はじめに

好塩性は、高塩分で繁栄している生物の興味深いグループです。 これらの生物は、成長のための最適塩分に基づいて、軽度の好塩類（1-6％、NaCl w/v）、中等度の好塩類（7-15％）および極端な好塩類（15-30％）に大別することができる（Madigan and Martinko、2006）。 広範な研究は、好塩類が生命領域のいずれにも限定されず、真核生物であり得ることを示している（Ｇｕｎｄｅ−Ｃｉｍｅｒｍａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ０；Ｚａｌａｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ５）、または細菌および古細菌のドメインに属する原核生物。 藻類属Dunaliellaおよび塩水エビArtemia（BoetiusおよびJoye、2009）は好塩性真核生物の例であるが、HalobacteriumおよびSalinibacterは好塩性原核生物の例である。 塩辛い環境での生存における好塩菌の成功は、イオンポンピング戦略や有機溶質の蓄積（Oren、2006;Madigan and Martinko、2006）のような独特の生理学的適応によるものである。 ゲノムおよびプロテオームレベルでは、ハロゲン化合物は、高いGC含量および低疎水性、酸性残基の過剰表現、らせん形成の低い傾向およびコイル構造の高, 2008).

好塩菌は高塩濃度で成長し、栽培中の汚染のリスクを最小限に抑えるため、工業用微生物学およびバイオテクノロジーへのアクセスが増えています（Oren、2006）。 生物工学的応用のいくつかの例は、ヌクレアーゼＨを産生するためのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓの使用である（Ｋａｍｅｋｕｒａ ｅ ｌ ａ ｌ． 1982）および醤油の生産および加水分解酵素（アミラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼおよびプロテアーゼ）を含むいくつかの酵素の生産における好塩性Tetragenococcus株の使用（Oren、2006）。 多くのハロゲン化合物が炭化水素および他の毒性化合物を分解することができるので、ハロゲン化合物は生分解および生物化学反応においても重, 1998). ハロゲン化合物はまた、それらの界面活性剤活性および生物乳化特性のために、油回収の促進剤として使用されるポリマーを生成することができる（Oren、2006）。塩類は、海、太陽塩類、天然塩湖など、塩分が高いレベルに達する環境で繁栄しています（Oren、2007）。

塩類は、塩分が高いレベルに達する環境で繁栄しています。

塩類は、塩分が高いレベルに達する環境で繁栄しています ヨルダンの死海は、世界で最大の真の超塩分内陸塩湖の一つです（Boetius and Joye、2009;Oren、2007;Madigan and Martinko、2006）。 高塩分に加えて; 塩、340g以上の濃度L-1（Oren、2007）、死海は、海面下の非常に低い高度、海面よりも8％以上の部分酸素圧力（PIO2）、ユニークなUV放射、低湿度（40％以下）および雨の不足（Avriel et al。, 2011).

本研究は、ヨルダンの死海の沿岸域で繁栄している好塩基性従属栄養細菌種を分類するために行われた。 微生物の分類は、植民地および細胞の形態、ならびに16S rRNA遺伝子の類似性に基づいている。

材料と方法

サンプリング：死海の水のサンプルは、四つの沿岸ゾーンから収集されました（図。 1）月、月、月、月、2011年。 サンプリングサイトの地理座標と標高を表1に示します。 地理的座標および標高は、（Ｅｔｒｅｘ Ｌｅｇｅｎｄ Ｃ，Ｔａｗａｉｎ）によって各位置について決定した。 死海の水のサンプルはびんに十分なヘッドスペースを残す1つのLきれいな生殖不能のガラスビンで集められ、実験室にすぐに運ばれました。サンプルの物理化学的分析

