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骨ミネラル:その化学組成に関する新たな知見

骨ミネラル中のHPO4 2−イオンの同定

無傷の骨組織サンプルから骨ミネラル中に局在する陽子を直接固体核磁気共鳴(ssNMR)で検出することは不可能です。 これは、異なる信号が骨組織サンプルの1H単一パルス(SP)ssNMRスペクトルを支配する細胞外有機マトリックスの存在によるものである54。 しかし、二次元(2D){1H}31P異核相関(HetCor)ssNMR実験における水素とリンの核間の原子スケールの空間的近接性を明らかにする可能性は、F1次元の分析を通じて骨 1A)。 残念なことに、この実験は時間がかかり、比較的低い信号対雑音比(S/N)と低いデジタル分解能を有する垂直(F1)次元の1H投影を生じさせる(図10)。 1B)。 これらの制限を克服するために、我々は一次元(1D){1H-31P}1H二重交差偏光(CP)ssNMR実験を使用しました。 これは、「そこと後ろ」の方法(1H→31P→1H)で行われる二重CP転送からなる(図10)。 S1)。 まず、この実験により、比較的短い取得時間(すなわち、9時間)にもかかわらず、優れたS/Nを有する無傷の皮質2歳の羊骨組織試料から骨鉱物の31P濾過1H ssNMR 1C、D)。 骨の鉱物からの異なった1H化学環境は今容易に観察可能で、精密と安全に分析することができる。 骨鉱物粒子の内部結晶コアに関しては、ヒドロキシアパタイトの結晶格子中に存在するヒドロキシルイオンは、δ(1H)=0.0ppmを中心とする複雑な共鳴の形で観察される。 それらの非晶質表面層に関しては、非アパタチ環境に存在する構造水分子および酸性リン酸種は、δ(1H)=5を中心とする単一共鳴の形で観察可能である。2ppmおよびδ(1H)=7から17ppm32までの広い共鳴。

図1
図1

骨鉱物中の水素含有種の検出。 1H-31Pクロス偏光(CP)ベースの魔法の角度スピニング(MAS)固体核磁気共鳴(ssNMR)スペクトル乾燥2歳の羊の骨組織サンプルの。 (A)2次元(2D){1H}3 1P異核相関(Hetcor)スペクトル(接触時間、TCP=1 0 0 0μ s)。 信号強度は青から赤に増加します。 (B)1H投影の垂直(F1)次元の2D{1H}31P HetCorスペクトルを(A)に示す。 {1H−3 1P}1H二重CP masスペクトルは、以下の接触時間で記録された:(C)TCP1=TCP2=1 0 0 0μ s;および(D)TCP1=TCP2=1 5 0 0 0μ s。 総実験時間は、各実験において同じであった(すなわち、9時間)。

