ブローフライ、Hemipyrellia ligurriens（双翅目：Calliphoridae）の形態と発達率：法医学昆虫学アプリケーション
要約
Hemipyrellia ligurriens（双翅目：Calliphoridae）は、多くの国で提示された法医学的に重要なブローフライ種である。 本研究では，タイ北部のピサヌローク州において，自然環境条件下で飼育されたＨ．ｌｉｇｕｒｒｉｅｎｓの全段階の形態と発生速度を決定した。 光学顕微鏡下での観察に基づくすべての段階の形態学的特徴を記載し，同定目的に使用するために実証した。 また，各段階での開発時間を与えた。 変態を完了するためのH.ligurriensの発達時間;卵、幼虫、蛹から成虫まで、270.71時間の開発の1サイクルを取った。 本研究の結果は，法医学的調査への応用だけでなく，将来の生物学の研究にも有用であると考えられる。
1. はじめに
ブロウバエ（双翅目）の標本: Calliphoridae）、特に死体および/または死のシーンで見つかったフライ幼虫は、法医学的調査、すなわち死後間隔（PMI）を推定し、有毒物質、死後の外傷、および遺骨の移転が起 昆虫標本の正確な形態学的同定は，法医学的調査に関連する証拠を提供するため，適用される観点から非常に重要な要因の一つである。
ブローフライ種の、Hemipyrellia ligurriens（Wiedemann）は、タイとマレーシアの症例から以前に報告されているように、法医学的に重要なブローフライ種です。 このハエの種は、韓国、台湾、ラオス、シンガポール、パプアニューギニア、オーストラリア、インド、中国、フィリピン、スリランカ、マレーシア、インドネシア、タイをカバーし、広く分布しています。 その法医学的重要性に加えて、H.ligurriensは市場や庭園で迷惑になる可能性があり、成人はまた、人間が占有している環境の近くの人間の排泄物への誘引のために、病原体の機械的ベクターである。 以前は、H.ligurriensのいくつかの未熟な段階（卵、第3齢幼虫、および蛹）の形態は、走査型電子顕微鏡および光学顕微鏡下で観察することによってのみ研究されて そのため、H.ligurriensの入手可能な情報は、死のシーンで見つけることができるすべての未熟な証拠を識別するために不完全です。 さらに，ｐｍｉを推定するための重要なデータである本種の発生率は引用文献には見出されていない。 さらに，ｐｍｉを決定するために幼虫年齢を推定するためには，地元の個体群固有の発達データが非常に重要である。 この情報を法医学調査に適用する際の精度と精度を高めるために、それぞれの形態が適切な同定のために重要になる特定の特徴を提供することができ、特定の条件における成長データがPMI推定のために不可欠なデータを提供することができるため、すべての未熟な段階と発達速度の研究は大きな関心を持っている。 そこで，本研究は，特にタイ北部のＰｈｉｔｓａｎｕｌｏｋ州における状態における未熟期の特徴を光学顕微鏡下で観察し，同定のためのいくつかの重要な詳細を与え，その発達速度を決定することを目的とした。
2. 材料および方法
2.1. 実験室でのH.ligurriensの維持
Hのコロニー。 本研究で使用されたligurriensは、もともとタイのピサヌローク州ムアンピサヌローク地区のSao Hin村（16°44’18N;100°13’44E）の地域で掃引ネットで成虫を収集することによっ H.ligurriensのすべての大人は、フィールドで収集され、Tumrasvinらの分類学的キーを使用して、それらの形態に基づいて同定された。 、実験室でさらに飼育される前に。 ハエは，Ｓｕｋｏｎｔａｓｏｎらの方法に従って，開放系飼育室で自然環境条件下で飼育した。 . 簡単には、成体を飼育ケージ（30×30×30cm）に維持し、2種類の食物：（i）10％（w/v）糖溶液および1.5％（v/v）マルチビタミンシロップ溶液（SEVEN SEA、England）および（ii）新鮮な豚肝臓の混合物 新鮮な豚の肝臓は、幼虫の餌と産卵場所として提供されました。 豚の肝臓に卵が存在することが毎日観察された。 卵が見つかったとき、ハエの卵を持つ豚の肝臓を鉗子を用いて幼虫飼育箱に穏やかに移し、その後、2または3個（≥50g/日）の新鮮な豚の肝臓を幼虫の食 新鮮な豚の肝臓のいくつかの部分は、箱の中の幼虫が摂食と移動を停止するか、またはそれらがprepupal段階（後半3instar）になるまで毎日追加されました。 飼育箱に残っていた豚の肝臓はすべて箱から取り除かれました。 さなぎのみを飼育箱に保管し，成虫の出現が見つかるまでしっかりと密封した。 その後、箱から大人を解放して飼育ケージに住むようにするために、箱を飼育ケージに入れて開けました。 上記のように新しいフライ世代が継続的に飼育されました。