: 水試料の温度，ｐｈ，全溶存固形分（ＴＤＳ）および生物学的酸素要求量（ＢＯＤ）を決定した。 水温，ｐ ｈおよび塩分をｉｎｓｉｔｕで測定した。 水温およびｐＨは、携帯型ｐＨ計（Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ ＰＨ ｍｅｔｅｒ Ｔ１ ９ ０ ０ ０、Ｔｒａｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により測定した。 塩分はハンドヘルド塩分屈折計で測定した。 BOD測定(水環境および乾燥地域研究センターアルal-Bayt大学、ヨルダン). 水試料を新しいガラス瓶に移し、次いで1mLのリン酸緩衝液、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化鉄溶液をリットルの水試料当たり添加した。 次いで、試料を２ ０±３℃の温度にし、有機を含まない濾過空気で飽和させた。 試料のｐＨを確認した。 サンプルが6.5-7.5の範囲になかったら、硫酸か水酸化ナトリウムは必須pHの範囲（6.5-7.5）にサンプルを持って来るために加えられ、加えられた集中 希釈を行う前に試料を２ ０℃の温度にした。 次いで、試料の適切な容積をＢＯＤボトルに移した。 ボトルは、気泡を残さないすべての空気を置換するのに十分な希釈水で満たされていた。 溶存酸素（Ｄ ｏ）をＤ ｏ分析器を用いて測定し，変位した内容物を希釈水とストッパーでしっかりと交換した。 その後、ＤＯを決定し、ＢＯＤを、体積に対する初期ＤＯと最終ＤＯとの間の差に従うように計算した。

濃縮、単離およびグラム染色: 水試料を濃縮するために、死海水（１ ０ｍ Ｌ）を、９ ０ｍ Ｌの液体高塩分培地に移し、振盪（１ ０ ０ｒｐｍ）しながら暗所で３ ０℃でインキュベートした。 約12時間後、濃縮培養のループフルは、変更された固体ミネラル塩培地上に縞状にし、分離されたコロニーは、その後、継代培養しました。 分離株のグリセロール株も調製し、さらなる分析のために-20℃で保存した。 細胞をグラム染色し、顕微鏡下で調べた。

16S rRNA遺伝子配列決定および解析：16S rRNA遺伝子配列の増幅および配列決定は、Macrogen Inc.によって行われた。

16S rRNA遺伝子配列決定およ ５ｍｌの滅菌生理食塩水を含有する１．５ｍｌ遠心分離機管に懸濁し、次いで、１ ０，０ ０ ０ｒｐｍで１ ０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを、０．５ｍｌのＩｎｓｔａｇｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に懸濁し、５ ６℃で３ ０分 加熱後、上清をＰＣＲに使用した。 ＰＣＲは、１μ ｌの鋳型ＤＮＡと２ ０μ ｌのＰＣＲ反応溶液とを混合することによって実施した。 ２ ７Ｆ／１ ４ ９ ２ｒプライマー（２ ７Ｆ：５’−ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＭ ＴＧＧ ＣＴＣ Ａ Ｇ−３’，１ ４ ９ ２Ｒ）（２ ７Ｆ：５’−ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＭ ＴＧＧ ｃｔｃ Ａ Ｇ−３’，１ ４ ９ ２Ｒ: ５’−ＴＡＣ ＧＧＹ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ−３’）を増幅のために使用し、次いで３ ５回の増幅サイクルを９ ４℃で４ ５秒間、５ ５℃で６ ０秒間、および７ ２℃で６ ０秒間行った。 約１，４ ０ ０ｂｐの精製されたＰＣＲ産物を、５ １ ８Ｆ／８ ０ ０ｒプライマー（５ １ ８Ｆ：５’−ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＴＡ ＡＴ Ａ ＣＧ−３’、８ ０ ０Ｒ：５’−ＴＡＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＴＣ Ｔ Ａ Ａ ＴＣＣ−３’）によって配列決定した。 １（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて配列決定を行った。 配列決定産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ３ ７ ３ ０ＸＬ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）でＭａｃｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃのところで分解した。、ソウル、韓国。配列を分析し、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェブサイト（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）を使用して公開ヌクレオチドデータベースと比較した。

配列を分析し、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェブサ 次に、最も近い親戚の配列をデータベースから検索し、MEGA5を使用して系統樹を構築するために使用した（Tamura et al., 2011). ＧＣ含有量配列はオリゴ計算機（＜ｄｉｖ ｉ ｄ＝“６ １ ７ ９ ２ ２ １ｄｆ７”＞＜／ｄｉｖ＞）により計算した。

結果

サンプルの物理化学的性質：死海の水のサンプルは、（36-38％）の範囲で非常に生理食塩水でした。 サンプルのpH値は低く、5.6から6.3の範囲であった。 これは、海水のわずかに酸性の性質を示しています。 BOD値は非常に低かった（1-2mg O2L-1）サンプル中の非常に低い有機材料含有量を示す。 物理化学的性質を表２に示す。従属栄養生菌数：生菌数の結果は、各サンプル（200-6000CFU mL-1）におけるコロニー形成単位の非常に低い数を明らかにした。

