INNLEDNING

Halofiler Er interessant gruppe organismer som blomstrer ved høy saltholdighet. Disse organismene kan grovt klassifiseres basert på deres optimale saltholdighet for vekst i milde halofiler (1-6%, w / V NaCl), moderate halofiler (7-15%) og ekstreme halofiler (15-30%) (Madigan og Martinko, 2006). Omfattende forskning har vist at halofiler ikke er begrenset til noen av livsdomenene, de kan være eukaryoter (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), eller prokaryoter som tilhører domenene Til Bakterier og Arkea. Algeslekten Dunaliella og artemia artemia (Boetius og Joye, 2009) er eksempler på halofile eukaryoter, Mens Halobacterium og Salinibacter er eksempler på halofile prokaryoter. Suksess for halofiler i å overleve i svært salte miljøer skyldes unike fysiologiske tilpasninger, som ionpumpestrategi og organiske løsemiddelakkumulering (Oren, 2006; Madigan og Martinko, 2006). På genomisk og proteomisk nivå er halofiler preget av høyt GC-innhold og proteiner preget av lav hydrofobicitet, overrepresentasjon av sure rester, lavere tilbøyeligheter av helixdannelse og høyere tilbøyeligheter av spiralstruktur (Paul et al., 2008).Halofiler får nå mer tilgang til industriell mikrobiologi og bioteknologi fordi halofiler vokser ved høy saltkonsentrasjon, og dette minimerer risikoen for forurensning under dyrking (Oren, 2006). Få eksempler på bioteknologiske anvendelser er bruken Av Micrococcus varians å produsere nuklease H (Kamekura el al., 1982) og bruken av halofile tetragenokokkerstammer i produksjon av soyasaus og produksjon av noen enzymer, inkludert hydrolaser (amylaser, nukleaser, fosfataser og proteaser) (Oren, 2006). Halofiler er også viktige i bionedbrytning og bioremediering siden mange halofiler er i stand til å nedbryte hydrokarboner og andre giftige forbindelser (Ventosa et al., 1998). Halofiler kan også produsere polymerer som brukes som forsterkere av oljeutvinning på grunn av deres overflateaktive aktivitet og bioemulsifiserende egenskaper (Oren, 2006).Halofiler blomstrer i miljøer der saltholdigheten når høye nivåer, som hav, solsalter og naturlige saltvann (Oren, 2007). Dødehavet I Jordan er en av de største virkelig hypersaline saltsjøene i innlandet i verden (Boetius og Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan og Martinko, 2006). I tillegg til høy saltholdighet; salt, konsentrasjon på over 340 g L-1 (Oren, 2007), Dødehavet er unikt ved sitt høye barometertrykk (800 mmHg) på grunn av svært lav høyde under havnivå, delvis oksygentrykk (PIO2) på 8% mer enn ved havnivå, unik UV-stråling, lav luftfuktighet (under 40%) og mangel på regn (AVRIEL et al., 2011).

denne studien ble utført for å klassifisere de halofile heterotrofiske bakterieartene som blomstrer i Strandsonen I Dødehavet I Jordan. Mikrobiell klassifisering er basert på kolonial og cellemorfologi, samt likhet I 16s rRNA-genet.

MATERIALER og METODER

Prøvetaking: Dødehavet vannprøver ble samlet inn fra fire littoral soner (Fig. 1) I Mars, juni og oktober 2011. Geografiske koordinater og heving av prøvetakingsstedene er vist I Tabell 1. Geografiske koordinater og høyde ble bestemt for hvert sted av (eTrex Legend C, Taiwan). Dødehavet vannprøver ble samlet i 1 L ren steril glassflaske forlater nok hodet plass i flasken og transportert umiddelbart til laboratoriet.

