실험 설계 및 샘플 수집

,실험 설정에서 1982 년에 Mengcheng county,안후이성,중국(33°13’N,116°35’E,42m 고도)의 일반적인 석회 응결 블랙 토양입니다. 연간 기온은 14.8°c 이고 연간 강수량은 872mm 입니다. 다섯 수정과 치료를 밀 콩 작물 교체들에 비해서 완전히 무작위 블록 디자인과 함께 네 개의 복제(각 플롯는 70m2):(1)제한,non-fertilization;(2)NPK,NPK 화학 비료를 포함하는 요소(180kg N ha−1 년−1),과인산(90kg P2O5ha−1 년−1)및 염화칼륨(86kg K2O ha−1y−1);(3)NPK+WS, NPK 화학 비료 plus7500kg 밀짚 ha−1 년−1;(4)NPK+PM,NPK 화학 비료 plus15,000kg 신선한 돼지 비료 ha−1 년−1; (5)NPK+CM,npk 화학 비료 플러스 30,000kg 신선한 암소 비료 ha−1 년−1. 에 NPK+WS 처리,모든 밀짚으로 돌아갔 분야,돼지 비료 NPK+후 처리를 소 배설물에서 NPK+CM 했 유사한 금액의 유기 탄소가 밀짚. 또한,이러한 대조되는 형태의 비료에 포함되는 우리의 풍부 처리가 서로 다른 수준의 가용성에 대한 식물과 미생물을,예를 들어,에서 더 불안정성(돼지 비료)더 많은 완강히(밀짚 및 소 배설물). 우리 사용되는 다양한 범위의 수정 치료를 목표로 하는 우리의 결과를 대표이고 적용 가능한 대조경영을 실천하고 있 습니다.

우리는 우리 주위에 파 밀 그룹(을 포함하는 30~40 밀 식물 동안 밀 충전 단계의 20 일에 월,2017 년)을 유지하는 루트 시스템으로 그대로 가능합니다. 뿌리에 단단히 밀착 된 뿌리 줄기의 토양은 그 다음 닦았다. 동시에,표토(0-15cm 깊이)는 오거 코어러(식물에서 약 20cm 떨어진 곳)를 사용하여 벌크 토양으로 수집되었습니다. 수집 된 토양을 2mm 메쉬를 통해 체질하여 뿌리 및 돌과 같은 불순물을 제거 하였다. 토양의 일부는 화학 분석을 위해 4°c 에서 저장되었고 나머지는 DNA 추출을 위해−40°c 에서 저장되었습니다.

토양 물화학적 분석

ph 측정기(FE20FiveEasy™,Mettler Toledo,Germany)를 사용하여 토양 대 증류수 비율 1:5(중량/부피)로 토양 pH 를 측정하였다. 토양 습기로 결정했 gravimetrically 에 의해 건조 5g 의 신선한 토양에서 약 105-108 을°C 에 도달하는 일정한 체중을 계산하는 다음 무게 비율(증발된 물을 건조한 토양). 총 탄소(TC)총 질소(TN)의 내용의 토양에 따라 결정되었의 연소 공기가 건조한 토양을 사용하여 CNS-2000 분석기(니.,성 요셉 성당,,MI,미국)후,체질이 토양을 통해 0.15mm 메시입니다. 총 인(TP)총 칼륨(TK)내용의 토양에 압축 해제한 후 HF-HClO4 소화를 사용하여 측정 몰리브덴 파란색 방법 및 화염 분광법(FP640,나사,China),각각합니다. Dissolved organic carbon(DOC)를 추출하여 추가 50mL 증류 물 5g,신선한 토양에 대해 1 시간,그리고 진공 필터링을 통해 G4 유리 섬유를 사용하여 필터 숨구멍의 공간 1.2μm(피셔),그리고,탄소 내용물에서 추출물을에 의해 결정되는 총 유기 탄소 해석기(multi N/C3000,Analytik 예나,독일). 질산염(NO3–N),암모늄(NH4+-N)및 용해 된 총 질소(DTN)를 50ml2m KCl 에 5g 의 신선한 토양의 비율로 추출 하였다. 후에는 동거를 위한 1h 추출물을 필터링을 통해 G4 유리 섬유를 사용하여 필터 숨구멍의 공간 1.2μm(피셔),다음,지속적인 흐름 분석 시스템(San++시스템 Skalar,네덜란드)었을 분석하는 데 사용되는 컨텐츠의 NO3-N,NH4+-N,DTN. 용해 된 유기 질소(DON)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:DON=DTN−NH4+-N−NO3–N. 토양에서 이용 가능한 인(AP)을 0 으로 추출 하였다.5M nahco3 및 몰리브덴 블루 방법을 사용하여 결정. 사용 가능한 칼륨(AK)에서 추출하여 1M 암모늄 아세테이트와 결정에 의한 불꽃 광도계(FP640,나사,China)(추가 파일 3:부록 1)입니다.