第二に、この実験は、選択的に31P核近くの1H核の性質を明らかにするために、1H検出CPダイナミクスの調査を可能にします。 このため、接触時間1(TCP1)は1 0 0 0μ sに固定されたままであり、接触時間2(TCP2)は7 5μ sから1 0 0 0μ sまで変化させた(図2)。 2). 磁化の均一な増加は、δ(1H)=0.0とδ(1H)=5.2ppm(黒い破線を参照)を中心とする共鳴の両方について観察され、以前はOH−イオンと構造H2O分子に起因し、それぞれの1H NMR化学シフトに従っている。 対照的に、δ(1H)=7-17ppmの範囲の広い信号の進化は、最初は磁化の急速な増加(tcp2=300μ sまで)を示し、その後に振動挙動(tcp2=1250μ sまで-黒い破線を参照)が存在する。 この振動的挙動は、1H-31P双極子(DP-H)振動の特徴である55,56。 対応する{1H-31P}1H ssNMRスペクトルの様々なtcp2でのフィッティングは、様々な共鳴の重複のために簡単ではありません。 一方、合成HAサンプルは通常、対称OH共鳴を示す32; ここでは、骨鉱物のOH共鳴が特に複雑であり、以下のように適合することができることを示している:δ(1H)=0.0ppmの主ピークは、δ(1H)=−0.7および0.9ppmの二つの肩のピークに囲まれている(図。 S3)。 残留構造水共鳴は、δ(1H)=5.2ppmを中心とする単一のピークと適切に適合させることができる(図。 S4)。 対照的に、δ(1H)=7-17ppmの範囲で観測可能な酸性リン酸種からの広い信号は、特に短い接触時間で、固定位置と線幅を持つ単一のピークに十分に適合するこ S4-左の列)。 しかし、固定位置と固定線幅(それぞれ6.2±0.1と5.0±0.1ppm)で二つの異なるピークを使用すると、フィッティング結果は正確になります(図。 S4-右の列)。 この広いシグナルは二つの異なるプロトン環境に対応する二つのピークからのみ構成されていると主張することはできないが、おそらくNMR化学シフトの分布につながる化学環境の広い分布から構成されている。 ることができる。 図3Aは、各tcp2値の骨鉱物の31Pろ過1H ssNMRスペクトルを分析するために使用された四つのピークを示しています:(i)δ(1H)=0.0(紫)を中心とする複合ピークとδ(1H)=5.2(グレー)ppmを中心とする単一のピークの両方の磁化の比較的遅く、均一な成長によって特徴付けられる; そして(ii)δ(1H)=9.8(青)および14.0(緑)ppmの二つのピークは両方とも双極子振動を表示する(図。 3B)。 これらの後者の2つのピークに関しては、Hartmann−Hahn(H−H)プロファイルの正確な一致(図3)が得られる。 S2)は、コヒーレント分極移動と1Hスピン拡散の影響に起因する双極子振動を考慮した単一スピン対モデルによるCPビルドアップ曲線の数値モデル化を可能にする57:

≤{\rm{m}}({\rm{t}})={{\rm{m}}}_{0}。\exp(-\,{{\rm{t}}}_{{\rm{CP}}}/{{\rm{T}}}_{1{\rm{\rho}}}}}}({}^{{\rm{1}}}{\rm{H}})))))))))))。 そして、f1におけるヒドロキシルイオンの位置が合計されている。 (C)合成リン酸八カルシウム(OCP)試料の1D31P CP MAS ssNMRスペクトル(tCP=1000μ s)。 P1からP6は、Daviesらの研究によれば、OCP結晶格子中に存在する六つの異なるリン酸基に対応する。60. 赤い破線は、骨鉱物(B)では検出されないOCPの信号の中で最も強い共鳴を示しています。

骨鉱物中のHPO4 2イオンの定量化

骨鉱物中に存在するHPO42イオンの定量化が行われた。 この目的のために、O H−およびPO4 3−含有内部結晶コア、ならびにH2OおよびHPO4 2−含有非アパタイト環境(非晶質表面層)の個々の3 1P NMRシグナルの線状およ 図4Bに示すように、新鮮な2歳のヒツジ骨組織試料の定量的3 1P単一パルス(SP)MAS SSNMRスペクトルのフィッティングに使用した(図4B)。 5A)。 骨鉱物中のhpo42−およびPO43−イオンのモル割合の割合は、約50/50±5%であることが判明した。 図S9およびS10の我々の観察によって示唆されるように、この計算は、粒子の内部結晶コア中のHPO42−イオンのモル割合が0%に近いと仮定して行われた。 非晶質表面層に存在するHPO42イオンのこのような高いモル割合は、骨鉱物粒子の小さなサイズを反映しています:厚さが≤1−5nm、幅が≤10-40nm、長さが≤20-100nm1、61、62、63。 我々はhpo42イオンがアモルファス表面層内に集中していることを示したので、我々は今、2歳の羊の骨組織サンプルのためにこの層の平均厚さを推定す ここでは、厚さ4.0nmのナノサイズ血小板を考え、ヒドロキシアパタイトの結晶格子と非晶質表面層に存在するリン酸原子の密度が同等であると仮定 このようなシナリオでは、内部結晶性コアの厚さは約2.4nmである(すなわち、内部結晶性コアの厚さは約2.4nmである)。 結晶軸aとbに沿ったヒドロキシアパタイト64の六角形の単位セルの約倍の大きさである;a=b=0.94nm);外側の非晶質表面層の厚さは約0.8nmであると推定することができる(すなわち、これはaとbに沿ったヒドロキシアパタイトの六角形の単位セルの大きさに対応し、したがって、二つのリン酸イオンのみの積層に相当する)。 これらは、2歳の羊の骨組織サンプルに存在するすべての無機リン酸イオンの寄与の合計に対応する平均値であることを意識する必要があります。 これらの結果は、骨ミネラルの成熟のために非アパタチ環境の割合が少ない65である古い標本では異なる可能性があります:アモルファス表層のアパタチ環境への漸進的な変換15。 それにもかかわらず、ここで決定された表面層の厚さ(0.8nm)は、いくつかの以前の研究で提案された推定サイズとよく一致しています:フルオロアパタイト-

