花粉媒介植物におけるリアルタイム発散進化
実験設計および研究システム
2012年に、カロライナ州の生物学的供給物から300種の高速サイクリングブラシカラパ植物(Wisconsin Fast Plants Standard Seed,with high genetic variation)が得られ、標準化された土壌、光および散水条件の下でフィトトロンで栽培された。 これらの植物は完全にアウトクロス（自己相容れない）であり、容易に選択58、59に応答するのに十分な永続的な遺伝的変異を有する。 これらの300の植物から、108の完全なsibの種家族は人工的な交差によって発生しました（両方の親がフルーツを作り出した十字からの種家族だけ使用され これらの108の完全なsibの種の家族は実験のために開始の人口として使用されました。
第一世代の実験では、108の家族を用いて三つの治療群を確立し、各治療において各家族を代表して治療のうち遺伝子型を制御した（補足図）。 1). したがって、各処理は108の植物（108の種子ファミリーを表す）で構成されており、それぞれ36の植物を含む三つの複製（A、B、C）に細分されていました。 処理内の複製は、独立した、反復可能な進化の変化を評価することができるように、9世代（複製間の交差は行われなかった）の間に単離されたラインとし すべての処理におけるすべての複製の植物は、標準化された土壌（Einheitserde classic）、光（24h光）および散水条件の下でフィトトロンで栽培された。 すべての植物は、第1世代から始まるすべての第二世代を表現型とした。 第1世代と第3世代の花の香りのデータは技術的な問題のために失われ、代わりに第4世代から香りが収集されました。 第1世代の花の香りデータは、実験の終了後、開始世代から植物を再成長させ、108種の種子ファミリーのそれぞれから一つの植物から香りを収集することによ したがって、第一世代の合計108植物（各複製から36）から、第9世代の植物と同時に花の香りについてサンプリングした。
実験的進化と受粉処理
私たちの研究では、マルハナバチ（’BB’、Bombus terrestris、Biocontrol、Andermatt、スイス）、ホバーフライ（’HF’、Episyrphus balteatus、Katz Biotech AG、ドイツ）、および手受粉の三つの受粉処理を使用しました。 両方の昆虫は自然界で多くのアブラナ科の種の花を容易に訪れるが、機能的な花粉媒介者のカテゴリーは異なり、自然の習慣では豊富に変化することが示されている46。 単一の花粉媒介種の使用は、最も豊富な花粉媒介者が機能的に異なる花粉媒介環境を模倣する。 対照処理（’CO’）では、無作為に選択された植物を手で相互受粉した。
受粉は、マルハナバチとホバーフライと標準化された光条件下で温室内の飛行ケージ（2.5m×1.8m×1.2m）に播種した23日後に行われました。 実験は0900時間と1,500時間の間に行われた。 マルハナバチは、温室内の別の飛行ケージに保持されました。 ホバーフライをさなぎとして購入し，ふ化するまで飼育した後，雄と雌のハエを分離した。 受粉者は、高速サイクリングB.rapa植物（それぞれの世代の対照群の植物）に飼料を与え、受粉処理の3日前まで追加の花粉を供給し、その後、花粉と糖液のみを提
受粉のために、一つの複製のすべての植物は、飛行ケージ内の互いに20cmの距離を持つ6×6植物の正方形にランダムに配置された。 五つの花粉媒介者を個別および順次に添加し、各昆虫は最大三つの異なる植物を訪問し、その後ケージから除去した。 合計で、複製ごとに12-15の植物が花粉媒介者によって1つ以上の訪問を受けた。 （訪問された植物で）訪問の全体的な平均（±s.d.）数は、マルハナバチ受粉植物のための1.35±0.63とホバーフライ受粉植物のための1.28±0.53であった。 訪問された植物については、訪問数と訪問された花の数を記録した。 対照群では、複製ごとに12の植物を無作為に選択し、各植物の5つの花を無作為に選択された父植物によって手受粉させた。 各植物は複数の植物への花粉の提供者であることができますが、一つの植物から花粉を受け取っただけです。 受粉後、訪問された花をマークし、果実が収集されるまで植物をさらに30日間ケージに保管した。 種子を計数し、個々の種子セットを複製中の平均種子セットで除算することによって、各植物について相対種子セットを計算した。 さらに、果実あたりの種子の数は、訪問した植物ごとに計算された。 各植物について、男性の適応度は、予測された父性（花粉輸出イベントの数）として推定された。受粉された花によって生産されたすべての種子から、各個体の種子生産を代表する種子のサブセットを使用して、次の世代を成長させた。
