はじめに

家族性多発性脂肪腫症(FML,OMIM%151,900)は、四肢および体幹によく封入された皮下結節が発達することを特徴とする稀な常染色体優性疾患である。複数の脂肪細胞性腫瘍の1つの最初の報告は、ベンジャミン-ブロディ卿によって1846年以来行われた。Blaschko(1891)およびAlsberg(1892)からの2つの後の結果は損害の家族性再発を示し、男性間の高められた発生を観察しました。1,3,4その後の年に、他の多くの著者は、FMLを非常に示唆する特性を持つ家族を発表し、1,5,6そして最終的に1970年にDas Guptaは脂肪腫性腫瘍を孤立性または散発性、FMLおよび多発性対称性脂肪腫症（MSL）の三つのカテゴリーに分類した。7,8

孤独な脂肪腫は、成人の軟部組織の最も一般的な良性新生物と考えられているが、複数の脂肪腫は個人の5％に発生する。9,10FMLの正確な有病率は不明であるが、0.002％であると推定されている。8,11,12結節の年齢発症は30歳から40歳の間であり、50代で最大ピークに達する6,8,13,14この障害は男性の好みを示すと広く開催されているが、多くの作品は両性が均等に影響を受けていることを示している。15-17それは良性疾患と考えられているが、化粧品の懸念は、彼らの生活の質を損なう、いくつかの個人で表示されることがあります。 さらに、それは肥満の個人でまた流行します。9

これまで、FMLで利用可能な研究は、明示的に臨床的側面に焦点を当てており、分子の問題は通常調査されていません。 文献は、散発性脂肪腫の少なくとも70％がHMGA2（高移動度グループAT-フック2）遺伝子の規制緩和された発現につながる可能性が12q13-15バンドを含む細胞遺伝学的再配列に起因することを示唆している。 この遺伝子は、DNAコンフォメーションの変化、異常な細胞増殖、および良性間葉系腫瘍の開発のための責任非ヒストンクロマチンタンパク質をコードします。18-20

遺伝的条件の分子基盤を認識し、ハイスループットシーケンシング技術の実装は、いくつかのgenodermatosisの病因に関与する他のメカニズムを探索し、解明す そこで、本研究では、Sangerおよび次世代シークエンシング（NGS）技術を用いて、脂肪腫症に関連する6つの候補遺伝子の変異体を検出するために、FMLを有する7人の個体の臨床的および分子的特性評価を行うことを目的とした。

材料と方法

患者と倫理的側面

この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に準拠して行われました。 研究の前に機関審査委員会（FCM-UNICAMPの研究倫理委員会、ファイルN°1.313.164）から承認を得、すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。 ブラジルのサンパウロにあるカンピナス大学（HC-UNICAMP）の臨床病院で、医学遺伝学サービスの外来診療所で研究を行った。 5つの無関係な家族（AからEまでの名前）に属する合計7人の個人が対象となりました。 被験者を選択するための主要な包含基準は、i）18歳以上の年齢、ii）脂肪腫または血管性脂肪腫の臨床的および病理組織学的診断およびiii）常染色体優性遺伝を示唆する家族性再発であった。 主な臨床的側面は、構造化された形式を使用して医療記録から収集された。 物理的評価には、皮膚科医と遺伝学者の両方の専門分野の参加が含まれていました。 Ｈ ｃ-ＵＮＩＣＡＭＰの病理部は病理組織学的標本を提供した。 臨床所見は表1に詳述されている。

	表1FML患者の臨床要約
表1FML患者の臨床要約
	表1Fml患者の臨床要約

hmga2遺伝子のサンガーシークエンシング

ゲノムdnaは、sambrook et al21によって使用される従来のフェノール-クロロホルム手順に従って七人の患者の末梢edta血液サンプルから抽出された

ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）は、ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）によって行われた。HMGA2 ジーン オンラインバイオインフォマティックツールPrimer3(https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm)とOligoAnalyer3.1(https://www.idtdna.com/calc/analyzer)を使用して、表2に要約されたプライマーの特定のペアを設計しました。