図5
図5

骨鉱物中に存在するHPO42−およびCO32−イオンの定量化。 (A)定量的な31p単一パルス(SP)マジック角度スピニング(MAS)固体核磁気共鳴(ssNMR)スペクトル新鮮な2歳の羊の骨組織サンプル(青い線)と2つのピークを持つ これら二つのピークは、その線形状と線幅が図で明らかになった。 図4Bに示すように、ヒドロキシアパタイトの形態で内部結晶コアを含むPO4 3(橙色ピーク)および非晶質表面層の形態で非アパタイト環境を含むHPO4 2( (B)2歳の羊の骨組織サンプルのσ2(CO3)振動モードのフーリエ変換赤外線(FT-IR)スペクトル(青い線)とそれに対応するフィッティング(赤い破線)。 B型CO32-イオンはヒドロキシアパタイトの結晶格子内のPO43サイトを占め、a型CO32−イオンはヒドロキシアパタイトの結晶格子内のOHサイトを占め; 一方、非アパタイトCO32-は、骨鉱物粒子を被覆する非晶質表面層内に存在する。

骨鉱物化学組成に関する更新

ここで提示された結果とelsewhere45は、Legrosらによって提案された成熟皮質骨鉱物の平均化学組成27,Ca8.3□1,7(PO4)4.3(HPO4またはCO3)1.7(OHまたは≤CO3)0,3□1.7,再考する必要があります。 実際、この式は、粒子の内部結晶コアに存在するアパタイト環境に関して化学組成が大きく変化する非晶質表面層の存在を無視するだけでなく、HPO42−イオ 私たちの2歳の羊の骨組織サンプルの最新の式を提案するために、我々は最初にCO32-イオンの重量割合を決定する必要がありました。 FT-IR分析により、B型炭酸塩に大きな寄与を持つ4.8%の値が見出された49(図1)。 これは、他の骨鉱物試料について見出された値に従うものである3。 さらに、以下のパラメータが考慮された:(i)粒子は電気的に中性(内部結晶コアと非晶質表面層の両方)のままでなければならない、(ii)無機リン酸イオンの全量e.1.2–1.53の範囲で、最後に、(v)非晶質表面層に存在するA型、B型、および非アパタイト炭酸イオンの割合は、FT-IRデータに従って残るべきである。 これらの制約のすべてが合併されたら、私たちの2歳の羊の骨組織サンプルから成熟した皮質骨鉱物の平均化学組成は、Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2 この平均的な化学組成は、私たち自身の実験結果によれば、私たちの特定の骨組織サンプルにのみ対応することに注意する必要があります。 したがって、この式は、特に正貨、年齢、食物供給およびそれらの成熟度に依存して骨標本間で変動が生じるため、普遍的ではない。

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