受粉され より多くの種子植物は、それが再び各複製のための36の植物で構成され、次の世代に貢献し、より多くの種子を生産しました。 次の世代への各訪問された植物の種子寄与は、すべての複製について次のように計算されました: 36/（種子の複製合計/個々の種子セット）。 0.5未満の値は1に切り上げられました。
近親交配うつ病
近親交配うつ病は、種子の重量と発芽率を測定することによって定量化し、後者は複製ごとに発芽した種子の割合とし 制御性格特性の変化による近交弱勢、種子植物が生産の第9世代の成可能であり、報告されている代表の第10世代)、手動で交差を再現内の、植物の複製した花粉のドナーや花粉を受けた工場の再現(♀A-♂C,♀B-♂、♀C-♂B）。 これらの反復の組み合わせ内の交差はランダムであった。 得られた種子（第十一世代）のうち、実験中と同じ条件下で、種子ファミリーあたり一個体（複製あたり36植物）を成長させた。 これらの複製間交差のうち、形質を再び測定し、治療群間の形質の最終的な比較のために使用した。
植物の形質
花の香りを含むほとんどの形質は、播種後19-21日、受粉前に測定しました。 植物ごとにランダムに選択された三つの花の花弁の幅、長さ、雌しべの長さと花の直径は、電子キャリパー（デジタルキャリパー0-150mm、TOOLCRAFT）で測定しました。 ３つの花からの蜜を、１μ ｌのマイクロキャピラリーチューブ（Ｂｌａｕｂｒａｎｄ，Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で収集し、その体積を、カリパスを用いてマイクロピペット中の蜜カラムの長さを測定するこ 定量化のために、3つの花の平均を使用した。 処理全体に均等に分割された157植物について、蜜の糖度は、誘導体化およびガスクロマトグラフ分析を用いて決定された。 これを行うために、蜜はシリカゲルに貯蔵された濾紙に伝達された。 蜜を含む濾紙上のセクタを濾紙の残りの部分から切断し、1mlの高純度Mili-Q水に希釈液を90分間400r.p.m.で60℃で振盪することによって蜜を溶出した。 その後、５ ０μ ｌの溶液を６ ０℃で乾燥させ、１ ０ ０μ ｌの無水ピリジン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ヘキサメチルシラザン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびトリメチルクロロシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の混合物（１ ０：５：３）で誘導体化 その後、参考文献に記載されているように、試料をＧＣ−ＭＳによって実行した。 32. 花と花序あたりの総糖量を、すべての異なる糖（フルクトース、グルコース、ショ糖およびソルビトール）の合計として計算した。 蜜糖度と蜜量との相関は正で高く（r156=0.732、P<0.001）、したがって、残りの植物については、蜜量のみが決定された。 花の香りの収集は、少なくとも五つの花が開いていたとすぐにすべての植物の花序から非破壊的な方法でバイオアッセイの前に行われました。 プッシュプル方式のヘッドスペース収着を使用しました59,60. 植物の花序を以前にｓｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆したガラスシリンダーに封入し，テフロン板で閉じた。 開いた花の数は、各植物について数えた。 周囲からの空気は、100ml min−1トラフ活性炭フィルターの流量でガラスシリンダーに押し込まれた。 同時に、１ ５ ０ｍｌ分−１の流量でガラスシリンダから空気を引き出し、≧３ ０ｍｇのＴｅｎａｘ Ｔ ａ（６ ０／８ ０メッシュ；Ｓｕｐｌｅｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を充填したガラス管をトラフした。 空のガラスシリンダーからの空気は、空気制御として収集されました。 花の揮発性物質を標準化された光および温度条件下でフィトトロン中で二時間収集した。 揮発性物質の定量は質量選択的検出（ＧＣ–ＭＳＤ）を用いたガスクロマトグラフィーにより行った。 