Fysisk-Kjemisk analyse av prøvene: Temperatur, pH, Totalt Oppløste Faste Stoffer (Tds) Og Biologisk Oksygenbehov (BOD) av vannprøver ble bestemt. Vanntemperatur, pH og saltholdighet ble målt in situ. Vanntemperatur og pH ble målt med en bærbar pH-meter(Mikrodatamaskin pH-meter T19000, Trans Instrumenter). Saltholdighet ble målt ved et håndholdt saltholdighetsrefraktometer. BOD ble målt i (Vann, Miljø og Tørre Regioner research Center Ved Al al-Bayt University, Jordan). Vannprøver ble overført til en ny glassflaske, deretter ble 1 mL fosfatbuffer, magnesiumsulfat, kalsiumklorid, jernkloridløsninger per liter vannprøve tilsatt. Prøven ble deretter brakt til temperatur 20±3°C og mettet med organisk fri filtrert luft. Ph i prøven ble sjekket. Hvis prøven ikke var i området 6,5-7,5, ble svovelsyre eller natriumhydroksid tilsatt for å bringe prøven til det nødvendige pH-området (6,5-7,5) og den tilsatte konsentrasjonen fortynnet ikke prøven mer enn 0,5%. Prøven ble brakt til temperatur 20°C før fortynning. Passende volum av prøven ble deretter overført TIL bod flasker. Flasken var fylt med nok fortynningsvann for å forskyve all luft uten å etterlate bobler. Oppløst Oksygen (DO) ble bestemt ved HJELP AV EN DO analysator og eventuelle fordrevne innhold ble erstattet med fortynningsvann og propp tett. Flasken ble inkubert i 5 dager ved 20°C. ETTER DET ble DO bestemt og BOD ble beregnet som følge av forskjellen mellom innledende og siste DO over volum.

Berikelse, isolasjon og gramfarging: For å berike vannprøver ble Dødehavet (10 mL) overført til 90 mL flytende høyt saltholdighetsmedium og inkubert ved 30°C i mørke med risting(100 rpm). Etter ca 12 h, en loopful av berikelse kultur ble smykket på modifisert fast mineral salt medium og de separerte koloniene ble deretter subkulturert. Glyserolbestander av isolatene ble også tilberedt og lagret ved -20°C for videre analyse. Cellene Ble Gram-farget og undersøkt under mikroskopet.

16S rrna gensekvensering og analyse: 16s rrna gensekvensforsterkning og sekvensering ble utført Av Macrogen Inc., Seoul, Korea, i henhold til følgende metode: unge kolonier av bakteriestammer ble suspendert i et 1,5 mL sentrifugerør inneholdende 0,5 mL steril saltoppløsning og deretter sentrifugert ved 10.000 rpm i 10 min supernatanten ble fjernet og pelleten ble suspendert i 0,5 mL InstaGene Matriks (Bio-Rad, USA) og inkubert ved 56°C i 30 min og deretter oppvarmet til 100°C i 10 min. Etter oppvarming ble supernatant brukt TIL PCR. PCR ble utført ved å blande 1 µ av mal-DNA med 20 µ PCR-reaksjonsløsning. 27f / 1492r primere (27f: 5’-AGA GTT TGA TGG CTC AG-3′, 1492R: 5 ‘ – TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT t-3’) ble brukt til forsterkning og deretter ble 35 forsterkningssykluser utført ved 94°C i 45 sek, 55°C i 60 sek og 72°C i 60 sek. Uinkorporerte PCR-primere og dntp-er ble fjernet fra PCR-produkter ved Montage PCR Clean up kit (Millipore). Renset PCR produkter av ca 1400 bp ble sekvensert AV 518f / 800R primere (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Sekvensering ble utført Ved Hjelp Av Big Dye terminator syklus sekvensering kit v. 3. 1 (Applied BioSystems, USA). Sekvenseringsprodukter ble løst på Et Applied Biosystems model 3730xl automatisert DNA-sekvenseringssystem (Applied BioSystems, USA) Ved Macrogen, Inc., Seoul, Korea.sekvensene ble analysert og sammenlignet med den offentlige nukleotiddatabasen ved HJELP AV NCBI BLAST-nettstedet (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sekvenser av de nærmeste slektningene ble deretter hentet fra databasen og brukt til å konstruere et fylogenetisk tre VED HJELP AV MEGA5 (Tamura et al., 2011). Gc innhold sekvensene ble beregnet Av Oligo Kalkulator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

RESULTATER

Fysisk-Kjemiske egenskaper av prøvene: Dødehavet vannprøver var svært saltvann fra (36-38%). Ph-verdiene til prøvene var lave og varierte fra 5,6 til 6,3. Dette indikerer den litt sure egenskapen til sjøvann. BOD-verdien var svært lav (1-2 mg O2 L-1), noe som indikerer svært lavt innhold av organisk materiale i prøven. De fysisk-kjemiske egenskapene er vist i Tabell 2.

