繰り返し蓄積（RA）コーディング戦略とハイブリッドマッピングのイラスト。 （A）3つのソースパケットを持つレート\（\frac{1}{2}\）パケットレベルRAコードの例。 位置ｉのｉ番目のパリティパケットは、（ｉ−１）番目のパリティパケットと、ｉ番目のＸ−ＯＲノードに接続されたソースパケットとのビット単位のモジュロ−２和によって生成される。 (B)ハイブリッドマッピングのフローチャート。 各バイナリシーケンスは、最初はバイナリから四元へのマッピングを介してマッピングされます。 インターリーブパターンの一つでは，最後にフラグヌクレオチドが付加されたインターリーブ配列は，ＧＣ含量とホモポリマーをチェックするスクリーニング試験に合格し，有効な配列を出力することができる。 それ以外の場合は、元のバイナリシーケンスが可変長制約付き(VLC)マッピングに送信されます。 (C.i)(4,0,2)制約付きDNAストレージシステムのFSTD、ここで0、1、2、および3は、四つのヌクレオチドアルファベット間の遷移を示す四つの遷移シンボルを表し、s0、s1およびs2は、出力(4,0,2)制約付き配列における連続する0の長さ（遷移なし）を記録する三つの異なる状態を表す。 (C.ii)ハフマン符号化ツリーの生成。 Ｈｕｆｆｍａｎ符号化ツリーは，発生可能性の高いソースワードを短い長さと詩の副を持つ符号語に整列させることにより，符号率を最適化する。 (C.iii)VLCマッピングルール。 Ｈｕｆｆｍａｎ符号化ツリーの整列は，可変長ソースワードと可変長遷移コードワードとの間のルックアップテーブルを生成する。 (C.iv)受信したDNA配列の長さを介して二つのマッピングを区別するためにデコーダを有効にするための戦略。 (D)デコーダのフローチャート。 復号器は、最初に受信シーケンスが使用したマッピング方法を区別し、連想反転を実行します。 CRCチェックは、逆のバイナリシーケンスがエラーになっているかどうかを決定します。 その後、RAデコーダはエラーのすべてのシーケンスを回復するように動作します。 （Ｅ）マップされたＤＮＡ配列の長さの分布。 得られたDNA配列の長さは150ntから159ntの範囲であり、インターリーブされたマッピングは151ntの長さの配列のみを生成し、他の長さの配列はすべてVLCマッピ DNAマッピング戦略は、このようにストレージに安定性をもたらす、生化学的制約を満たすマッピングされたオリゴ配列を可能にす DNAデータには以下のような制約がある:(i)GC含量(シーケンス内のヌクレオチドの総数に対する’G’と’C’の総数の比率)は50%に近い必要がある(ii)すべてのホモポリマーラン長(繰り返し連続するヌクレオチドの長さ)は4未満でなければならない。 なお、二元から四元へのマッピング、すなわち、最適なマッピング電位（2bits/nt）を示す二つのビットを一つのヌクレオチドにマッピングすることは、必ずしも上記の要件を満たしているとは限らないことに注意してください。 代わりに、多くの場合、最大ホモポリマー実行制約に準拠していません。 DNAデータストレージに存在する制約は、DNAデータストレージの容量に悪影響を与える、効果的なマッピングの可能性を低減します。 したがって、我々は、高いコードレートで制約されたコードを設計するアプローチを検討し、オリゴ配列がマッピングの可能性の最小限の犠牲と生化学的要求を

このマッピングスキームは、インターリーブマッピングとVLCマッピングという二つの異なるマッピング方法で構成されています。 最初のものは、そのほぼ最適なマッピングポテンシャル、すなわち1のために主要なマッピングとして機能します。995bits/ntと後者のものは、最初のマッピングが有効なDNA配列（すなわち、GC含量およびホモポリマー実行制約を満たす配列）を生成するために失敗したときに 後のマッピング法では，補助ルックアップテーブルを低符号化および復号化の複雑さで構築する。 一方、この方法は、同等の複雑さを持つブロックコードよりもはるかに高い1.976ビット/ntマッピング電位を示す。 これら二つのマッピング戦略の組み合わせは、確率的データと1.98ビット/ntの周りの平均マッピング電位をもたらします。 言い換えれば、すべてのデータがVLCを使用してコード化される最悪のシナリオでは、高いマッピング電位推定値（1.976ビット/nt）を達成しました。 しかし、すべてのデータがインターリーブされたマッピングを使用してマッピングされる最良のケースでは、1.995bits/ntの非常に高い可能性を達成できます。