低温注入システム（ＣＩＳ；Ｇｅｒｓｔｅｌ）を備えたＧｅｒｓｔｅｌ熱脱着ユニット（ＴＤＵ；Ｇｅｒｓｔｅｌ）を使用して、多目的サンプラー（Ｍｐｓ；Ｇｅｒｓｔｅｌ、Ｍｕｌｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｓｔｅｌ）によってＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ６ ８ ９ ０Ｎ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃ Ａ、ＵＳＡ）に試料を注入した。 熱吸収のために、ＴＤＵを３ ０℃から２ ４ ０℃まで６ ０℃分−１の速度で加熱し、最終温度で１分間保持した。 ＴＤＵからの溶出化合物の捕捉中に、ＣＩＳを−１ ５ ０℃に設定した。 注入のために、ＣＩＳを１ ２℃ｓ−１の速度で２ ５ ０℃に加熱し、最終温度を３分間保持した。 GCにはHP-5カラム（直径0.25mm、膜厚0.25μ m、長さ15m）が装備され、ヘリウムは2ml min−1の流量でキャリアガスとして使用された。 化合物の同定および定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＳＤ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎプログラムに従って行った。 化合物の定量は、個々の香り化合物に特異的な選択された標的イオンのピーク面積の測定によって得られた。 特定のターゲットイオンはすべての化合物の合成標準から得られ、ピーク面積は三つの異なる濃度の合成化合物を用いて各化合物について以前に得られた検量線を用いて絶対量に変換された。 空気制御よりも有意に高い量で存在していた香り化合物のみが分析に含まれていた（合計14の香り化合物）。 揮発性物質のすべての量は、花l−1サンプリング空気あたりのpgで計算されました。
播種から二十三日後、受粉が行われたのと同じ日に、開いた花の数と各植物の高さを記録した。 受粉後（ただし、同じ日に）植物ごとの異なる未受粉（可能な場合）花から三つの花びらの色反射率スペクトルは、光ファイバー分光光度計（AvaSpec-2048）を使用して記録; Ａｖａｎｔｅｓ，Ａｐｅｌｄｏｏｒｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびキセノンパルス光源（Ａｖａｌｉｇｈｔ−Ｘ Ｅ；Ａｖａｎｔｅｓ）。 一度に一つの花びらを分光光度計の下に置き（具体的には花びらの遠位部分に焦点を当てる）、200と900nmごとに0.6nmの間の反射率（白色標準に対する）を透過モードで記録した。 測定されたスペクトルのうち、三つの花弁から10nmから260nmまで650nmごとの反射率値の平均のみが分析に使用された。 第十一世代の植物では、色のPcのどれも実験を通して選択中であることが判明しなかったので、複製あたりca20植物のサブセットは、色のために分析 紫外吸収反射花びら表面の面積は、石英レンズ付き紫外感度デジタルカメラで第11世代のプラントでのみ測定しました。 花の写真を撮影し、ソフトウェアパッケージImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/)を用いて紫外線吸収領域を定量した。
花粉媒介者選好アッセイ
花粉媒介者選好のアッセイは、両方のタイプの花粉媒介者を用いて各複製について実施した。 各複製について、２つの行動アッセイを実施した（各花粉媒介者処置のために１つ）。 各複製のマルハナバチとホバーフライ受粉植物（世代11）は、ランダムにペアリングされ、飛行ケージ（2.5m×1.8m×1.2m）に並んで（ca30cmの距離）配置されました。 一人の花粉媒介者をケージに入れ、一つの植物を訪問することができました。 花粉媒介者は、彼らが彼らの選択をした後すぐに捕まえられた。 各植物対を一つの花粉媒介者でアッセイした。
自己適合性と自律的な自己形成
自己適合性をテストするために、我々は最初の（複製ごとに15植物）と第十世代（複製ごとに30植物）から植物を育 無作為に選ばれた家族からの種子ファミリーごとに一つの種子を栽培し、植物ごとに二つの花をanthesisで自給した。 個々の植物ごとに自家受粉花あたりに生産された種子の平均数を自己適合性の測定として使用した。
