Identificación de iones 2− HPO4 en mineral óseo

La Resonancia Magnética Nuclear de estado sólido directa (ssNMR) no es posible la detección de protones localizados en mineral óseo a partir de una muestra de tejido óseo intacta. Esto se debe a la presencia de la matriz orgánica extracelular cuyas diferentes señales dominan el espectro ssNMR de pulso único (SP) de 1H de una muestra de tejido óseo54. Sin embargo, la posibilidad de revelar proximidades espaciales a escala atómica entre núcleos de hidrógeno y fósforo en el experimento ssNMR de Correlación Heteronuclear bidimensional (2D) {1H}31P (HetCor) permite sondear ambientes de hidrógeno mineral óseo a través del análisis de la dimensión F1 (Fig. 1A). Desafortunadamente, este experimento consume mucho tiempo y da lugar a una proyección de 1H de la dimensión vertical (F1) con una relación señal/ruido relativamente pobre (S / N) y una resolución digital baja (Fig. 1B). Para superar estas limitaciones, utilizamos el experimento unidimensional (1D) {1H-31P}1H de polarización cruzada doble (CP) ssNMR. Consiste en una transferencia de CP doble conducida de una manera» ida y vuelta » (1H→31P→1H) (Fig. S1). En primer lugar, este experimento nos permitió obtener espectros de mineral óseo de 1H ssNMR filtrados por 31P a partir de una muestra de tejido óseo cortical intacto de oveja de 2 años de edad con un excelente S/N a pesar de un tiempo de adquisición relativamente corto (es decir, 9 horas) (Fig. 1C, D). Los diferentes ambientes químicos de 1H de mineral óseo ahora son fácilmente observables y se pueden analizar con precisión y seguridad. Con respecto al núcleo cristalino interno de las partículas minerales óseas, los iones hidroxilo presentes en la red cristalina de la hidroxiapatita se observan en forma de una resonancia compleja centrada en δ(1H) = 0,0 ppm. En cuanto a su capa superficial amorfa, las moléculas estructurales de agua y las especies ácidas de fosfato presentes en ambientes no apáticos son observables en forma de una resonancia única centrada en δ(1H) = 5.2 ppm y una amplia resonancia que varía de δ(1H) = 7 a 17 ppm32, respectivamente.

la Detección de hidrógeno-cojinete de la especie mineral del hueso. Espectros de resonancia Magnética Nuclear de estado sólido (ssNMR) de una muestra seca de tejido óseo de oveja de 2 años de edad basados en polarización cruzada (CP) basada en ángulo mágico (MAS). A) espectro de correlación heteronuclear bidimensional (2D) {1H}31P (HetCor) (tiempo de contacto, tCP = 1000 µs). La intensidad de la señal aumenta de azul a rojo. (B) Proyección 1H de la dimensión vertical (F1) del espectro 2D {1H}31P HetCor mostrado en (A). {1H-31P}Espectros MAS de doble CP de 1H registrados con los siguientes tiempos de contacto: (C) tCP1 = tCP2 = 1000 µs; y, (D) tCP1 = tCP2 = 15000 µs. El tiempo experimental total fue el mismo en cada experimento (es decir, 9 horas).

