실험 설계 및 연구시스템

2012 년,300 의 씨앗을 빠르게 순환 Brassica rapa 식물(위스콘신 빠른 식물 표준 씨앗,높은 유전 변이)에서 얻을 수 있었스 캐롤라이나 생물학적 공급품,그리고 성장에 phytotron 에서 표준화된 토양,빛과 물을 조건입니다. 이 식물은 완전히종간 교배(자기 호환되지 않)와 항구를 충분히 서있는 유전자 변형을 쉽게 반응하 selection58,59. 에서 이러한 300 식물,108 전체 sib 종자 가족들에 의해 생성된 인공 횡단(만 씨 가족이 십자가에서는 양쪽 부모가 생산한 과일이 사용되었). 이 108 개의 전체 sib 종자 가족이 실험의 시작 인구로 사용되었습니다.

을 위한 첫 번째 세대의 실험,세 개의 트리트먼트 그룹은 설립되었을 사용하여 108 가족하도록 각 가족을 표현했에서 각각 처리하여 제어를 위한 유전자 사이에서 트리트먼트(보충 Fig. 1). 각 치료에 따라서 구성되었 108 식물(나타내는 108 씨 가족),우리는 세분화된 세 가지로 복제(B,C)각 포함 36 식물입니다. 의 복제에 치료법으로 보관 절연인 동 9 세대(무 십자가 사이에 복제 수행되었)을 평가할 수 있는 독립,반복 가능한 진화의 변경합니다. 모든 처리에서 모든 복제물의 식물은 표준화 된 토양(Einheitserde classic),빛(24 시간 빛)및 물을주는 조건 하에서 phytotron 에서 재배되었다. 모든 식물은 세대 1 부터 시작하여 2 세대마다 표현형 화되었다. 1 세대와 3 세대의 꽃 향기 데이터는 기술적 인 문제로 인해 손실되었으며,대신 4 세대에서 향기가 수집되었습니다. 플로랄 향의 데이터를 1 세대 얻을 수 있었 종료 후의 실험으로 다시 성장하는 식물에서 시작 생성 및 수집하는 향기로서 하나의 공장에서 각각의 108 씨 가족입니다. 따라서,총 108 개의 식물(각 복제물로부터 36 개)에서 1 세대로부터 9 세대의 식물과 동시에 꽃 향기를 위해 샘플링되었다.

실험적인 진화하고 트리트먼트는 수분

에서 우리의 연구는 우리 사용되는 세 가지 수분 매개자료:벌(‘BB’,Bombus terrestris,생물학적 방제,안데르마트,스위스),한 hoverflies(‘HF’,Episyrphus balteatus,카츠 생명 공학 AG,독일),그리고 손으로 수분. 모두 곤충 쉽게 방문 꽃의 많은 십자화과 종 자연에,하지만 나타내는 다른 기능의 수분자 범주고,다음과 같은 다양에서 풍부한 자연 habitats46. 단일 수분 매개자 종의 사용은 가장 풍부한 수분 매개자가 기능적으로 다른 수분 매개자 환경을 모방합니다. 대조군 처리(‘CO’)에서 무작위로 선택된 식물을 손으로 교차 수분시켰다.

수분이 수행되었 23 일 후에 파종에서 항공편을 감금소(2.5m×1.8m×1.2m)온실에서 표준화된 빛 조건으로벌고한 hoverflies. 실험은 0900 시간에서 1,500 시간 사이에 수행되었다. 땅벌은 온실에서 별도의 비행 케이지에서 개최되었습니다. Hoverflies 는 번데기로 구입하여 수컷과 암컷 파리가 분리 된 후 부화 할 때까지 양육되었습니다. 자들 수 있었 사료에 빠르고 자전거 B.rapa 식물(식물의 통제는 그룹의 각각의 세대)및 공급 추가 꽃가루가 될 때까지 3 일간 전에 수분을 처리,나만의 꽃가루,설탕 솔루션을 제공했으며,16h. 기 전에 수분,매개자들은 굶주렸다.