デジタルデータは、最初にDNA配列を生成するためにインターリーブされたマッピング方法を通過します。 インターリーブされたマッピング方法では、バイナリシーケンスは、最初にバイナリから四元へのマッピングを使用してマッ オリゴ長の増加に伴い，バイナリデータの確率的特徴のためにＧＣ含有量制約が満たされることが多い。 しかし、このマッピングは、ホモポリマー実行制約を満たすことができない傾向があります。 この問題を解決するために，塩基配列の元の順序をスクランブルする二元から四元へのマッピングの後にインターリーバを導入した。 インターリーブ後、スクリーニング試験が行われ、得られた配列のホモポリマーランをチェックする。 結果のシーケンスがテストに合格した場合、そのシーケンスは合成のための有効なシーケンスとみなされ、そうでない場合は、異なるインターリーブパターンで元のシーケンス上で再びインターリーブが実行されます。 この作業では、インターリーブパターンを示すために、インターリーブされたDNA配列の最後にフラグヌクレオチド（A/T/G/C）が追加された4つの事前定義されたインターリーブパターンを検討する（追加ファイル1：セクションS8）。 なお、添付のフラグヌクレオチドは、スクリーニング試験中の配列のホモポリマーランを決定する際に含まれる。 私たちは、高いネット情報密度を維持するために一つの余分な（フラグ）ヌクレオチドを使用します。 したがって、インターリーブ試行の数は4に制限されます。 シーケンスが最大試行数の後に要求を満たすことができない場合、シーケンスはVLCマッピング方法に送られる（図10a）。 2(B)および追加ファイル1:セクションS4)。

VLCマッピングは、可変長制約シーケンス（VLC）コードの構築に触発され、一般的にラン長制限とDCフリーの問題が発生する光記録システムのような制約 同様の制約が存在するDNA貯蔵シナリオでは、VLCSコードをマッピング方法に効果的に変更することができます。 エラー制御にパケットレベルのRAコードを使用するため、VLCコードによるエラー伝播は1つのパケットに制限され、エンコードされたシーケンスの全体的なドロップアウト率には影響しないことに注意してください。

このマッピングルールは、次の四つの段階で生成されました。 まず、最大ホモポリマー実行の制約を考慮して、DNAベースのストレージは、M=4、d=0およびk=2（追加ファイル1：セクションS5）で示される実行長制限（RLL）を持つ制約されたシステムとして見られた（M、d、k）。 これにより、（４，０，２）ホモポリマー拘束ＤＮＡデータ記憶装置の有限状態遷移図（ＦＳＴＤ）が生成された（追加ファイル１：セクションＳ５および図４）。 2(C,i))。 第二段階では、生成されたFSTDに基づいて、我々は、（4、0、2）ホモポリマー制約DNAストレージの容量が1.982ビット/ntであることを推定した（追加ファイル1：セクションS5）。 また、完全最小集合（連結が可能なすべての制約を満たすシーケンスを含む単語の有限集合）を確立し、図中の状態s0に由来し、終了するすべての単語を列挙した。 2(C,i). 結果として。 我々は、すべての要素が制約を満たし、接頭辞なしである最小集合{1,2,3,01,02,03,001,002,003}を得た。 これらの2つのプロパティは、このセットの要素を連結すると、制約付きシステムの潜在的な遷移コードワードである制約を満たすシーケンスが生成されることを保証します。 結果として得られる遷移符号語セットは、連結の深さと幅に関連することに注意してください。 符号化の複雑さを低減するために，完全最小集合を遷移符号語集合として直接使用した。

第三段階では、ハフマン符号化木を使用して、可変長バイナリソース語セットから上記の遷移符号語セットへの最適なマッピングを生成しました（図 2(C,ii))。 この最適な一対一の割り当ては、1.976bits/ntの平均符号レートを与えた（図。 2(C,iii)および追加ファイル1:セクションS5)を参照してください。 一方、この写像の効率は\(\sigma=\frac{1}{\sigma})に近づきます。{1.976}{1.982}=99.7\%\), 制約されたシステムの容量からわずか0.3％のギャップを提示する（4,0,2）。 マッピングポテンシャルの面では、このマッピングは、(4,0,2)制約コードがコードワードとして39nt DNAブロックを使用して構築され、1.95ビット/ntマッピングポテンシャルを達成するブロック制約コードよりも優れています。 さらに、39ntブロックコードは、はるかに長いDNA配列（コードワード）、すなわち200ntが考慮される伝統的なDNAデータストレージにとっても実用的ではない。 対照的に、可変長マッピングアプローチは、結果として得られるオリゴ配列の全体の長さに関係なく、低い符号化複雑さを有する。