従属栄養生菌数：生菌数の結果は、各サンプル（200-6000CFU mL-1）におけるコロニー形成単位の非常に低い数を明らかにした。 CFUカウントを表3に詳細に示します。好塩性従属栄養細菌の単離と分類：この研究では、我々は44好塩性従属栄養細菌株を単離しました。

好塩性従属栄養細菌の単離と分類：この研究では、44の好塩性従属栄養細菌株を単離しました。 44のうちイレブン細菌株は、植民地形態、グラム染色および細胞形態に基づいて異なると考えられていた。 セブンイレブンの異なる株のうち、グラム陽性であり、4のうち7はグラム陰性であった。 細菌株は、16S rRNA遺伝子解析に基づいて同定され、それらは細菌のドメインに属することが判明した。 それぞれの単離された細菌株の最も近い相対的なものを表４および図４に示す。 2. すべての配列は、比較的高いGC含量（最大58％）を示した。

議論

死海の水サンプルの物理化学的性質を決定し、分析しました。 塩分率は非常に高い（最大38％）ことが判明した。 これは死海の水の典型的な特徴であり、有名な“athalassohaline”brines（Oren、2007）の一つです。 死海の水のpHは、タラソハリンブラインのpH（7.5-8）と比較してわずかに酸性（5.6-6.3）であることが判明した（Oren、2007）。 サンプルのBODは、従属栄養細菌によって利用することができる水中の低い有機材料を反映して非常に低かった（1-2mg O2L-1）。 これらの物理化学的条件は間違いなく微生物の多様性に悪影響を及ぼします。 したがって、試験された試料中の生存細胞の数は、外洋水と比較して非常に低かった（6x102CFU mL-1以下）。 海洋水中の従属栄養細菌の数は、通常、１ ０ ５〜１ ０ ６細菌ＭＬ−１の順である（ＺｗｅｉｆｅｌおよびＨａｇｓｔｒｏｍ、１ ９ ９ ５；ＭａｄｉｇａｎおよびＭａｒｔｉｎｋｏ、２ ０ ０ ６）。 これらの数は、通常、生存可能なプレートカウント法よりも高い数を与える非特異的蛍光染色技術（ZweifelおよびHagstrom、1995）に由来する。 死海における細菌数に関する最初の出版物は顕微鏡によって行われた。 細胞数は約1であった。9×106細胞ml1と赤いハロバクテリアの花の間に人口密度は1.9×107に達したが、蛾の後に5×106に減少した（Oren、1983）。

死海に生息する好塩性生物の研究は、1892年に泥からClostridium属から細菌が単離されたときに非常に早い時期に始まりました（Oren、2002）。 その後、1936年に出版された短い記事で、死海の非常に厳しい条件に適応した先住民族の微生物群集の最初の説明を与えた（Oren and Ventosa、1999）。 その時以来、死海の生物学的側面に関する私たちの知識は拡大し、蓄積しています。 本研究では，ヨルダン死海沿岸域で繁栄している好塩基性従属栄養細菌についての知識を拡大するために行った。 我々は、異なる細菌種を単離しました。 その後、我々は単離し、好塩基性細菌の11の異なる種を同定した。 ほとんどの分離株はグラム陽性であった（7のうち11）。 グラム陽性菌は重要な適応を持っているにもかかわらず、高塩分などの環境ストレスでクーデターを起こすことができます（Battistuzzi and Hedges、2009）。 グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌が過敏環境で支配的であるかどうかは文献では明らかではない。 チュニジアの浅いEl-Djerid塩湖からの堆積物から回収された原核生物の好塩菌に関するある研究では、Hedi et al. (2009)は、支配的な細菌集団がグラム陽性胞子形成細菌に属することを見出した。

