Articles

Bone mineral :ny innsikt i sin kjemiske sammensetning

Identifisering AV HPO4 2-ioner i bone mineral

den direkte solid-state Kjernemagnetisk Resonans (ssNMR) deteksjon av protoner lokalisert i benmineral fra en intakt benvevsprøve er ikke mulig. Dette skyldes tilstedeværelsen av den ekstracellulære organiske matrisen hvis forskjellige signaler dominerer 1h single pulse (SP) ssnmr-spektret av en benvevsprøve54. Men muligheten til å avsløre atomskala romlige proksimiteter blant hydrogen-og fosforkjerner i det todimensjonale (2D) {1H}31P Heteronukleære Korrelasjon (HetCor) ssNMR-eksperimentet muliggjør probing av benmineralhydrogenmiljøer gjennom analysen Av F1-dimensjonen (Fig. 1A). Dessverre er dette eksperimentet tidkrevende og gir opphav TIL EN 1h projeksjon av den vertikale (F1) dimensjonen med et relativt dårlig signal-til-støyforhold (S/N) og en lav digital oppløsning (Fig. 1B). For å overvinne disse begrensningene brukte vi det endimensjonale (1d) {1H-31P}1h double cross polarization (CP) ssnmr-eksperimentet. Den består av en dobbel cp-overføring utført på en» der-og-tilbake » måte (1h→31P→1H) (Fig. S1). For det første tillot dette eksperimentet oss å skaffe 31P-filtrert 1h ssNMR spektra av benmineral fra en intakt, kortikal 2 år gammel sauebenvevsprøve med en utmerket S / N til tross for en relativt kort oppkjøpstid (dvs.9 timer) (Fig. 1C, D). De forskjellige 1h kjemiske miljøene fra benmineral er nå lett observerbare og kan sikkert analyseres med presisjon. Når det gjelder den indre krystallinske kjerne av benmineralpartikler, observeres hydroksylionene som er tilstede i hydroksyapatittkrystallgitteret i form av en kompleks resonans sentrert ved δ(1H) = 0,0 ppm. Når det gjelder deres amorfe overflatelag, er strukturelle vannmolekyler og sure fosfatarter tilstede i ikke-apatitiske miljøer observerbare i form av en enkelt resonans sentrert ved δ (1H) = 5.2 ppm og en bred resonans som strekker seg fra δ(1h) = 7 til 17 ppm32, henholdsvis.

Figur 1
figure1

Påvisning av hydrogenbærende arter i benmineral. 1h-31P cross polarization (CP) basert magic angle spinning (MAS) solid-state Kjernemagnetisk Resonans (ssNMR) spektra av en tørr 2 år gammel sau bein vev prøve. (A) todimensjonal (2D) {1H}31p Heteronukleær Korrelasjon (HetCor) spektrum(kontakttid, tCP = 1000 µ). Signalintensiteten øker fra blått til rødt. (B) 1h projeksjon av den vertikale (F1) dimensjonen AV 2D {1H}31P HetCor spectrum vist i (A). {1h-31P}1h dobbel CP MAS spektra registrert med følgende kontakttider: (C) tCP1 = tCP2 = 1000 µ; og (D) tCP1 = tCP2 = 15000 µ. Den totale eksperimentelle tiden var den samme i hvert eksperiment (dvs. 9 timer).

