소개

Halophiles 는 재미있는 그룹의 미생물에서 번성하 고 염분. 이러한 유기체들 수 있는 광범위하게 분류된 기반에 최적의 염분을 위한 성장으로 온화한 halophiles(1-6%,w/v NaCl),온 halophiles(7-15%)및 극단적인 halophiles(15-30%)(Madigan 및 Martinko,2006). 광범위한 연구에 따르면 halophiles 는 생명 영역 중 하나에 국한되지 않으며 진핵 생물 일 수 있습니다(Gunde-Cimerman et al.,2000;잘 라르 외.,2005),또는 박테리아 및 Archaea 의 도메인에 속하는 원핵 생물. 조류 속 Dunaliella 와 소금물 새우 Artemia(Boetius and Joye,2009)는 halophilic 진핵 생물의 예 인 반면,Halobacterium 과 Salinibacter 는 halophilic 원핵 생물의 예입니다. 성공의 halophiles 에서 살아남은 높은 짠 환경으로 인해 독특한 생리학적 적응을처럼,이온 펌핑 전략과 유기 용질의 축적(Oren,2006;Madigan 및 Martinko,2006). 에 genomic and proteomic 수준,halophiles 에 의해 특징지어지는 높은 GC 내용과 단백질의 특징으로 적은 소수성을 통해 표현의 산성 잔류물,더 낮은 성향의 나선 형성하고 더 높은 경 코일의 구조물(폴 et al., 2008).

Halophiles 은 지금보에 액세스 산업 미생물학 및 생명공학기 때문에 halophiles 성장에서 높은 소금을 집중하고 이의 위험을 최소화 하는 동안 오염 재배(오렌,2006). 생명 공학 응용 프로그램의 몇 가지 예는 뉴 클레아 제 H(Kamekura el al.,1982)의 사용은 고정 Tetragenococcus 균주에서 생산의 간장과 생산의 일부는 효소를 포함하여 hydrolases(amylases,nucleases,가수분해와 프로테아제)(오렌,2006). Halophiles 는 또한 많은 halophiles 가 탄화수소 및 기타 독성 화합물을 분해 할 수 있기 때문에 생분해 및 생체 변형에 중요합니다(Ventosa et al., 1998). Halophiles 는 또한 계면 활성제 활성 및 생물 유화 특성(Oren,2006)때문에 오일 회수 증강제로 사용되는 중합체를 생산할 수있다.

Halophiles 는 바다,태양 salterns 및 천연 소금 호수와 같은 염분이 높은 수준에 도달하는 환경에서 번성합니다(Oren,2007). 요르단의 사해는 세계에서 가장 큰 진정한 하이퍼 살린 내륙 소금 호수 중 하나입니다(Boetius and Joye,2009;Oren,2007;Madigan and Martinko,2006). 높은 염분 이외에; 소금,의 농도가 340g L-1(Oren,2007),해 독특한에 의해 그것의 높은 기압(800mmHg)인해 매우 낮은 고도는 해수면 아래 부분한 산소압(PIO2)의 8%이상이 바다에서 수준을,독특한 자외선,낮은 습도(40%)고 소수의 비(Avriel et al., 2011).

본 연구는 요르단의 사해의 연안 지대에서 번성하는 할로 친성 이종 영양 세균 종을 분류하기 위해 수행되었다. 미생물 분류는 식민지 및 세포 형태학뿐만 아니라 16s rRNA 유전자의 유사성을 기반으로합니다.

재료 및 방법

샘플링 죽은 바다 물은 샘플에서 수집되었 네 littoral 영역(Fig. 1)2011 년 3 월,6 월 및 10 월에. 샘플링 사이트의 지리적 좌표와 상승은 표 1 에 나와 있습니다. 지리적 좌표와 고도는(eTrex Legend C,Taiwan)에 의해 각 위치에 대해 결정되었습니다. 사해 물 샘플을 1 리터 깨끗한 멸균 유리 병에 수집하여 병에 충분한 헤드 공간을 남겨두고 즉시 실험실로 운반했습니다.