本研究における単離された株のすべては、細菌のドメインに属しています。

この研究における単離された株のすべて 彼らはドメイン内の7つの異なる属に属しています。 グラム陽性菌分離株のうち五つはバチルス属に属する。 この属は1872年に三つの種を含むように設立されましたが、現在はBergey’s Manual of Systematic Bacteriology(Logan and de Vos,2009)に記載されている142の名前のバチルス種があります。 バチルス菌株は、典型的には土壌株である。 本研究で単離されたｂａｃｉｌｌｕｓ株は，Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂ．ｈｗａｊｉｎｐｏｅｎｓｉｓおよびＢ．ｃｅｒｅｕｓに属する。 これらの株は、異なる塩辛い環境で遭遇した（Ｍｉｒａｎｄａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ８；Ｐａｒｖａｔｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ９；Ｙｏｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ４；Ａ Ｌ−Ｚａｚａｅｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011). 例えば、B. licheniformisは以前にMirandaらによって海洋堆積物から回収された。 ら(2008)により、B.pumilusは、Parvathiらによって堆積物に加えて、カキ、カニおよび魚のような海洋生物から単離された。 (2009). Ｂ．ｈｗａｊｉｎｐｏｅｎｓｉｓは韓国の東海と黄海の海水から回収された（Ｙｏｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2004). そして最後に、一般的な土壌細菌であるb.cereusは、下水水中で遭遇したが、好塩性を有する（Al-ZaZaee et al., 2011). 厚い細胞壁、高いペプチドグリカン含量（細胞壁の90％以上）（Madigan and Martinko、2006）、高いGC含量および耐性胞子形成は、高塩分のような過酷な条件でのバチルス生存の主な理由である。 Dsd32株（b.cereusとして同定される）は、その最も近い相対的なb.cereusと非常に低い類似性を有することに留意すべきである。 この株は、16S rRNA遺伝子に基づいてバチルス属の新種を表すことができます。

他の二つのグラム陽性菌はArthrobacter spの株です。 そしてコクリア・ロゼア。 Arthrobacter種は、自然界、特に土壌中に広く分布している（Funke et al.,1996)しかし、超塩環境ではあまり一般的ではありません。 Kocuria roseaは適度に好塩性種と考えられ、生理食塩水の浅い水のような異なる生理食塩水環境から回収され、Kocuria roseaのいくつかの株は30％のNaCl濃度で最適に成長する（Wright and Tanaka、2002）。

グラム陰性菌は、私たちのサンプル（4のうち11）ではあまり頻繁ではありませんでした。 それにもかかわらず、出版された文献は、これらの分離株が塩辛い環境では珍しいことではないことを示している。 単離された株の一つはｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓと同定された。 後者の種は、実際には海洋試料で一般的である（Molitoris et al.,1985)と海の海水で遭遇しました。 この株は、複雑な皮膚および軟部組織感染を引き起こす可能性があるため、医学的に重要である（Sganga et al., 2009). さらに重要なことに、いくつかのｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ株は、強い神経毒であるテトロドトキシンを産生することが見出された（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1987). この研究で同定された別のグラム陰性細菌は、Chromohalobacter salexigensである。 この種は最初に単離され、適度に好塩性の種Halomonas elongataとして記載され、次にChromohalobacterの新種として提案された（Arahal et al., 2001). この研究で同定された別の種であるErythrobacter gaetbuli。 この株はまた、生理食塩水の生息地のために珍しいことではありません。 最近，韓国の黄海の干潟から単離され，ｙｏｏｎらによって好塩性種として記載された。 (2005). 最後の株はSalinivibrio costicolaに属しています。 この種は最初にＶｉｂｒｉｏｃｏｓｔｉｃｏｌａとして記載されたが，その表現型および遺伝子型の特徴はＶｉｂｒｉｏ属の種と区別された。 したがって、この株は、Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ（Ｍｅｌｌａｄｏ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1996). Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｃｏｓｔｉｃｏｌａは、適度に好塩性であり、もともとは塩漬け食品から単離され、１ ０％塩を含む培地中で最適に成長した（Ｍｅｌｌａｄｏ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1996). Salinibacter属のメンバー、S.ruberは、高塩濃度での微生物の生活への適応の研究のための興味深いモデルである（Oren、2007）。

結論

沿岸域からの死海の水は、高塩分、低pH、低有機材料content有量（低BOD）によって特徴付けられ、Arthrobacter、Kocuria、Vibrio、Salinivibrio、Chromohalobacter、BacillusおよびErythrobacterを含むグラム陽性およびグラム陰性属に属する従属栄養細菌の異なる種を抑制する。

謝辞

この研究は、ヨルダンのAl al-Bayt大学での学術研究のdeanship、会議番号2/2010/2011における科学研究評議会の決定によって支持されました。 したがって、著者は大学が提供する財政援助に感謝したいと考えています。