For Det Andre tillater dette eksperimentet undersøkelsen AV DEN 1h-oppdagede CP-dynamikken å selektivt avsløre naturen TIL 1h-kjernene i NÆRHETEN AV 31p-kjerner. Til dette formål ble kontakttiden 1 (tCP1) holdt fast på 1000 µ, mens kontakttiden 2 (tCP2) var variert fra 75 µ opp til 1000 µ (Fig. 2). En jevn økning av magnetiseringen observeres for både resonansene sentrert ved δ (1H) = 0,0 og δ (1h) = 5,2 ppm( se de svarte stiplede linjene), tidligere tilskrevet OH-ioner og strukturelle H2O-molekyler i henhold til deres respektive 1h NMR kjemiske skift. I motsetning til dette viser utviklingen av det brede signalet i området for δ(1h) = 7-17 ppm i utgangspunktet en rask økning i magnetiseringen (opp til tCP2 = 300 µ) og følges av tilstedeværelse av en oscillatorisk oppførsel(opp til tCP2 = 1250 µ-se den svarte stiplede linjen). Denne oscillerende oppførsel er karakteristisk FOR 1h-31p dipolar (DP-H) oscillations55, 56. Monteringen av de tilsvarende {1h-31p}1h ssNMR-spektrene ved forskjellige tCP2 er ikke grei på grunn av overlappingen av forskjellige resonanser. Mens syntetiske HA-prøver vanligvis viser en symmetrisk OH-resonans32; VI viser her AT OH-resonansen av benmineral er spesielt kompleks og kan monteres som følger: en hovedtopp ved δ (1H) = 0.0 ppm omgitt av to skuldre topper ved δ (1h) = -0.7 og 0.9 ppm (Fig. S3). Restkonstruksjonsvannresonansen kan være riktig utstyrt med en enkelt topp sentrert ved δ(1h) = 5,2 ppm (Fig. S4). I motsetning til dette kan det brede signalet fra de sure fosfatartene som er observerbare i området δ (1H) = 7-17 ppm ikke være tilfredsstillende utstyrt med en enkelt topp med fast posisjon og linjebredde, spesielt ved korte kontakttider (se de beste tilpasningsresultatene for de forskjellige tcp2-verdiene I Fig. S4-venstre kolonne). Monteringsresultatene er imidlertid nøyaktige når to forskjellige topper brukes med faste posisjoner og faste linjebredder (henholdsvis 6,2 ± 0,1 og 5,0 ± 0,1 ppm) (Fig . S4-høyre kolonne). Vi kan ikke hevde at dette brede signalet bare består av to topper som tilsvarer to forskjellige protonmiljøer, men det er sannsynligvis sammensatt av en bred fordeling av kjemiske miljøer som fører til en fordeling AV NMR-kjemiske skift. Følgelig Fig. 3A viser de fire toppene som ble brukt til å analysere de 31p-filtrerte 1h ssNMR-spektrene av benmineral for hver tcp2-verdi: (i) en sammensatt topp sentrert ved δ(1h) = 0,0 (lilla) og en enkelt topp sentrert ved δ(1h) = 5,2 (grå) ppm begge preget av en relativt langsom og jevn vekst av magnetiseringene; og (ii) to topper ved δ (1h) = 9.8 (blå) og 14.0 (grønn) ppm begge viser dipolare svingninger (Fig. 3B). I forhold til disse to sistnevnte topper, den nøyaktige match Av Hartmann-Hahn (H-H) profil (Fig. S2) muliggjør numerisk modellering AV CP-oppbyggingskurver i henhold til enkeltspinnparemodellen som står for dipolære svingninger som følge AV sammenhengende polarisasjonsoverføring og virkningen AV 1h spin diffusjon57:

$${\rm{M}}({\rm{t}})={{\rm{M}}}_{0}.\exp ( – \, {{\rm{t}}}_{{\rm{CP}}}/{{\rm{T}}}_{1 {\rm {\rho }}}({}^{{\rm{1}}} {\rm{H}})). og hydroksylioner posisjon I F1 har blitt summert. (C) 1D 31P CP MAS ssNMR spektrum (tCP = 1000 µ) av en syntetisk oktakalsiumfosfat (OCP) prøve. P1 Til P6 tilsvarer de seks forskjellige fosfatgruppene som er tilstede i OCP-krystallgitteret i henhold til Davies et al.60. Den røde stiplede linjen markerer den mest intense resonansen i SIGNALET TIL OCP som ikke oppdages i benmineral (B).

Kvantifisering AV HPO4 2− ioner i benmineral

kvantifiseringen AV HPO42− ioner som er tilstede i benmineral ble foretatt. For dette formål, lineshape OG linewidth av de enkelte 31P NMR signaler AV OH-OG PO43-inneholdende indre krystallinsk kjerne OG H2O OG HPO42-inneholdende ikke-apatitiske miljøer (amorft overflatelag) som ble avslørt I Fig. 4B, ble brukt ved montering av det kvantitative 31P single pulse (SP) MAS SSNMR-spekteret av en fersk 2-årig sauebenvevsprøve (Fig. 5A). Den molare prosentvise andelen HPO42− OG PO43-ioner i benmineral ble funnet å være omtrent 50/50 ± 5%. Som foreslått av våre observasjoner I Fiken S9 Og S10, ble denne beregningen gjort forutsatt at den molare andelen HPO42-ioner i den indre krystallinske kjernen av partiklene var nær 0%. En så høy molar andel AV HPO42-ioner som er tilstede i det amorfe overflatelaget reflekterer den lille størrelsen på benmineralpartikler: ∼1-5 nm i tykkelse, ∼10-40 nm i bredde og ∼20-100 nm i lengde1, 61,62, 63. Siden vi viste AT HPO42-ionene er konsentrert i det amorfe overflatelaget, kan vi nå estimere gjennomsnittlig tykkelse på dette laget for en 2 år gammel sauebenvevsprøve. Her vurderer vi en nanosert blodplate med en tykkelse på 4,0 nm, og vi antar at tetthetene av fosfatatomer som er tilstede i hydroksyapatittens krystallgitter og i det amorfe overflatelaget er ekvivalente. I et slikt scenario er tykkelsen av den indre krystallinske kjerne omtrent 2,4 nm (dvs. 64 langs krystallografiske aksene a og b; a = b = 0,94 nm); mens tykkelsen på det ytre amorfe overflatelaget kan estimeres til å være omtrent 0,8 nm (dvs. som deretter tilsvarer størrelsen på den sekskantede enhetscellen av hydroksyapatitt langs a og b, og dermed tilsvarer stablingen av bare to fosfationer). Man bør være bevisst på at disse er gjennomsnittsverdier som tilsvarer summen av bidragene fra alle uorganiske fosfationer som finnes i vår 2 år gamle sauebenvevsprøve. Disse resultatene kan være forskjellige for eldre prøver der andelen av de ikke-apatitiske miljøene kan være mindre65 på grunn av benmineralmodning: den progressive transformasjonen av det amorfe overflatelaget til apatitiske miljøer15. Likevel er tykkelsen på overflatelaget bestemt her (0,8 nm) i god overensstemmelse med de estimerte størrelsene som er foreslått i noen tidligere studier: omtrent størrelsen på en fosfatenhet i fluorapatitt-gelatin mesokrystals66; og ca 1-2 nm i syntetiske hydroksyapatitter32,67,68.