En segundo lugar, este experimento permite la investigación de la dinámica de CP detectada en 1H para revelar selectivamente la naturaleza de los núcleos de 1H cercanos a los núcleos de 31P. Para ello, el tiempo de contacto 1 (tCP1) se mantuvo fijo en 1000 µs, mientras que el tiempo de contacto 2 (tCP2) se varió de 75 µs a 1000 µs (Fig. 2). Se observa un aumento uniforme de la magnetización tanto para las resonancias centradas en δ(1H) = 0,0 como δ(1H) = 5,2 ppm (ver las líneas punteadas negras), atribuidas previamente a iones OH y moléculas estructurales de H2O de acuerdo con su respectivo desplazamiento químico de 1H RMN. En contraste, la evolución de la señal amplia en el rango de δ(1H) = 7-17 ppm muestra inicialmente un rápido aumento de su magnetización (hasta tCP2 = 300 µs) y es seguida por la presencia de un comportamiento oscilatorio (hasta tCP2 = 1250 µs – ver la línea discontinua negra). Este comportamiento oscilatorio es característico de las oscilaciones dipolares (DP-H) de 1H-31P55,56. El ajuste de los espectros {1H-31P}1H ssNMR correspondientes en varios tCP2 no es sencillo debido a la superposición de varias resonancias. Mientras que las muestras sintéticas de HA suelen presentar una resonancia OH simétrica 32; mostramos aquí que la resonancia OH del mineral óseo es particularmente compleja y se puede ajustar de la siguiente manera: un pico principal a δ(1H) = 0.0 ppm rodeado por dos picos de hombros a δ(1H) = -0.7 y 0.9 ppm (Fig. S3). La resonancia estructural residual del agua se puede ajustar correctamente con un único pico centrado en δ ( 1H) = 5,2 ppm (Fig. S4). Por el contrario, la señal amplia de las especies de fosfato ácido observables en el rango de δ(1H) = 7-17 ppm no se puede ajustar satisfactoriamente con un solo pico con posición fija y ancho de línea, especialmente en tiempos de contacto cortos (ver los mejores resultados de ajuste para los diversos valores de tCP2 en la Fig. S4-columna izquierda). Sin embargo, los resultados de ajuste son precisos cuando se utilizan dos picos diferentes con posiciones fijas y anchos de línea fijos (6,2 ± 0,1 y 5,0 ± 0,1 ppm, respectivamente) (Fig. S4-columna derecha). No podemos afirmar que esta señal amplia solo esté compuesta por dos picos correspondientes a dos entornos de protones distintos, pero probablemente esté compuesta por una amplia distribución de entornos químicos que conducen a una distribución de cambios químicos de RMN. En consecuencia, Fig. 3A muestra los cuatro picos que se utilizaron para analizar los espectros de 1H ssNMR filtrados por 31P de mineral óseo para cada valor de tCP2: (i) un pico compuesto centrado en δ(1H) = 0.0 (púrpura) y un único pico centrado en δ(1H) = 5.2 (gris) ppm, ambos caracterizados por un crecimiento relativamente lento y uniforme de sus magnetizaciones; y(ii) dos picos a δ (1H) = 9.8 (azul) y 14.0 (verde) ppm que muestran oscilaciones dipolares (Fig. 3B). Con respecto a estos dos últimos picos, la coincidencia precisa del perfil de Hartmann-Hahn (H-H) (Fig. S2) permite el modelado numérico de las curvas de acumulación de CP de acuerdo con el modelo de par de espín único que tiene en cuenta las oscilaciones dipolares resultantes de la transferencia de polarización coherente y el impacto de la difusión de espín 1h57:

Cuantificación de los iones HPO4 2 en mineral óseo

Se realizó la cuantificación de los iones HPO42 presentes en mineral óseo. Con este fin, la forma de línea y la anchura de línea de las señales de RMN individuales de 31P del núcleo cristalino interno OH− y PO43, y de los ambientes no apáticos (capa superficial amorfa) H2O y HPO42, que se revelaron en la Fig. 4B, se utilizaron en el ajuste del espectro cuantitativo de MSNMR de pulso único (SP) de 31P de una muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad fresca (Fig. 5A). Se encontró que la proporción porcentual molar de iones HPO42 y PO43 en mineral óseo era de aproximadamente 50/50 ± 5%. Como sugieren nuestras observaciones en las Figuras S9 y S10, este cálculo se realizó asumiendo que la proporción molar de iones HPO42 en el núcleo cristalino interno de las partículas era cercana al 0%. Una proporción molar tan alta de iones HPO42 presentes en la capa superficial amorfa refleja el pequeño tamaño de las partículas minerales óseas: thickness 1-5 nm de grosor, 1 10-40 nm de ancho y 2 20-100 nm de longitud1, 61,62,63. Ya que demostramos que los iones HPO42 se concentran dentro de la capa superficial amorfa, ahora podemos estimar el grosor promedio de esta capa para una muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad. Aquí consideramos una plaqueta nanométrica con un grosor de 4,0 nm, y asumimos que las densidades de átomos de fosfato presentes en la red cristalina de la hidroxiapatita y en la capa superficial amorfa son equivalentes. En tal escenario, el espesor del núcleo cristalino interno es de aproximadamente 2,4 nm (p.ej., que es aproximadamente el doble del tamaño de la celda unitaria hexagonal de hidroxiapatita64 a lo largo de los ejes cristalográficos a y b; a = b = 0,94 nm); mientras que el grosor de la capa superficial amorfa externa se puede estimar en aproximadamente 0,8 nm (es decir, que corresponde al tamaño de la celda unitaria hexagonal de hidroxiapatita a lo largo de a y b, y, por lo tanto, es equivalente al apilamiento de solo dos iones fosfato). Uno debe ser consciente de que estos son valores promedio que corresponden a la suma de las contribuciones de todos los iones fosfato inorgánicos presentes en nuestra muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad. Estos resultados podrían ser diferentes para muestras más antiguas en las que la proporción de ambientes no apatiticos65 podría ser menor debido a la maduración mineral ósea: la transformación progresiva de la capa superficial amorfa en ambientes apatiticos15. Sin embargo,el grosor de la capa superficial determinada aquí (0,8 nm) concuerda con los tamaños estimados propuestos en algunos estudios previos: aproximadamente el tamaño de una unidad de fosfato en mesocristales de fluorapatita-gelatina 66; y aproximadamente 1-2 nm en hidroxiapatitas sintéticas32,67, 68.