最後の段階では、ソースワードを各バイナリシーケンスに対して連続して遷移コードワードにマッピングした後、状態変化関数yj=yj-1+xj(mod M)に従って符号化された四次シーケンスに対してプリコーディングを実行しました。yjは現在の出力プリコーディングシンボル、yj-1は最後の出力プリコーディングシンボル、xjは現在の入力シンボル、Mはシステムのアルファベットサイズです。 このプリコーディングは、エンコードされた(M,d,k)制約付きコードを(M,d+1,k+1)RLLコードに転送します。 次に、四元記号を{0,1,2,3}から{‘A’,’T’,’C’,’G’}に変換し、ホモポリマーが3ntよりも大きく実行されないという制約を満たす最終オリゴ配列を得た。 このマッピング戦略の例は、追加ファイル1:セクションS6で見つけることができます。

ハイブリッドマッピングスキームにより、バイナリデータストリームに対して150ntから159nt（プライマーサイトの40ntを除く）の長さ分布を持つ12,000個のDNA配列を生成した（図。 2(E))。 具体的には、インターリーブされたマッピングを介してマッピングされた配列の長さは151ntになり、VLCマッピングを介してマッピングされた配列の長さは150、152から159ntの範囲であった。 なお、これらの１ ５ １ｎｔマッピング配列を１ ５ ２ｎｔとするために１つのヌクレオチドを添加したため、ＶＬＣマッピングに由来する１ ５ １ｎｔの長さの配列はなかった（図１）。 2(C,iv))。 追加されたヌクレオチドは、マッピング方法を区別するためであった。 これにより、デコーダに格納されたデータのリカバリ中に正しいデマッピングを使用できます。

データを取得するために、シーケンス処理から準備されたシーケンスは、ユーザーデータを回復するためにデコーダに送信されます（図。 2(D))。 デコーダは最初にマッピング方法を区別します。 受信したシーケンスの長さが151ntの場合、デコーダはflagヌクレオチドとbinary-to-quaternary mapping ruleに基づいてinterleaved mappingの逆を適用します。 それ以外の場合、デコーダは、プリコーディングとマッピングの逆が実行されるVLCマッピングの逆を適用します。 その後、逆になった各バイナリシーケンスは、CRCチェックに基づいて正しいものまたは消去されたものとみなされます。 最後に，メッセージパッシングアルゴリズムを用いて，ＲＡ復号器はパケット間の接続に基づいて消去されたシーケンスパケットをすべて回復する。

シーケンス結果とデータ復旧解析

合成されたオリゴプールのシーケンスをシーケンスした後、NovogeneAITから10万以上の生シーケンス読み取りを合計3.2ギガバイト これらのシーケンスには、シーケンス中に生成されるノイズの多いリードが含まれます。 シーケンシング結果に基づいて，データ品質検査，Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃコンテンツ分布および誤り率分布の観点から，シーケンシングデータの信頼性を解析した。 次に，誤差解析結果に基づいて，異なるサンプルカバレッジを持つ符号化データを回復する際の復号方式の信頼性を研究した。

シーケンス結果

シーケンスされた読み取りに沿って各ベース位置の品質値を分析し、データ品質を評価しました。 品質スコアは、各ベース位置の誤り率に関連するシーケンスされた読み取りの信頼性の推定値です。 これは、Q=−10log10eによって計算されます。eはベース位置の誤り率です。 シーケンシング読み取りの各塩基の品質スコアは、30から40の範囲である（図10）。 図3(A))に示すように、高品質を表す。 さらに、エラー率はシーケンスされた読み取りの拡張とともに増加し、読み取りに沿った各ベースで平均率は0.015％であることが観察されます（図。 3(B))。 これは、Sequencing by synthesis（SBS）技術に基づいたIlluminaハイスループットsequencingプラットフォームで一般的な現象であるsequencing reagentの消費によるものである可能性があります。 予想されるように、最初のいくつかの塩基は、他の塩基よりも高い配列決定誤り率を有する。 これは、シーケンサの蛍光イメージセンサ検出素子の集束に起因する可能性があり、シーケンサの開始時に十分に敏感ではない可能性があります。 その結果、取得された蛍光読取の品質は低い。 配列は、両端に20ntプライマー結合部位のペアが付加されたことを思い出してください、したがって、最初のいくつかのエラーが発生しやすい塩基（約6nt） 言い換えると、シーケンスは、他の位置（プライマーの外側）のエラーのためにCRCデコーダによって消去されたものとして識別されます。