Figur 5
figure5

Kvantifisering AV HPO42− OG CO32− ioner som finnes i benmineraler. (A) Kvantitativ 31p single pulse (SP) magic angle spinning (MAS) solid-state Kjernemagnetisk Resonans (ssNMR) spektrum av en frisk 2 år gammel sau bein vev prøve (blå linje) og dens tilsvarende montering (rød stiplet linje) med to topper. De to toppene, hvis linjeform og linjebredde ble avslørt I Fig. 4B, tilsvarer PO43-inneholdende indre krystallinsk kjerne i form av hydroksyapatitt (oransje topp) og HPO42-inneholdende ikke-apatitiske miljøer i form av et amorft overflatelag (lilla topp). (B) Fourier Transform-Infrarødt (FT-IR) spektrum for den ν2 (CO3) vibrasjonsmodus for en 2 år gammel sauebenvevsprøve (blå linje) og tilhørende montering (rød stiplede linje). TYPE B CO32-ioner okkuperer PO43-stedene i hydroksyapatittens krystallgitter; TYPE A CO32-IONER okkuperer OH-stedene i hydroksyapatittens krystallgitter; mens ikke-apatitisk CO32-er tilstede i det amorfe overflatelaget som belegger benmineralpartikler.

Oppdatering på bein mineral kjemisk sammensetning

resultatene som presenteres her og elsewhere45 tyder på at den gjennomsnittlige kjemiske sammensetningen av modne kortikale ben mineral foreslått Av Legros et al.27, Ca8.3□1,7(PO4)4.3(HPO4 eller CO3)1.7 (OH ELLER ½ CO3)0,3□1.7, må vurderes på nytt. Faktisk ignorerer denne formelen ikke bare tilstedeværelsen av det amorfe overflatelaget hvis kjemiske sammensetning varierer sterkt med hensyn til de apatitiske miljøene som er tilstede i den indre krystallinske kjerne av partiklene, men undervurderer også den molare andelen AV HPO42− ioner. For å foreslå en oppdatert formel for vår 2 år gamle sauebenvevsprøve, trengte vi først å bestemme vektandelen AV CO32-ioner. EN verdi på 4,8% med et stort bidrag I b-type karbonater ble funnet GJENNOM FT-IR-analyser49 (Fig. 5B), som er i samsvar med verdiene som er funnet for andre benmineralprøver3. I tillegg ble følgende parametere vurdert: (i) partiklene må forbli elektrisk nøytrale (både den indre krystallinske kjerne og det amorfe overflatelaget); (ii) den molare andelen HPO42− ioner i forhold til den totale mengden uorganiske fosfationer er begrenset nær 50% i henhold til den foreliggende studien; (iii) graden av karbonering bør være nær eksperimentell verdi (4,8% w/w); (iv) det totale Ca/(P + C) molforhold bør forbli akseptabelt for en benvevsprøve, i.e. i området 1,2 – 1,53 og, sist, (v) andelen Av A-type, B-type, og ikke-apatitiske karbonationer tilstede i amorfe overflatelaget bør forbli i samsvar MED FT-IR data. Når alle disse begrensningene er slått sammen, kan den gjennomsnittlige kjemiske sammensetningen av det modne kortikale benmineralet fra vår 2 år gamle sauebenvevsprøve tilnærmet som følger: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Man bør merke seg at denne gjennomsnittlige kjemiske sammensetningen bare tilsvarer vår spesifikke beinvevsprøve i henhold til våre egne eksperimentelle resultater. Derfor er denne formelen ikke universell siden variabilitet forekommer blant beinprøver, spesielt avhengig av arten, alderen, matforsyningen og deres grad av modning.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert. Obligatoriske felt er merket med *