샘플의 물리 화학적 분석: 물 샘플의 온도,pH,총 용존 고체(TDS)및 생물학적 산소 요구량(BOD)을 결정 하였다. 물 온도,pH 및 염분을 현장에서 측정 하였다. 물 온도 및 ph 는 휴대용 pH 미터(마이크로컴퓨터 pH 미터 T19000,Trans 계기)에 의해 측정되었습니다. 염분은 핸드 헬드 염분 굴절계로 측정되었습니다. BOD 는(요르단 Al al-Bayt University 의 물,환경 및 건조한 지역 연구 센터)에서 측정되었습니다. 물 샘플을 전송하는 새로운 유리병 후,1mL of phosphate buffer,황산마그네슘,칼슘 염화철 염화 솔루션 리터당 물 샘플이 추가되었습니다. 그런 다음 샘플을 온도 20±3°C 로 가져오고 유기물이없는 여과 공기로 포화시켰다. 샘플의 pH 를 검사 하였다. 샘플의 경우에 없었의 범위는 6.5~7.5,황산 또는 수산화나트륨 추가되었다을 가지고 샘플을 필요한 pH 범위(6.5-7.5)및 농도 추가하지 않았다 희석한 샘플 이상 0.5%. 희석을하기 전에 샘플을 온도 20°C 로 가져 왔습니다. 시료의 적당한 부피는 그 다음 몸체 병으로 옮겨졌다. 병은 거품을 남기지 않는 모든 공기를 전치하기에 충분한 희석 물으로 채워졌다. 용존 산소(DO)는 DO 분석기를 사용하여 결정되었고,변위된 내용물은 희석 물 및 스토퍼로 단단히 대체되었다. 병을 20℃에서 5 일 동안 배양하고,그 후,DO 를 결정하고 bod 를 초기 및 최종 DO 오버 체적의 차이를 따르는 것으로 계산 하였다.

농축,고립과 그람 염색: 을 풍요롭게 물 샘플을,죽은 바다 물(10mL)으로 옮겨졌 90mL 액체의 높은 염분 중간 및 종묘에는 30°C 에서 어둠 속으로 흔들(100rpm). 약 12 시간 후에,농축 배양의 loopful 을 변형 된 고체 미네랄 염 배지에 줄무늬로하고 분리 된 콜로니를이어서 서브 배양 하였다. 단리물의 글리세롤 스톡은 또한 추가 분석을 위해 -20℃에서 제조되고 저장되었다. 세포를 그람 염색하고 현미경으로 검사 하였다.

16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 분석:16S rRNA 유전자 증폭 시퀀스와 시퀀싱에 의해 수행되었 칩 Inc. 서울,대한민국,에 따라 다음과 같은 방법:젊은이의 식민지 세균 균주들에서 1.5㎖원심 분리기 튜브 포함하는 0.5mL 멸균 염 다음 원심 분리에서 10,000rpm for10min 상층액을 제거하고 펠렛 중지에서 0.5mL InstaGene 매트릭스(Bio-Rad,미국)및 종묘에서 56°C 에 대한 30 분 그리고 가열하는 100°C 에 10min. 가열 후,상청액을 PCR 에 사용 하였다. PCR 은 1μl 의 템플릿 DNA 와 20μl 의 PCR 반응 용액을 혼합하여 수행 하였다. 27F/1492R 프라이머(27F:5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′,1492R: 5’-탕 GGY 탕 CTT GTT ACG ACT T3’)를 사용한 증폭 다음 35 증폭 사이클에서 수행되었 94°C45sec,55°C60sec72°C60 초입니다. 되지 않은 다 프라이머를 PCR 및 dNTPs 에서 제거되었 PCR 제품 몽타주 PCR 청소 장비(Millipore). 약 1,400bp 의 정제된 PCR 생성물을 518F/800R 프라이머(518F:5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’,800R:5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’)에 의해 서열화하였다. 시퀀싱은 Big Dye terminator cycle sequencing kit v.3.1(APPLIED BioSystems,USA)을 사용하여 수행되었습니다. 시퀀싱 제품은 Macrogen,Inc.의 Applied Biosystems model3730XL automated DNA sequencing system(APPLIED BioSystems,USA)에서 해결되었습니다.,서울,한국.

서열을 분석하고 ncbi BLAST 웹 사이트(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 사용하여 공개 뉴클레오티드 데이터베이스와 비교 하였다. 그런 다음 가장 가까운 친척의 서열을 데이터베이스에서 검색하여 MEGA5 를 사용하여 계통 발생 트리를 구성하는 데 사용했습니다(Tamura et al., 2011). Gc 내용 서열은 Oligo Calculator(http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL)에 의해 계산되었다.

결과

의 물리 화학적 특성에 샘플 죽은 바다 물 샘플을 매우 염수에 이르기까지(36-38%). 샘플의 pH 값은 낮았으며 5.6 에서 6.3 사이였다. 이것은 해수의 약간 산성 인 물성을 나타냅니다. BOD 값은 샘플에서 매우 낮은 유기 물질 함량을 나타내는 매우 낮았다(1-2mg O2L-1). 물리 화학적 특성은 표 2 에 나와있다.