Heterotrofisk levedyktig bakterietall: Resultater av levedyktig platetall viste svært lavt antall kolonidannende enheter i hver prøve (200-6000 CFU mL-1). CFU-tellingen er vist i flere detaljer I Tabell 3.Isolering og klassifisering av halofile heterotrofe bakterier: i denne studien har vi isolert 44 halofile heterotrofe bakteriestammer. Elleve bakteriestammer ut av 44 ble ansett som forskjellige basert på kolonial morfologi, Gramfarging og cellemorfologi. Syv av elleve forskjellige stammer var Gram-positive og 4 av 7 Var Gram-negative. Bakteriestammene ble identifisert basert PÅ 16s rRNA-genanalyse, og de ble funnet å tilhøre domenet til bakterier. Den nærmeste slektningen til hver isolert bakteriestamme er vist i Tabell 4 Og Fig. 2. Alle sekvenser viste et relativt Høyt GC-innhold (opptil 58%).

DISKUSJON

de fysisk-kjemiske egenskapene Til Dødehavet vannprøver ble bestemt og analysert. Saltholdighetsprosenten ble funnet å være svært høy(opptil 38%). Dette er et typisk kjennetegn Ved Dødehavet, noe som gjør Det til en av de berømte” athalassohaline » saltvannene (Oren, 2007). PH i dødehavet ble funnet å være litt surt (5,6-6,3) sammenlignet med pH (7,5-8) i thalassohalinbriner (Oren, 2007). BOD av prøvene var svært lav (1-2 mg O2 L-1) reflekterer lav organisk materiale i vann som kan benyttes av heterotrofe bakterier. Disse fysisk-kjemiske forholdene påvirker utvilsomt det mikrobielle mangfoldet negativt. Derfor var antall levedyktige celler i de testede prøvene svært lave (ikke mer enn 6×102 CFU mL-1) sammenlignet med åpent sjøvann. Antall heterotrofe bakterier i marine farvann er vanligvis i størrelsesorden 105 til 106 bakterier mL-1 (Zweifel Og Hagstrom, 1995; Madigan og Martinko, 2006). Disse tallene er avledet fra uspesifikke fluorescerende fargeteknikker (Zweifel og Hagstrom, 1995) som vanligvis gir høyere tall enn levedyktig platetellingsmetode. De første publikasjonene om bakterietall i dødehavet ble gjort ved mikroskopi. Celle nummer var ca 1.9×106 celler mL1 og under en blomst av røde halobakterier nådde befolkningstettheten 1, 9×107, men falt etter møll til 5×106 (Oren, 1983).Forskning på halofile organismer i Dødehavet startet veldig tidlig i 1892 da bakterier ble isolert fra Slekten Clostridium fra gjørme (Oren, 2002). Senere, i en kort artikkel publisert i 1936, ga den første beskrivelsen av et innfødt mikrobielt samfunn tilpasset de ekstremt tøffe forholdene I Dødehavet(Oren Og Ventosa, 1999). Siden den tiden ekspanderer og akkumulerer vår kunnskap om de biologiske aspektene Ved Dødehavet. Vi gjennomførte denne undersøkelsen for å utvide vår kunnskap om de halofile heterotrofiske bakteriene som blomstrer i littoral sone I Det Jordanske Dødehavet. Vi har isolert forskjellige bakteriearter. Deretter isolerte og identifiserte vi 11 forskjellige arter av halofile bakterier. De fleste isolater var Gram-positive (7 av 11). Selv Om Grampositive bakterier har viktige tilpasninger, kan De kuppe med miljøstress som høy saltholdighet (Battistuzzi and Hedges, 2009). Det er ikke klart i litteraturen Om Gram-positive bakterier eller Gram-negative bakterier er dominerende i hypersalinmiljøer. I en studie på prokaryote halofiler utvinnes fra sedimenter fra grunne El-djerid salt lake I Tunisia, Hedi et al. (2009) fant at den dominerende bakteriepopulasjonen tilhører Gram-positive sporeformende bakterier.