自律的な自己形成をテストするために、我々は、世代11と1（合計162植物）のすべての処理から複製ごとにca12植物（家族ごとに一つの種子）を成長させた。 Ca20の花が開いていた30日後、各植物の残りの芽を慎重に切断し、開いた花の数を記録した。 その後、植物は昆虫が植物にアクセスすることなく果実を発達させることができました。 果実の熟成後、種子を収集し、種子の数を数え、各植物について秤量した。 開放花当たりの果実数と果実当たりの種子数を自律的な自己形成のための測定として用いた。 いくつかの植物は開いた花ごとに非常に多くの果実を持っていたので、自律的な自己形成の最終的な比較のためにこれらの外れ値を削除しました。 以下の数の外れ値が削除された：第１世代では１；Ｇ１ １では：Ｂ Ｂでは２、Ｈ Ｆでは３、ＣＯでは２であった。
統計分析
表現型の選択を分析するために、選択差と勾配はtraits61に植物のフィットネスを退行することによって計算されました。 この分析は、処理のために別々に行われたが、すべての複製および世代を組み合わせたものについて行われた。 適応度の推定値として、カウント変数であり、ポアソン分布に従った’訪問数’が使用されました。 さらに、種子セットは、この訪問から種子を設定しなかった（花粉媒介者が最初にアブラナ花粉を運ばなかったため）、訪問された最初の植物の唯一の雄 しかし、訪問数は相対シードセットと強く相関していた（BB：r626=0.694、P<0.001;HF：r605=0.597、P<0.001）。 一般化線形モデル（ポアソン分布）を使用して、従属変数としての訪問回数と共変量としての形質を持つすべての治療の選択勾配（多変量）と微分（一変量）を計算した。 さらに、すべての形質と各形質の二乗項をモデルに追加して二次選択勾配を計算し、その後勾配を二重にした62。 マルハナバチとホバーフライの選択の違いを確認するために，訪問回数を従属変数として，固定因子として処理，植物形質を共変量として，相互作用処理＊植物形質を用いた一般化線形モデル（ポアソン分布を有する）を行った。 選択分析の前に、すべての変数は、複製レベルで平均＝０およびｓ．ｄ．＝１（Ｚ値）に標準化された。 一般化された線形モデルはまた、すべての世代にわたってマルハナバチとホバーフライ受粉植物の間の訪問率を比較するために使用されました。 花の色の分光光度計の価値はvarimaxの回転を用いる主成分（PC）の分析によって減りました。 解析には、固有値が1より上のPCsのみが使用されました。
植物形質の進化的変化は、多変量線形判別関数解析と一変量一般線形モデル（GLM）を使用して第11世代の植物で評価しました。 ＧＬＭについては、各形質を従属変数として使用し、ランダム因子として複製し、ＬＳＤ事後検定を用いて固定因子として処理した。 ドリフトから自然選択の影響を区別するために、我々は形質の違いは、与えられた受粉処理の複製の間で一貫していたかどうかを評価した。 GLM分析では、有意な”治療”効果は、すべての複製全体で異なる花粉媒介者グループ間の形質の違いを示し、したがって、ドリフトから花粉媒介者特異的進化 ドリフトは、いくつかの（ランダムな）複製のみにおける進化的変化によって示され、因子「複製」における有意性または「複製」と「治療」との間の相互作用によ 自己適合性と自律的な自己形成もGLMによって評価されたが、第一世代植物の値は分析に含まれていた。 揮発性物質と蜜量の分析のために、データはln（1+x）正規分布に近づくように変換されました。 色変数を伴うＧＬＭについては、上記のようにＰＣ分析を行ったが、変数の事前の標準化は行わなかった。 PC分析は、すべての処理、複製、およびすべての世代について一緒に実行され、総分散の96.9％を説明する四つのPcが得られました。 従属変数として”蜜の存在”（はい／いいえ）を用い，因子として処理と複製を用いて，二峰性分布を持つ一般化線形モデルを用いて，ネクターのない花の頻度を世代ごとに別々に解析した。 従属変数として形質を持つ一般的な線形モデルを用い，”蜜の存在”と固定因子としての処理を用いて，蜜花と蜜なし花の形質を第九世代と第十一世代について一緒に比較した。 マルハナバチとホバーフライの最初の選択の好みは、二項検定（test-prop=0.5）によって分析されました; すべての複製がプールされています）。 Ｌｎ変換値とＰｅａｒｓｏｎ積-モーメント相関を用いて，すべての世代について蜜と植物形質との相関を計算した。 統計はIMB SPSS統計(バージョン20.0.0,http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/)を使用して実行されました。