la Cuantificación de HPO42− y CO32− iones presentes en el mineral del hueso. A) Espectro cuantitativo de resonancia Magnética Nuclear de estado sólido (ssNMR) de un solo pulso (SP) mágico de giro de ángulo (MAS) de 31P de una muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad fresca (línea azul) y su correspondiente ajuste (línea discontinua roja) con dos picos. Esos dos picos, cuya forma de línea y anchura de línea se revelaron en la Fig. 4B, corresponden al PO43 containing que contiene un núcleo cristalino interno en forma de hidroxiapatita (pico naranja) y al HPO42 containing que contiene ambientes no apáticos en forma de una capa superficial amorfa (pico púrpura). B) Espectro infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR) del modo de vibración ν2(CO3) para una muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad (línea azul) y su accesorio correspondiente (línea discontinua roja). Los iones CO32 de tipo B ocupan los sitios PO43 dentro de la red cristalina de la hidroxiapatita; los iones CO32 de tipo A ocupan los sitios OH dentro de la red cristalina de la hidroxiapatita; mientras que el CO32 no apático está presente dentro de la capa superficial amorfa que recubre las partículas minerales óseas.

Actualización de la composición química mineral ósea

Los resultados presentados aquí y en otros lugares 45 sugieren que la composición química promedio del mineral óseo cortical maduro propuesto por Legros et al.27, Ca8. 3□1,7(PO4)4,3(HPO4 o CO3)1,7(OH o ½ CO3)0,3□1,7, debe reconsiderarse. De hecho, esta fórmula no solo ignora la presencia de la capa superficial amorfa cuya composición química varía mucho con respecto a los ambientes apatiticos presentes en el núcleo cristalino interno de las partículas, sino que también subestima la proporción molar de iones HPO42. Para proponer una fórmula actualizada de nuestra muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad, primero necesitábamos determinar la proporción de iones de CO32 en peso. Se encontró un valor de 4,8% con una contribución importante en carbonatos de tipo B a través de análisis FT-IR49 (Fig. 5B), que está de acuerdo con los valores encontrados para otras muestras de minerales óseos3. Además, se consideraron los siguientes parámetros: (i) las partículas deben permanecer eléctricamente neutras (tanto el núcleo cristalino interno como la capa superficial amorfa); (ii) la proporción molar de iones HPO42 en relación con la cantidad total de iones fosfato inorgánicos está limitada cerca del 50% según el presente estudio; (iii) el grado de carbonatación debe estar cerca del valor experimental (4,8% p/p); (iv) la relación molar total Ca/(P + C) debe seguir siendo aceptable para una muestra de tejido óseo, i.e. en el rango de 1.2-1.53 y, por último, (v) la proporción de iones de carbonato de tipo A, tipo B y no apatitico presentes en la capa superficial amorfa debe permanecer de acuerdo con los datos FT-IR. Una vez que se han amalgamado todas estas restricciones, la composición química promedio del mineral óseo cortical maduro de nuestra muestra de tejido óseo de oveja de 2 años de edad se puede aproximar de la siguiente manera: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Hay que tener en cuenta que esta composición química promedio corresponde únicamente a nuestra muestra específica de tejido óseo de acuerdo con nuestros propios resultados experimentales. Por lo tanto, esta fórmula no es universal, ya que la variabilidad se produce entre los especímenes óseos dependiendo, en particular, de la especie, la edad, el suministro de alimentos y su grado de maduración.