수분을 위해,모든 식물의 복제 중 하나가 무작위로 배치된 광장에서의 6×6 는 식물의 거리와 함께 20cm 에서 각각 다른 비행에서 케이지입니다. 다섯 매개자가 추가되었는 개별적으로 순차적으로 각 곤충을 방문은 최대의 세 가지 다른 식물 및 그 제거에서 케이지,각각의 곤충이 사용되었습니다. 전체적으로 복제 당 12-15 개의 식물이 수분 매개자에 의한 하나 이상의 방문을 받았다. 전체 평균(±s.d.) 번호 방문의(에서 많이 방문한 식물)었 1.35±0.63 에 대한 꿀벌 수분이 식물과 1.28±0.53 에 대한 꽃등에과 수분의 식물이 있습니다. 방문한 식물의 경우 방문 횟수와 방문한 꽃의 수를 기록했습니다. 컨트롤 그룹에서 12 식물들이 무작위로 선택된당 복제 및 5 개의 꽃이 각 공장의 손으로 수분에 의해 하나 무작위로 선택한 아버지 식물;아버지가 선정되었 중에서 같은 12 식물입니다. 각 식물은 하나 이상의 식물에 꽃가루 기증자가 될 수 있었지만 한 식물에서만 꽃가루를 받았다. 수분 후,방문한 꽃은 표시되었고 식물은 과일이 수집 될 때까지 추가로 30 일 동안 새장에 보관되었다. 씨앗은 계산하고 상대 씨 설정되었에 대해 계산된 각 공장에 의해 나누어는 개별 종자에 의해 설정된 의미 씨앗에 복제됩니다. 또한,방문한 각 식물에 대해 과일 당 씨앗 수를 계산했습니다. 각 식물에 대해 남성 체력은 예측 된 친자 관계(꽃가루 수출 사건 수)로 추정되었다.

지에서 씨앗의 생산에 의해 수분 꽃,하위 집합의 씨앗을 대표의 씨앗을 생산의 각각의 개별하는 데 사용되었 성장하는 다음 세대입니다. 더 많은 씨앗 공장 생산이 더 씨앗에 기여하는 다음 세대,이는 다시 이루어져 36 식물을 위해 각 복제됩니다. 차세대로 방문한 각 식물의 종자 기여도는 모든 복제물에 대해 다음과 같이 계산되었습니다: 36/(종자/개별 종자 세트의 합 복제). 0.5 이하의 값은 1 로 반올림되었습니다.

근친 우울증

근친 우울증에 걸쳐 실험 계량을 측정하여 종자량 및 발아율,후자의 백분율로 germinated 당 복제됩니다. 제어에 대한 특성으로 인한 변경 사항 근친 우울증,씨앗에 의해 생성물의 9 차세대 성장했(나타내는 10 세)및 수동으로 사이에서 교차하는 복제에서 트리트먼트,그래서는 식물의 각 복제었 꽃가루 기증자와 꽃가루받는 사람을 위한 식물의 두 개의 서로 다른 복제(♀A-♂C,♀B-♂A,♀C-♂B). 이러한 복제 조합 내의 교차점은 무작위였습니다. 의 결과 씨앗(십대)개당 씨 가족 성장(36 식물을 복제)에서 동일한 조건으로 실험하는 동안. 이러한 복제 간 교차점 중 형질을 다시 측정하고 치료군 간의 형질의 최종 비교에 사용했습니다.