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1、Life Technologies®)メーカーの指示に従ってください。 クロマトグラムはChromas v.2.6.5を用いて調べた。 結果を、ＨＭＧＡ２Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物番号ＥＮＳＴ０ ０ ０ ０ ０ ４ ０ ３ ６ ８ １（＜ｄｉｖ ｉｄ＝“５ ６ ７ ９ １ｂ７ｂ２ｄ”＞＜／ｄｉｖ＞）と比較した。 私たちは、三つの公開データセットで新規変異体をチェックしました：i）ゲノミクスと健康のためのグローバルアライアンス（GA4GH）ビーコンネットワーク（https://beacon-network.org/#/）、ii）エクソームアグリゲーションコンソーシアム（http://exac.broadinstitute.org/）と、iii）ブラジルの突然変異のオンラインアーカイブ（http://abraom.ib.usp.br/）。 病原性スコアと候補HMGA2遺伝子の新規変異体の損傷効果を評価するために、我々はVEP（バリアント効果予測因子）、22FATHMM（隠されたマルコフモデルを介して機能解析）、23UMD予測因子、24SIFT（寛容から不寛容をソート）、25PROVEAN（タンパク質変動効果アナライザ）、26と変異テイスターのようなシリコ予測モデルで異なるを使用しました。27

ターゲットマルチ遺伝子パネル

カスタムパネルは、症候群性脂肪腫症に関与する遺伝子を評価するために行われました。 この技術を実行するために、Oragene（登録商標）DNA self-collection kit（DNA Genotek,Inc.）を用いて、5人の患者（A、B、C、D、およびE）の唾液標本からゲノムDNAを取得しました。,オタワ,オンタリオ,カナダ). その後、試料を濃縮し、標的特異的配列に対してハイブリダイズした。 キャプチャは、このプラットフォームの標準プロトコルに従って、次世代Illumina®MiSeq(TruSeq Capture)シーケンサーを150bpペアエンドモードで使用して行われました。 濃縮および分析は、五つの転写物のコード配列に焦点を当てた（AKT1NM_005163。2、APC NM_000038.5、MEN1NM_130799.2、PIK3CA NM_006218.2、およびPTEN NM_000314.4）、イントロン配列の10bpおよび疾患の原因と思われる他の領域。 エクソニック欠失，重複およびスプライスサイト変異も検討した。 読み取りを整列させ、ヒトゲノムリファレンス（Grch37）と比較した。 多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）を、Ｉｎｖｉｔａｅ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１ ４ ０ ０ １ ６ｔ ｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ Ａ９ ４ １ ０ ３，＃０ ５Ｄ２ ０ ４ ０ ７ ７ ８）によって言及されたような変異体を検証するために選択した。

データの入手可能性

配列をGenBankに提出した(アクセッション番号:Bankit2217069Seq1-MK875826)。 この記事に関連するデータセットは、研究アクセッション番号PRJEB28960(https://www.ebi.ac.uk/ena)のEnaリポジトリを介して欧州バイオインフォマティクス研究所EMBL-EBIで入手できます。

結果

臨床分析

図1に示すように、5つの無関係な家族（A、B1、B2、C、D1、D2、およびE）から7人の個人が含まれていました。 私たちは、参加者間の親の近親性を特定しませんでした。 民族起源は、各発端者によって混合されたとして自己報告された。 一般的な概要では、家族AとBは、三つの連続またはより多くの世代が関与していることが観察された。 男女比は1:6と推定された。 包含時の平均年齢は42歳（SD11.8）であったが、病変発症の平均年齢は28歳（SD11.8）であった。 女性は彼らの妊娠の後で小節のピーク発生を報告しました。 FMLの古典的な臨床的特徴は、図2に示すように、皮下脂肪に位置し、体幹および四肢に限定された、数およびサイズが非常に変化する軟結節を含んでいた。 不快感と触診への著しい圧痛は、個々のAでのみ認められた。Comorbid胃腸障害は、患者A、C、およびD2に存在していた。 憩室炎とポリープ，重度の慢性便秘，大腸癌をそれぞれ報告した。 皮下病変の組織学的評価を行った。 多数の毛細血管によって丸みを帯びた成熟脂肪細胞の存在は、ｂａｎｃｒｏｆｔおよびＦｌｅｔｃｈｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ１ ０，２ ８によって参照されるように、血管性脂肪腫の診断を確認した（図２）。 その他の関連所見を表1に記載する。

