige for fml-fenotypen, i hvert fall i denne undersøkelsen.

Konklusjon

FML ER en sjelden og heterogen sykdom som kan være overlappende med andre dermatologiske syndromer som Dercums Sykdom. NATURHISTORIEN TIL FML i denne serien viste at utviklingen av lesjoner var progressiv og nådde sin høyeste forekomst hos middelaldrende individer. FML påvirket begge kjønn og presenterte en topografisk fordeling med overvekt i ekstremiteter og trunk. Kjønnsforholdet blant evaluerte pasienter viste en kvinnelig prevalens, men stamtavledata viste en mer balansert fordeling. Diagnosen Av Dercums Sykdom ble også anerkjent hos ett individ (pasient A).den molekylære tilnærmingen har gitt en mer grundig innsikt i DET genetiske grunnlaget FOR FML og har forsøkt å grundig undersøke det største antallet kandidatgener knyttet til DET. Vi fremhevet nytten AV Ngs i tillegg Til Sanger metode i forståelsen av hele spekteret AV FML, på grunn av det kan tilby et alternativ for etiologi identifikasjon og karakterisering av sjeldne genetiske tilstander i kliniske settinger. Varianter i ekson 5 AV HMGA2-genet har ikke blitt beskrevet, og til nå har de en usikker betydning i genesis AV FML. Videre studier, inkludert et mer signifikant antall berørte individer og funksjonell analyse av de nye varianter AV HGMA2-genet, bør gjennomføres for å bestemme sin biologiske funksjon i FML bedre.