식물 형질

꽃 향기를 포함한 대부분의 형질은 수분 전에,파종 후 19-21 일에 측정되었다. 꽃잎,폭 길이,밤의 길이와 꽃의 지름 세 무작위로 선택된 당 꽃 공원으로 측정하는 전자 캘리퍼스(디지털 방식으로 캘리퍼스 0-150mm,생산합). 더 보기에 세 가지 꽃었으로 수집 1µl 마이크로 모세관(Blaubrand,베르트,독일)볼륨에 의해 결정됩의 길이를 측정원에서 열 micropipette 캘리퍼스. 정량화를 위해 3 개의 꽃의 평균이 사용되었습니다. 157 식물 균등하게 분할 치료,설탕의 콘텐츠 더 보기로 결정했을 사용하여 derivatization 및 가스 크로마토그래피 분석합니다. 그렇게하기 위해,과즙은 실리카겔에 저장된 여과지로 전달되었다. 이 부문에 여과지를 포함하는 꿀에서 잘 나머지 필터의 종이와 더 보기했 eluted in1ml 높은 순수성 Mili-Q 물에 흔들어 희석에 대한 90min400r.p.m 입니다. 60°C 에서는 실험실이커. 그 후 50µl 의 솔루션이 건조에서 60°C derivatized100µl 혼합물의 무수의 피리딘(Fisher Scientific,길,벨기에),hexamethylsilazane(Sigma-Aldrich,부츠스,스위스)및 trimethylchlorosilane(Sigma-Aldrich,부츠스,스위스)(10:5:3)입니다. 이어서,샘플은 ref 에 설명 된대로 GC-MS 에 의해 실행되었다. 32. 우리는 계산 된 총설탕은 양 당 꽃과 꽃차례의 합으로 모든 다른 당분(과당,포도당,자당 및 소르비톨). 사이의 상관 관계라는 설탕과 더 보기량이 긍정적이고 높은(r156=0.732,P<0.001)에 따라서,나머지 식물,만원 볼륨을 결정하였습니다. 꽃 향기 수집은 적어도 5 개의 꽃이 열려 자마자 모든 식물 꽃차례에서 비파괴적인 방법으로 생체 분석 전에 이루어졌습니다. 우리는 푸시-풀 시스템과 함께 헤드 스페이스 수착을 사용했습니다.59,60. 식물의 화서는 이전에 sigmacote(Sigma-Aldrich)로 코팅 된 유리 실린더에 동봉되어 테프론 판으로 닫혔다. 열린 꽃의 수는 각 식물에 대해 계산되었습니다. 주변으로부터의 공기는 100ml min−1 트로프 활성탄 필터의 유속으로 유리 실린더로 밀려 들어갔다. 동시에는 공기에서 당겨졌다 유리를 가진 실린더의 흐름율 150ml min−1 통 유리관으로 가득∼30mg Tenax TA(60/80 메쉬;Supleco,벨폰테,PA,미국). 빈 유리 실린더의 공기는 공기 조절 장치로 수집되었습니다. 꽃 휘발성은 표준화 된 빛 및 온도 조건 하에서 피토 트론에서 2 시간 동안 수집되었다. 의 정량화 휘발성 물질에 의해 실시되었 가스 크로마토그래피와 질량 선택적 검출(GC–MSD). 샘플 주입 GC(Agilent6890N;애질런트 테크놀로지스,Palo Alto,CA,미국)의 다목적 샘플러(MPS;Gerstel,Müllheim,독일)을 이용하여 Gerstel 열 탈착 장치(TDU;Gerstel)가 감기 분사 시스템(CIS;Gerstel). 열 흡수를 위해,TDU 를 60°c min-1 의 속도로 30 내지 240°c 에서 가열하고 최종 온도에서 1 분 동안 유지 하였다. CIS 는 TDU 로부터 용출 화합물의 포획 동안 -150°C 로 설정되었다. 주입의 경우,cis 를 12°C s−1 의 속도로 250°c 로 가열하고,최종 온도를 3 분 동안 유지 하였다. GC 는 HP-5 컬럼(0.25mm 직경,0.25μm 필름 두께,15m 길이)을 장착하고,헬륨은 2ml min−1 의 유속에서 캐리어 가스로 사용되었다. 화합물 식별 및 정량화는 애질런트 MSD ChemStation 프로그램으로 60 에 이어 수행되었다. 화합물의 정량화는 개별 향기 화합물에 특이적인 선택된 표적 이온의 피크 영역의 측정을 통해 얻어졌다. 특정 표적이온에서 얻을 수 있었 합성 표준의 모든 화합물;피크 지역로 변환되었습니다 절대 금액을 사용하여 보정 곡선 이전에 취득한 각 화합물을 사용하여 합성 화합물에서 세 가지 농도. 만 향기 화합물에 존재하는 상당히 높은 금액 이상이 공중에 제어에 포함되었던 분석(에서 총 14 개의 향기 화합물). 모든 양의 휘발성은 꽃 l−1 샘플링 공기 당 pg 로 계산되었다.