결정의 질소 고정 요금

15N2-레테르를 붙이는 방법은 하나의 가장 일반적이고 가장 널리 이 방법을 적용을 측정하기 위해 사용되는 N 고정 요금. 5 그램의 토양을 18×150mm 발치 튜브에 넣고 헤드 스페이스를 80%15N2 및 20%O2 를 함유 한 합성 공기로 대체했습니다. 대조군은 라벨이없는 N2 가스로 채워지고 병렬로 처리되었다. 튜브를 22 일 동안 실온에서 어둠 속에서 수평으로 배양 하였다. 토양 샘플의 원자%15N 은 안정한 동위 원소 비율 질량 분석계(Flash2000HT/Conflo IV/Delta V,Thermo Fisher Scientific,Germany)를 사용하여 결정되었습니다. 그런 다음,우리는 대조군과 관련하여 15N2 를받는 토양에서 총 15N 의 차이를 비교하여 순 잠재력 N 고정 속도를 계산했다.

고 처리량 시퀀싱 및 생물 정보학 분석

DNA 추출을 위해,0.신선한 토양 5g 을 Fast DNA SPIN Kit(MP Biomedicals,SANTA Ana,CA,USA)와 함께 사용했습니다. 프라이머 쌍 nifH-F/nifH-R(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)을 사용하여 nifh 유전자를 증폭시켰다. PCR 반응을 수행하였 20µL 반응을 포함하는 4μl of5×FastPfu 버퍼,2μl of2.5mM dNTPs,0.8µL5μm 앞으로 프라이머,0.8µL5μm 역방향 프라이머,0.4µL 의 fastPfu 효소,10ng 템플릿의 DNA,더블 증류 물(ddH2O). 증폭은 3 분 동안 95°C 에서,30 초 동안 95°C,30 초 동안 55°C,45 초 동안 72°C 의 35 사이클과 10 분 동안 72°c 에서 연장을 수행 하였다. PCR amplicons 의 정화되었으로 Agarose Gel DNA 정화 장비(타카라 바이오),그리고 삼중 PCR 증폭 각 샘플에 대한 수행되었고 풀으로 PCR 제품 다음 시퀀싱 플랫폼에서의 Illumina MiSeq PE300(Majorbio 회사는 중국 상하이에서). 시퀀싱 후,QIIME-1.9.1 파이프 라인(http://qiime.sourceforge.net/)을 사용하여 nifH 뉴클레오티드 서열을 분석 하였다. 첫째,낮은 품질 시퀀스(으로 그 품질의 점수를<20,을 포함하는 모 뉴클레오티드 또는 일치하지 않는 프라이머를 바코드)제거되었고 남은 시퀀스가로 변환하여 아미노산 시퀀스를 사용하 FunGene 파이프라인의 Ribosomal 데이터베이스 프로젝트입니다. Nifh 단백질 서열과 일치하지 않거나 종단 코돈을 함유 한 단백질을 코딩하는 서열은 폐기되었다. 나머지 서열은 nifh 유전자 데이터베이스에 대해 정렬되어 실패한 서열과 키메라 서열을 모두 제거했습니다. 나머지 고품질 시퀀스는 de novo 모드에서 실행되는 uclust 와 95%유사성으로 operational taxonomic units(OTUs)로 클러스터링되었으며 모든 싱글 톤 OTUs 가 삭제되었습니다.

Co-occurrence network analysis

우리 건설 공동 발생과 네트워크는 모든 샘플을(근권 및 대량 토양)및 확인 주요 생태지 클러스터의 강력하게 연결된 OTUs. 전체 커뮤니티에서 상대적 풍요의 80%이상을 차지하는 상위 오투스가 선정되었습니다. 모든 쌍-알 Spearman 사이의 상관 관계 OTUs 계산 및 상관관계를 가진 스피어의 계수보다 적은 0.65 고 P 값 이상 0.01,제거되었습니다. 이를 통해 우리는 강하게 공동 발생했으며 서로 상호 작용할 가능성이 더 큰 오투스에만 집중할 수있었습니다. 네트워크의 주요 모듈(생태 클러스터)은 Gephi(https://gephi.org/)를 사용하여 시각화되었습니다. 각 생태 군집의 상대적 풍부도는 그것에 속한 종의 표준화 된 상대적 풍부도(z-score)를 평균하여 계산되었다(추가 파일 3: 부록 3).