Heterotrophic 가능한 세균수:의 결과를 실행 가능한 플레이트 계산 계시는 매우 낮은 수의 식민지를 형성하는 단위에서 각 샘플(200-6000CFU mL-1)입니다. CFU 수는 표 3 에 더 자세히 나와 있습니다.

halophilic heterotrophic 박테리아의 분리 및 분류:이 연구에서,우리는 44 개의 halophilic heterotrophic 박테리아 균주를 분리했다. 일레븐 박테리아 균주의 44 었는 다른 것으로 간주됩 기반으로 식민지 시대 형태,그람 염색 및 세포 형태입니다. 11 개의 다른 균주 중 7 개는 그람 양성이었고 7 개 중 4 개는 그람 음성이었다. 박테리아 균주는 16S rRNA 유전자 분석에 기초하여 확인되었으며 박테리아의 도메인에 속하는 것으로 밝혀졌다. 각 분리 된 박테리아 균주의 가장 가까운 친척은 표 4 와도 1 에 도시되어있다. 2. 모든 서열은 상대적으로 높은 GC 함량(최대 58%)을 나타냈다.

토론

의 물리 화학적 특성에 죽은 바다 물 샘플이 결정되었고 분석합니다. 염분 비율은 매우 높은 것으로 나타났습니다(최대 38%). 이것은 유명한“athalassohaline”brines(oren,2007)중 하나를 만드는 사해의 물 전형적인 특징입니다. 사해의 물 pH 는 탈라소할린 브라인(Oren,2007)의 pH(7.5-8)와 비교하여 약산성(5.6-6.3)인 것으로 밝혀졌다. 샘플의 BOD 는 heterotrophic 박테리아에 의해 이용 될 수있는 물 속의 낮은 유기 물질을 반영하는 매우 낮았다(1-2mg O2L-1). 이러한 물리 화학적 조건은 의심 할 여지없이 미생물의 다양성에 부정적인 영향을 미친다. 따라서 시험 된 물 샘플에서 생존 가능한 세포의 수는 개방 해수에 비해 매우 낮았다(6X102CFU mL-1 이하). 해양 물에서의 이종 영양 박테리아의 수는 일반적으로 105 내지 106 박테리아 mL-1 의 순서이다(Zweifel and Hagstrom,1995;Madigan and Martinko,2006). 이러한 숫자에서 파생되는 불특정 형광성 염색 기술(Zweifel 및 Hagstrom,1995)는 일반적으로 높은 숫자보다는 실행 가능한 플레이트 계산 방법이다. 사해에서의 세균 수에 관한 첫 번째 간행물은 현미경으로 이루어졌습니다. 세포 수는 약 1 이었다.9×106 세포 mL1 과 붉은 halobacteria 의 꽃 동안 인구 밀도는 1.9×107 에 도달하지만 5×106 에 나방 후 감소(오렌,1983).

사해에 서식하는 halophilic 생물에 대한 연구는 박테리아가 진흙(Oren,2002)에서 Clostridium 속으로부터 분리 된 1892 년에 매우 일찍 시작되었다. 나중에,짧은 문서에서 게시 1936 년에,그의 첫 번째 설명하는 원주민 미생물 커뮤니티에 적응이 매우 가혹한 조건의 죽음의 바다(오렌와 벤토사,1999). 그 이후로 사해의 생물학적 측면에 대한 우리의 지식은 확대되고 축적되고 있습니다. 우리는 실시 이 연구는 우리의 지식을 확장에 대한 고정 heterotrophic 박테리아에서 번성 연안 지역의 요르단입니다. 우리는 다른 박테리아 종을 분리했습니다. 그 후,우리는 11 종의 다른 할로 픽 박테리아를 분리하고 확인했다. 대부분의 분리 물은 그람 양성이었다(11 개 중 7 개). 비록 그람 양성균 민병대 중요한 적응은 높은 염분(Battistuzzi and Hedges,2009)과 같은 환경 스트레스로 쿠데타를 가능하게한다. 그람 양성균이나 그람 음성균이 하이퍼 살린 환경에서 지배적인지 여부는 문헌에서 분명하지 않다. 튀니지의 얕은 El-Djerid salt lake 에서 퇴적물로부터 회수 된 원핵 생물 halophiles 에 대한 한 연구에서 Hedi et al. (2009)는 지배적 인 박테리아 집단이 그람 양성 포자 형성 박테리아에 속한다는 것을 발견했다.