Alle de isolerte stammene i denne studien tilhører Domenet Til Bakterier. De tilhører 7 forskjellige slekter i domenet. Fem av syv Gram-positive bakterielle isolater tilhører slekten Bacillus. Denne slekten ble etablert i 1872 for å inkludere tre arter, men nå er det 142 navngitte Bacillusarter oppført i Bergeys Manual Of Systematic Bacteriology (Logan and De Vos, 2009). Bacillus stammer er vanligvis jordstammer. Bacillus stammer isolert i denne studien tilhører følgende arter b. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis og b. cereus. Disse stammene ble oppdaget i forskjellige salte miljøer (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Jørgen et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). For Eksempel, B. licheniformis ble tidligere gjenvunnet fra marine sedimenter Av Miranda et al. (2008), Mens b. pumilus ble isolert fra marine organismer som østers, krabbe og fisk i tillegg til sedimenter Av Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis ble utvunnet fra sjøvann I Østhavet og Gulehavet I Korea (Yoon et al., 2004). Og til slutt ble b. cereus, en vanlig jordbakterie, oppdaget i kloakkvann, men med halofile egenskaper (Al-ZaZaee et al., 2011). Tykk cellevegg, høyt peptidoglykaninnhold (mer enn 90% av celleveggen) (Madigan og Martinko, 2006), høyt GC-innhold og resistent sporeformasjon er hovedårsakene til Bacillus overlevelse i tøffe forhold som høy saltholdighet. Det skal bemerkes at stamme DSD32 (identifisert Som b. cereus) har svært lav likhet med sin nærmeste slektning b. cereus. Denne stammen kan representere en ny art i slekten Bacillus basert PÅ 16s rRNA gen.

de andre To Gram-positive bakteriene er stammer Av Arthrobacter sp. og Kocuria rosea. Arthrobacter arter er utbredt i naturen, spesielt i jord (Funke et al., 1996), men er ikke veldig vanlig i hypersalinmiljøer. Kocuria rosea regnes som moderat halofile arter, og den ble gjenvunnet fra forskjellige saltvannsmiljøer som saltvann åpent grunt vann og noen stammer Av Kocuria rosea vokser optimalt ved nacl-konsentrasjon på 30% (Wright Og Tanaka, 2002).

Gram negative bakterier var mindre hyppige i våre prøver (4 av 11). Likevel viser publisert litteratur at disse isolatene ikke er uvanlige i salte miljøer. En av de isolerte stammene ble identifisert Som Vibrio alginolyticus. Sistnevnte arter er faktisk vanlig i marine prøver (Molitoris et al. 1985) og ble funnet i sjøvann. Stammen har medisinsk betydning fordi det kan forårsake komplisert hud og bløtvev infeksjon (Sganga et al., 2009). Enda viktigere, noen stammer av vibrio alginolyticus ble funnet å produsere tetrodotoxin, et sterkt nevrotoksin (Noguchi et al., 1987). En Annen Gram-negativ bakterie identifisert i denne studien Er Chromohalobacter salexigens. Denne arten ble først isolert og beskrevet som den moderat halofile arten Halomonas elongata og deretter foreslått som nye arter Av Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli er en annen art identifisert i denne studien. Denne stammen er heller ikke uvanlig for saltvannshabitater. Det ble nylig isolert fra tidevanns flat av gulehavet I Korea, og det ble beskrevet som halophilic arter Av Yoon et al. (2005). Den siste stammen tilhører Salinivibrio costicola. Denne arten ble først beskrevet Som Vibrio costicola, men dens fenotypiske og genotypiske egenskaper skiller den fra arter av slekten vibrio. Derfor ble stammen plassert i ny separat slekt Kalt Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola er moderat halofil og ble opprinnelig isolert fra saltet mat og vokser optimalt i medier som inneholder 10% salter (Mellado et al., 1996). Et medlem Av slekten Salinibacter, s. ruber, er en interessant modell for studiet av tilpasning av mikroorganismer til liv ved høye saltkonsentrasjoner (Oren, 2007).Dødehavet vann fra littoral sone er preget av høy saltholdighet, lav pH, lavt organisk materiale innhold (lav BOD) og begrense ulike arter av heterotrofe bakterier som tilhører Både Gram-positive og Gram-negative slekter inkludert Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus og Erythrobacter.DENNE studien ble støttet av deanship of academic research Ved Al al-Bayt University, Jordan, Vedtak Av Scientific Research Council i møte nummer 2/2010/2011. Dermed vil forfatteren sette pris på den økonomiske bistanden Fra Universitetet.