통계분석

분산 분석 및 대응별 t 한 테스트는 비교하는 데 사용되는 토양한 변수,지배적인 미생물 유포리아 및 미생물 alpha 다양성이 서로 다른 수정 치료(추가 파일 3:부록 1)입니다. 이러한 테스트는 SPSS21 을 사용하여 구현되었습니다. 벽난로 테스트를 분석하는 데 사용되는 사이의 상관 관계 diazotrophic 커뮤니티와 물리 화학적 특성(추가 파일 3:부록 2). 이것은 R×32(3.2.2)의”완전 채식”패키지를 사용하여 수행되었습니다. 주 좌표 분석(PCoA)었을 찾기 위해 사용에 상당한 차이 diazotrophic 커뮤니티 사이의 샘플링 그룹(추가 파일 3:부록 2). PCoA 는”labdsv”패키지 R×32(3.2.2)(http://cran.stat.sfu.ca/)를 사용하여 수행되었습니다.

계통 발생 분석

nifh 유전자는 생태 학적 연구에서 충분한 계통 발생 분해능을 제공한다. 생태 클러스터에서 481 개의 지배적 인 diazotrophic phylotypes 에 대한 계통 발생 나무는 FastTree 를 사용하여 구축되었으며 GraPhlAn 을 사용하여 시각화되었습니다. Phylogenetic 샘플링 이론 수 있는 분석적으로 고용(고 가정하고 무작위 샘플링에서 phylogenetic 나무로 예측 계통의 다양성에서 지역 사회와 비교하여 다음에 관 phylogenetic 사람들과 예측)을 결정하는 정도 diazotrophic 커뮤니티타 임의의 간(2+2),over-산(위+2),또는 클러스터(아래−2). 계통 발생 샘플링 이론은 R 패키지”picante”를 사용하여 수행되었습니다. 의 장점 무작위 샘플링 지역 phylogenetic 나무는 그것을 비교하는 데 사용할 수 있습니다 샘플은 동등하지 않은 크기에 따라 이항 샘플링 모델입니다. 의 차이점을 관찰하고 예상되는 계통의 다양성에 의해 결정 했을 계산하고 비교하는 z-에 대한 점수를 각각의 생태 클러스터입니다. 면 관 phylogenetic 미만 예상되는 다양성(아래−2),미생물 커뮤니티에서 생태학적 클러스터는 것으로 간주됩 phylogenetically 클러스터링을 의미하는 밀접하게 관련명 될 가능성이 있는 샘플링과 적극적으로 선택한 환경입니다.

구조 방정식 모델링 분석

SEM 은 IBM SPSS Amos21(Chicago,IL:Amos Development Corporation)을 사용하여 수행되었다. 그것을 평가하는 데 사용되는 직접 및 간접적인 효과를 토양의 물리 화학적 특성 및 상대적인 풍요의 주요 생태지 클러스터에 고정 요금. 토양의 물리 화학적 특성에는 토양 pH,총 탄소,총 질소 및 총 인이 포함되었습니다. 모델에서 치료법(대조군,npk,NPK+WS,NPK+PM 및 NPK+CM)은 1(특정 치료법)과 0(나머지 고려 치료법)의 두 가지 수준을 가진 범주 형 변수였습니다. 또한,부트스트랩 되었을 테스트하는 데 사용되는 확률이 경로 계수를 달랐다 zero,등의 변수가 정상적으로 배포됩니다. 우리는 또한 계산의 표준화 총 효과(항)의 토양 특성,수정 트리트먼트,그리고 근권에 영향 N 기정 평가를 원조의 해석 SEM.

임의의 숲 모델링 분석

임의의 숲 회귀분석(R 패키지”randomForest”)을 사용하였을 퇴보 정 OTUs 에서 다른 치료법. 10 배 교차 검증 방법은 N 고정 속도와 상관 관계가있는 최적의 Otu 세트를 결정하는 데 사용되었습니다. 위 목록 OTUs 기 위해서는 임의의 숲을 보고 기능을 중요성은 점수 달성에 있는 증가에 근거를 두 mean-square 오류의 질소 고정 요금 예측을 통해 100 반복의 알고리즘이 있습니다. 50 마커 OTUs 에 따라 선정되었 최소 평균 교차 검증을 제곱는 오류를 얻을 수 있었에서 다섯 개의 시련은 10 배 크로스 유효성 검사를 수행합니다.