図1研究された家族（A–E）の家系の概要。 女性と男性がどのように等しく関与しているか、およびほぼ二つの連続した世代を持つ常染色体優性遺伝パターンが影響を受けてい 家族Ａは複数の脂肪腫（ａ）を発症する世代数が最も多かった。 発端者A(III2)は、彼女の家族のグループ内で唯一のものであり、検査されたときに痛みを参照するcasuistryであった(a)。 矢印は発端者を示します。

	図2fmlの臨床的特徴および脂肪腫の病理組織学的側面（he染色（10×）。 第一次調査結果は皮下脂肪にある柔らかく、可動性、および外接する痛みのない小節を含んでいます。 最も一般的な地形分布は、上肢（A、BおよびD）、前腹壁、背中および大腿部（C）からなる。 脂肪腫は、通常、均一な核および薄い線維性カプセル（E）を有する白色脂肪細胞の小葉状パターンを提示する。 Angiolipomasは、主に毛細血管である多数の小さな血管に関連して成熟した脂肪で構成されています。 フィブリン血栓（arrows）は非常に一般的である（F）。 病理学および医学遺伝学の部門の画像の礼儀、医学の学校、UNICAMP。

分子

サンガーシーケンシングは、HMGA2遺伝子のエクソン5に二つの新規変異体を明らかにした。 両方の変異体は、患者AおよびB1で同定された。 最初のものは、同義のヘテロ接合変異体c.327C>t p.(Asp=)いくつかの予測ツール（VEP、FATHMM、UMD-predictor、SIFT、PROVEAN）に基づいて、低影響または中立と考えられていました。 対照的に、第二の変化はナンセンス変化ヘテロ接合変異体c.328T>c(p.*110glnext*16)であり、グルタミンアミノ酸によるコドン置換の停止とそれに続く最終タンパク質の伸長を引き起こす(https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html)。 図3は、HMGA2遺伝子、タンパク質結合ドメイン、および新規変異体の構造を模式化したものです。

図3ヒトHMGA2遺伝子の構造。 (A)12q14.3上に位置し、HMGA2遺伝子は140kb以上に及び、五つのエクソンを包含する。 エクソン1、2、および3(青いボックス)は、AT-hookドメイン(青い円)をエンコードします。 第四のエクソン（ライラック）は、スペーサー領域をエンコードする。 エクソン5（ピンクボックス）は、109アミノ酸のタンパク質のC末端ドメインをコードしている。 (B)患者A、B1、および参照からの電気泳動図。 これらの患者には二つの同一の新規変異体が見出された。 同義ヘテロ接合変異体c.327C>T(P.Asp=)とノーストップ変化ヘテロ接合変異体c.328T>C(p.*110glnext*16)。

変異体c.328T>C(p.*110glnext*16)は、silicoアルゴリズムに記載されているように100％病原性または高い影響と定義されていた。 しかし、変異テイスター予測システムは、表3に示すように、記載された二つの変異体の間に不一致を示した。 ファミリー Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥにおけるＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＭＥＮ−１、ＰＩＫ３Ｃ Ａ、およびＰＴＥＮの標的化された多遺伝子パネルは、評価された配列の有害な変化を検出しなかった。

	個人AとB1で見つかった表3の変異体と予測ツール間の比較
個人AとB1で見つかった表3の変異体と予測ツール間の比較
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discussion