파종 후 이십삼일,수분을 수행 한 같은 날에,개방 꽃의 수와 각 식물의 높이를 기록 하였다. 후 수분(그러나 같은 날)컬러 스펙트럼 반사율의 세잎에서 다른 unpollinated(가능할 경우)꽃당 식물이 기록되었을 사용하여 광섬유 분광광도계(AvaSpec-2048; 아반테스,아펠 도른,네덜란드)및 크세논 펄스 광원(AvaLight-XE;Avantes). 하나 꽃잎은 시간에 배치에서 분광광도계(체에 초점을 맞추고 원심분의 꽃잎)과 비율 반사율(상대적으로 백색 기준)200 900nm 모든 0.6nm 기록되었에서 전송 모드입니다. 스펙트럼의 측정,만의 평균 값을 반사율 10nm 에서 260 650nm 에서 세잎에서 사용 되었습니다. 식물의 열한번째 세대,하위 집합의 캘리포니아 당 20 식물에 복제 분석되었습니다.에 대한 컬러,이 없기 때문에 색상을 개 발견되었에서 선택을 통하여 실험한다. 지역의 자외선을 흡수하고 꽃잎을 반영하 표면 측정 하에서만 식물의 세대 11 와 자외선에 민감한 디지털 카메라와 렌즈. 꽃의 사진을 촬영했고 자외선을 흡수하는 지역량을 사용하여 소프트웨어 패키지 ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/).

수분자 취향 분석 실험

분석 실험을 위해 수분자 환경 설정이 실시되었다 각 복제와 함께 두 종류의 매개자. 각 복제물에 대해 두 가지 행동 분석법이 수행되었습니다(각 수분 매개자에 대해 하나씩-치료). 꿀벌과 꽃등에과 수분 식물(생성 11)각각의 복제로 쌍 placed side-by-side(캘리포니아 30 센티미터 거리)항공기 감금소(2.5m×1.8m×1.2m). 한 명의 수분 매개자를 새장에 넣고 한 식물을 방문 할 수있었습니다. 수분 매개자는 그들이 선택을 한 후에 즉시 잡혔다. 각 식물 쌍은 하나의 수분 매개자로 분석되었다.

자기 호환성 및 자율 selfing

을 테스트하는 자기에 대한 호환성,우리가 성장 식물에서 처음(15 식물을 복제)과 열한번째 세대(30 식물을 복제하). 종자 가족 당 하나의 종자(무작위로 선택된 가족으로부터)가 재배되었고 식물 당 두 개의 꽃이 anthesis 에서 selfed 했다. 각 개별 식물에 대한 자체 꽃 당 생산 된 종자의 평균 수는 자체 호환성의 측정으로 사용되었습니다.

에 대한 테스트 자율 selfing,우리가 성장 ca12 식물(중 하나 씨 가족당)※복제에서 모든 치료의 세대 11 1(총 162 식물). Ca20 꽃이 열렸을 때 30 일 후,각 식물의 나머지 꽃 봉오리를 조심스럽게 자르고 열린 꽃의 수를 기록했습니다. 그런 다음 식물에 접근하는 곤충이 없어도 과일을 개발할 수있었습니다. 과일의 숙성 후,종자를 수집하고 종자의 수를 계수하고 각 식물에 대해 무게를 측정 하였다. 열린 꽃 당 과일 수와 과일 당 씨앗의 수는 자율적 인 selfing 에 대한 측정으로 사용되었습니다. 몇몇 식물은 열린 꽃 당 과일 수가 매우 많았 기 때문에 자율적 인 selfing 의 최종 비교를 위해 이러한 이상 치를 삭제했습니다. 다음 수의 아웃 라이어가 삭제되었습니다:세대 1 에서 1;G11 에서:BB 에서 2,HF 에서 3,CO 에서 2.