본 연구에서 분리 된 균주는 모두 박테리아의 영역에 속한다. 그들은 도메인에서 7 개의 다른 속에 속합니다. 그람 양성 세균 분리 물 7 개 중 5 개가 바실러스 속에 속합니다. 이 속은 1872 년에 세 종을 포함하도록 설립되었지만 현재 Bergey 의 체계적인 세균학 매뉴얼(Logan and de Vos,2009)에 나열된 142 개의 명명 된 Bacillus 종이 있습니다. 바실러스 균주는 전형적으로 토양 균주이다. 균 균주에서 고립 된 이 연구에 속하는 다음과 같은 종 B.licheniformis,B.pumilus,B.hwajinpoensis 및 B.cereus. 이 균주는 다른 짠 환경에서 발생했다(Miranda et al.,2008;Parvathi 외.,2009;윤 외.,2004;Al-ZaZaee et al., 2011). 예를 들어,B. licheniformis 는 이전에 miranda et al.에 의해 해양 퇴적물로부터 회수되었다. (2008),B.pumilus 는 Parvathi et al.에 의해 퇴적물 이외에 굴,게 및 물고기와 같은 해양 생물로부터 분리되었다. (2009). B. 화진포엔시스는 우리나라 동해와 황해의 해수에서 회수되었다(윤외., 2004). 그리고 마지막으로 일반적인 토양 박테리아 인 B.cereus 는 하수도 물에서는 발생했지만 halophilic 성질을 가지고 있었다(Al-ZaZaee et al., 2011). 세포벽 두께,고 peptidoglycan 콘텐츠(90%이상의 세포벽)(Madigan 및 Martinko,2006),고 GC 콘텐츠와 저항하는-포자 형성하는 주된 이유에 대한 세균의 생존 가혹한 조건에서 다음과 같이 높은 염분. 주목해야 한다는 부담 DSD32(으로 식별 B.cereus)는 매우 낮은 유사성으로 그것의 가장 가까운 친척 B.cereus. 이 균주는 16s rRNA 유전자에 기초한 바실러스 속의 새로운 종을 나타낼 수있다.

다른 두 그람 양성균은 Arthrobacter sp 의 균주입니다. 그리고 Kocuria rosea. Arthrobacter 종은 자연에서 특히 토양에 널리 분포되어있다(Funke et al.,1996)그러나 하이퍼 살린 환경에서는 매우 흔하지 않습니다. Kocuria rosea 으로 간주됩 적당히 고정 종와 복구에서 다른 식염수 환경 염분을 열고 얕은 물과 몇 가지 긴장의 Kocuria rosea 성장하는 최적의에 염화나트륨의 농도 30%(라 Tanaka,2002).

그람 음성균은 우리 샘플에서 덜 빈번했다(11 개 중 4 개). 그럼에도 불구하고 출판 된 문헌은 이러한 단리가 짠 환경에서 드문 일이 아니라는 것을 보여줍니다. 분리 된 균주 중 하나가 Vibrio alginolyticus 로 확인되었습니다. 후자의 종은 실제로 해양 샘플에서 흔하다(Molitoris et al.,1985)및 해양 물 발생 했다. 균주는 복잡한 피부 및 연조직 감염을 일으킬 수 있기 때문에 의학적 중요성을 갖는다(Sganga et al., 2009). 더 중요한 것은,vibrio alginolyticus 의 일부 균주는 강력한 신경 독소 인 tetrodotoxin 을 생성하는 것으로 밝혀졌다(Noguchi et al., 1987). 이 연구에서 확인 된 또 다른 그람 음성 박테리아는 Chromohalobacter salexigens 입니다. 이 종은 먼저 분리되어 적당히 halophilic 종 Halomonas elongata 로 묘사 된 다음 Chromohalobacter 의 새로운 종으로 제안되었다(Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli 는이 연구에서 확인 된 또 다른 종입니다. 이 균주는 염분 서식지에서도 드문 일이 아닙니다. 최근 한국에서 황해의 갯벌 평지에서 분리되어 윤등에 의해 할로필릭종으로 기술되었다. (2005). 마지막 변형은 Salinivibrio costicola 에 속합니다. 이 종은 Vibrio costicola 로 처음 기술되었지만 표현형 및 유전형 특성은 Vibrio 속의 종과 구별되었습니다. 따라서,균주는 Salinivibrio(Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola 는 적당히 halophilic 이며 원래 소금에 절인 음식에서 분리되어 10%염을 함유 한 배지에서 최적으로 자랍니다(Mellado et al., 1996). Salinibacter 속의 일원 인 S.ruber 는 높은 소금 농도에서 미생물의 삶에 대한 적응 연구를위한 흥미로운 모델이다(Oren,2007).

결론

죽은 바다 물에서 해안 지역은 특징으로 높은 염분,낮은 pH,낮은 유기농 자료의 내용(저 BOD)및 제지 서로 다른 종의 heterotrophic 박테리아에 속하는 모두 그램 양성하고 그램 음성 장군을 포함 Arthrobacter,Kocuria,비브리오,Salinivibrio,Chromohalobacter,세균과 Erythrobacter.

인정

이 연구에 의해 지원되었 deanship 의 학술 연구에서 알 al-Bayt 대학,요르단,결정의 과학적인 연구위원회 회의에서 수 2/2010/2011. 따라서 저자는 대학에서 제공하는 재정 지원에 감사 드리고 싶습니다.