現在の研究では、サンガーシーケンシングやngsなどの現代的なシーケンシング技術を伝統的な臨床アプローチと組み合

これまでの研究に続いて、本研究は疫学データに関するいくつかの相違を示している。 我々は、異なるタイプの脂肪腫症の分類および診断に関する一般的な誤解があることを観察した。7,10,15いくつかの著者は、男性が複数の脂肪腫を提示する高い傾向を持っていることを強調し、11、29、30しかし、我々の結果は、女性におけるFMLの見かけの高 この発見は、単にサンプルサイズが小さいために選択バイアスを反映している可能性があるか、または女性が美容上の懸念のために健康医療を求それにもかかわらず、血統は、両性で影響を受けた個体の割合が類似しており、1：1に近い性別比（男性10人対女性13人）につながり、FMLの真の有病率を過少見積りする可能性があることを示している。6,8,16興味深いことに、女性に認められた脂肪腫の総数は、検査されたユニークな男性と比較して高かった。1,14

妊娠中および妊娠後の結節の過体重および悪化した成長などの要因は、外因性因子（食事）、代謝変化（脂質異常症または脂肪酸不飽和化の変化）およ32,33Yeeらは、まれな脂肪障害（RAD）と肥満対照群との間でステアロイルCoAの酵素的不飽和化の違いを比較し、FMLと肥満を持つ個人は、このように脂肪形成プロセ32,34

一つの予想外の発見は、患者Aが痛み、毎日の衰弱、疲労、および精神医学的併存疾患（慢性うつ病および不安障害）を明らかにするcasuisticおよび彼女の家族グループ内で唯一のものであったということでした。 これらの症状は、dercum病と強く関連しており、これは鑑別診断またはFMLの変種と考えられている。35Hanssonらによって提案された新しいDercumの病気の分類に基づいて、36私達はこの患者で脂肪組織の表面のそして脂肪腫のまわりの強い苦痛によって特 この仮説を支持する別の研究は、Campenらによって発表されました37彼らは、全障害から無症候性結節までの可変症状を示した複数の脂肪腫と診断された9人のメンバーの家族を説明しました。 したがって、分離は、可変表現率を有する常染色体優性パターンに従い、おそらくFMLの極端な発現を表すと仮定することができる。

病理組織学的診断に関して、我々は二つの主要なタイプを証明した：脂肪腫と血管脂肪腫。 顕微鏡的に、angiolipomaの共通の顕著な特徴は成長したadipocytesと関連付けられてフィブリンのmicrothrombiを含んでいる良い血管の拡散です。10,28Angiolipomasは時折穏やかな苦痛か圧痛を明示する若い大人の人で高い発生があるようです。 このタイプの腫瘍はまたローカル外傷の歴史かステロイド療法の使用と関連しています。13,38多くの著者は、両方の診断を異なる病理学的実体として認識しているが、いくつかの症例報告は、それらの間の非常に微妙な違いのためにこの区別39この文脈では、我々の分析は、家族性再発を伴う血管性脂肪腫を有することが可能であり、この診断はFMLの広いスペクトルの一部であり得ることを確40-43さらに、複数の紡錘細胞脂肪腫、脂肪腫の別のタイプは、また、いくつかの家族で報告されています。44

散発性脂肪腫の発現および直接細胞遺伝学的分析に焦点を当てたいくつかの研究があるが、FMLの憲法上の原因について懸念されている研究はほ大人の2つの広範な脂肪腫シリーズは50から75%まで及ぶ頻度の多数の構造再配列を確認します。10,28,45それらのバランスのとれた染色体の変化の中で、転座t（3;12）（q27-28;q13-15）は、腫瘍のほぼ25％で観察されます。9ほとんどの場合、ブレークポイントは5つのエクソンで構成され、109アミノ酸のタンパク質を生成するHMGA2遺伝子に影響を与えます(図3)。18,46,47Ligonらは、バンド12q14.3（de novo pericentric inversion）に影響を与える憲法上の再配列を持つ八歳の少年のケースを報告し、HMGA2遺伝子を含む。 しかし、体細胞の過剰増殖、骨および歯の年齢の進行、小脳腫瘍、および複数の脂肪腫によって特徴付けられる臨床表現型は、48私たちのcasuisticとは異なります。