통계 분석

표현형 선택을 분석하기 위해 traits61 에 식물 체력을 회귀시킴으로써 선택 차이 및 구배를 계산 하였다. 이 분석은 치료에 대해 별도로 수행되었지만 모든 복제 및 세대가 결합되었습니다. 체력 추정치로’방문 수’가 사용되었는데,이는 계산 변수였으며 포아송 분포를 따랐습니다. 또 다른 피트니스 variable,’상대 씨앗을 설정했다 distibution 편견에 의해 많은 영 값 외에,종자 설정을 놓쳤지만 남성 피트니스 구성 요소의 첫 번째 공장을 방문하는 설정하지 않은 씨앗에서 이번 방문(기 때문에 매개자 처음에는 수행하지 않았다 브라 꽃가루가). 방문자 수,그러나,강력하게와 상관 상대 씨 설정(BB:r626=0.694,P<0.001;HF:r605=0.597,P<0.001). 일반화 선형 모형(포아송과 배급)를 계산하는 데 사용되는 선택을 그라데이션(복수)그리고 차이(량)에 대한 모든 치료와 숫자의 방문으로 종속 변수와 특성에 관심으로. 또한,이차의 선택 그라디언트가 계산되었는 모든 특성과 제곱 용어는 각각의 특성에 추가 모델,그리고 이후 그라디언트 doubled62. 인의 차이에 대한 선택 사벌고한 hoverflies,일반적 선형 모형(포아송과 배급)와 숫자의 방문으로 종속변수 처리로 고정된 요인,식물의 특성으로 관심과의 상호작용 처리*공장의 특성을 수행 했습니다. 선택 분석 전에 모든 변수는 복제 수준에서 평균=0 및 s.d.=1(Z-값)으로 표준화되었습니다. 일반화 선형 모델을 사용하였을 비교 방문에 요금이 꿀벌과 꽃등에과 수분이 식물에서 모든 세대입니다. 플로랄 컬러 분광 광도계 값은 varimax 회전으로 pc(principal component)분석을 통해 감소되었습니다. 하나 이상의 고유 값을 가진 Pc 만 분석에 사용되었습니다.

진화의 변경에 식물을 특성 평가에서는 식물의 11 세대를 사용하여 복수 선형 판별 함수를 분석하고 변량 일반적 선형 모형(GLM). GLM 의 경우 각 형질을 종속 변수로 사용하고 무작위 요인으로 복제하고 lsd post-hoc 테스트로 고정 요인으로 처리했습니다. 표류로부터 자연 선택의 영향을 차별하기 위해,우리는 주어진 수분 처리의 복제간에 형질 차이가 일치하는지 평가했다. 에 GLM 분석 중요한’치료 효과를 나타냅 특성의 차이 다른 수분자 그룹의 모든 복제,따라서 차별 수분자 특정 진화에서 드리프트. 드리프트 것으로 표시 진화적 변화에서 일(random)만 복으로 표시되는 의미에서 인자’복제’또는 간의 상호 작용을’복제’and’치료’. 자체 호환성과 자율 selfing 도 GLM 에 의해 평가되었지만 1 세대 식물의 가치는 분석에 포함되었습니다. 휘발성 및 과즙 부피의 분석을 위해,데이터는 정규 분포에 접근하도록 변형 된 ln(1+x)이었다. 색상 변수가있는 GLM 의 경우,위에서 설명한대로 pc 분석을 수행했지만 변수의 사전 표준화없이 수행되었습니다. PC 분석은 모든 치료,복제 및 모든 세대에 대해 함께 수행되어 총 분산의 96.9%를 설명하는 4 개의 Pc 가 생성되었습니다. 의 주파수 nectarless 꽃이었 분석에 대해 별도로 각 세대를 사용하여 일반화 선형 모형으로 모달 분포,의’존재의원'(예/아니오)을 종속변수,그리고 치료제로 요인입니다. 특성에 nectariferous 및 nectarless 꽃들과 비교에 대한 아홉 번째 열한번째 세대를 함께 사용하여,일반 선형 모델의 특성으로 종속변수,그리고 존재의원’과 치료로 고정된 요소입니다. 범블비와 호버 플라이의 첫 번째 선택 환경 설정은 이항 테스트(test-prop=0.5)로 분석되었습니다; 모든 복제 풀링). 사이의 상관 관계원 및 식물의 특성들에 대해 계산된 모든 세대를 사용하여 결합 Pearson 제품간의 상관관계를 ln-변환되는 값입니다. 통계는 IMB SPSS 통계(버전 20.0.0,http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/)로 수행되었습니다.

데이터 가용성