シーケンス結果の分析とデータ復旧。 （A）読み取りに沿った各ベース位置の品質値。 X軸の前半部分は読み取り1用で、後半部分は読み取り2用です。 (B)読み取りに沿った各ベース位置の誤り率。 分布の前半部分は読み取り1用で、後半部分は読み取り2用です。 (C)読み取りに沿った各ベース位置のベースコンテンツ。 Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃはヌクレオチドの種類を示し、Ｎはａ／Ｔ／Ｇ／Ｃのいずれかであり得る失われたヌクレオチドを示す。 分布は2つの読み取りによって分離されており、(a)、(b)、および(c)について、読み取り1および読み取り2は、各シーケンスのいずれかの終わりからランダムに順序付けされて得られることに注意してください。 （D）データ復旧のための実験手順。 増幅および調製された合成オリゴ試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈ Ｉｓｅｑ配列決定技術を用いて配列決定される。 5セットのダウンサンプリング試行では、生のシーケンス読み取りのランダムに選択された部分の異なるサイズがデコーダに送信され、そこで保存されたファイルが復元されます。 (E)カバレッジに対する正しく回復されたシーケンスの数。 黒丸マーカーはＲ ａ復号前の回復配列を表し，菱形マーカーはＲ ａ復号後の回復配列を表す。 ダイヤモンドマーカーのうち、赤色のものは部分的な回復を表し、緑色のものは完全な回復を表す

図中。 図３（Ｃ）に示すように、ｇｃ含有量の分布を示すために、リードに沿ったＡ、Ｔ、ＣおよびＧの基本含有量分布が提示されている。 相補塩基の原理によれば、ATおよびGCの含有量は、各配列決定サイクルで等しく、配列決定手順全体で一定かつ安定でなければならない。 注目すべきことに、シークエンシング読み取りおよび各塩基位置における観察された平均GC含量は、最初の50ntに関係なく、両方とも約20％であった。 最初の20ntにおける分布の理由は、両端の二つの結合部位によるものである。 この分布は，配列決定されたオリゴのＧＣ含量が生化学的制約をよく満たし，したがって安定した配列決定プロセスを保証することを示している。

データ復旧解析

設計したRA誤り訂正符号化方式の符号復元性を検証するために、図中の異なるカバレッジにわたる方式のデータ復旧性能を調 3(D). これにより，多様なカバレッジによる異なるドロップアウト率に対する設計されたＲ ａコードの誤差回復性に関する推定値が得られた。 受信したシーケンス読み取りには、長さが許容範囲外であるため、使用できない生のシーケンスがいくつか存在します。 異なるカバレッジ（8倍から12倍）を模倣するために、我々は、各メッセージoligoの分布が変化する可能性がある使用可能な生のシーケンスにランダムダウンサンプリングを実行することにより、異なるサイズのデータセットを生成しました。 たとえば、8倍のカバレッジの場合、使用可能な生シーケンスをランダムにサンプリングして、96,000個の生シーケンスのデータセットを生成しました。 各カバレッジについて、5つの異なるランダムにダウンサンプリングされたデータセットを生成し、平均シーケンスとデコーディング性能を決定しました。 各生配列について、塩基配列を二値配列に変換するためのデマッピングを行い、誤りのない/正しい配列を同定するためのCRCテストを行った。 各カバレッジのエラーのないシーケンスの平均数を図10に示します。 図3(E)(黒い点)は、予想されたように、カバレッジの増加に伴って増加する。 次に、エラーのないシーケンスをRAデコーダに供給して、エラーのあるシーケンスを回復しました。 我々は、カバレッジ10x以降から、各カバレッジのために、デコーダは完全に5つのランダムなダウンサンプリング実験のうち5つの元のシーケンスを回復 3(E))。 これは、デコーダが10倍の最小カバレッジで誤ったデータを回復するために堅牢であることを示しており、オリゴシーケンスの3.3％がエラーであった（すなわち、ドロップアウ