我々は、多様な予測プログラムでHMGA2遺伝子のエクソン5のヘテロ接合変異体c.327C>T p.(Asp=)とc.328T>c(p.*110glnext*16)を分析しました。 翻訳停止コドンの変化は100％病原性または高い影響と考えられていたのに対し、同義またはサイレント変化は良性と解釈された。 このようにして、３μ ＵＴＲ（非翻訳）領域を含む変化が、ＨＭＧＡ２遺伝子の腫瘍性形質転換を誘発するであろうことを示すかもしれない。49Fuscoらは、間葉系腫瘍におけるHMGA2遺伝子の重要な役割を強調した。 彼らは、HMGA2遺伝子では、3μ UTR領域は一般的にLet-7miRNAによってサイレンシングされ、このレベルでの変化、切断または異所性配列との融合のいずれかが、そのアップレギュレーションに駆動し、結果的に細胞の異常な複製になることを提案した。46

家族Bでは、母親（B1）のみで両方の新規変異体を検出したことはやや驚くべきことです。 これは、それらがFML表現型と分離しないことを示しており、少なくともこのファミリーでは病因として廃棄されている可能性がある。 一方，患者Ａは同じ二つの新規変異体を提示したが，Ｄｅｒｃｕｍ病を示唆する表現型を示した。 これらの有望な知見にもかかわらず、FMLの影響を受けた他の親戚を評価することは不可能であったため、解釈することはやや困難である。

焦点脂肪浸潤および複数の脂肪腫は、いくつかの症候群に存在する可能性がある。 プロテウス症候群およびクローブ（先天性脂肪腫性非対称過成長、血管奇形、表皮母斑、骨格、および脊髄異常）は、脂肪腫症が存在する体細胞変異の例である。50,51一方、Bannayan-Riley-Rubacalva症候群、多発性内分泌腫瘍1型、カウデン症候群およびガードナー症候群は、付随する脂肪腫症を有する生殖系列変異に起因する状態である。52-55ミトコンドリア機能を含むいくつかの変異でさえ、主に上体幹および首の異常な脂肪組織の成長に関連しており、最良の例はマデルン病である。しかしながら、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＭＥＮ−１、ＰＩＫ３Ｃ Ａ、およびＰＴＥＮの陰性パネルは、少なくともこの研究において、それらがＦＭＬ表現型に関与していることを除外する。

結論

FMLは、Dercum病などの他の皮膚科学的症候群と重複している可能性のあるまれで異種の疾患である。 このシリーズのFMLの自然史は、病変の発症が進行し、中年の個人で最も高い発生率に達したことを明らかにした。 ＦＭＬは両性に影響を与え，四肢と体幹に優勢な地形分布を示した。 評価された患者の性比は女性の有病率を示したが、血統データはよりバランスの取れた分布を示した。 Ｄｅｒｃｕｍ病の診断は一人（患者Ａ）でも認められた。

この分子アプローチは、FMLの遺伝的基盤についてより詳細な洞察を提供し、それに関連する候補遺伝子の最大数を徹底的に調査しようとしました。 我々は、Fmlの完全なスペクトルの理解におけるSanger法に加えて、NGSの有用性を強調した,それは臨床現場でのまれな遺伝的条件の病因同定と特性評価のた HMGA2遺伝子のエクソン5の変異体は記載されておらず、今まで、それらはFMLの起源において不確実な意義を有する。 Fmlにおけるその生物学的機能をより良く決定するためには、より有意な数の影響を受けた個体およびHGMA2遺伝子の新規変異体の機能解析を含むさら