2.2. 形態
卵
この研究では、H.ligurriensの卵標本は、Sukontasonらの以前の説明に従って、過マンガン酸カリウム染色技術を用いて明確な特徴を調査するために、実験室 . マイクロパイル周辺の中央領域の形態、絨毛性彫刻などの主な特徴を、デジタルカメラ（Samsung S700、韓国）に接続された光学顕微鏡（Olympus、日本）で観察し、撮影した。 さらに、30個のフライ卵の幅および長さも較正された光学顕微鏡下で測定した。 幅および長さの平均および標準偏差は、Ｅｘｃｅｌプログラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｏｆｆｉｃｅ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ２ ０ ０ ７）を使用して分析した。
幼虫
この研究では、すべての幼虫の段階（第1、第2、および第3齢）における形態および発達速度を決定した。 すべてのinstarsの形態を水酸化物クリア法を用いて調べた。 簡単に説明すると、各幼虫の30匹の幼虫を実験室コロニーから得、それらが収縮するのを防ぐために30秒間温水（80℃）を含むビーカーに入れて犠牲にした。 その後、それらを70％エタノールを含む小さなガラス瓶に保存した。 保存された幼虫を２つの部位で個別に解剖し、ｓｕｋｏｎｔａｓｏｎらによって記載された方法に従って、鋭利な刃を用いて立体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）下で３つの体部を得た。 . 最初のカットは、内部頭咽頭骨格と外部前螺旋を見るために、第二胸部セグメントの中央を横切って配置されました。 第二のカットは、後部スピラクルの特性を観察するために、第11体セグメントを横切って配置されました。 クリア方法として、前部および後部の各ペアを10％（w/v）水酸化カリウム溶液を含むガラス板に1日（1日目）または2日（2日目および3日目）放置した。 続いて、試料を蒸留水で２回洗浄し、３ ５％エタノールおよび１％氷酢酸の混合物を含むガラス板上に３ ０分間置くことによって中和した。 その後、標本は連続的に脱水されました50%, 70%, 80%, 95%, アルコール濃度当たり３ ０分間、絶対エタノール（ＲＣＩ ＬＡＢＳＣＡＮ，Ｔｈａｌｉｄｅ）を添加した。 脱水された試料をキシレン（PROLAB、France）を含有するガラス板上に移し、２〜３滴の取り付け媒体（Permount）でガラススライド上に取り付ける前に１分間放置した。 カバースリップは各標本の上に置かれました。 永久スライドを室温で２日間放置した後、光学顕微鏡下で観察した。 デジタルカメラに接続した光学顕微鏡下で，各頭咽頭骨格と後頭尖頭を撮影した。 さらに，すべてのインスタの体長と幅を調べた。 第一齢幼虫の三十は、校正された顕微鏡を用いて測定したが、第二および第三齢（n=30幼虫/各齢）は、解剖顕微鏡下でバーニアキャリパーで測定した。 体幅と長さの平均と標準偏差をExcelプログラムを用いて分析した。
さなぎ
この段階では、前部および後部の形態および着色変化が研究された。 Ｐｕｐａｒｉａの前部および後部を、Ｓｕｋｏｎｔａｓｏｎらによって以前に記載された水酸化カリウム除去技術を用いて決定した。 . Ｐｕｐａｒｉａの前部は，ハエが出現した後のｐｕｐａｒｉａの第四セグメントへの収縮した頭部の残骸であった。 彼らはすでにハエが出現していた飼育箱から募集されました。 各後部について，蛹の尾部をステレオ顕微鏡下で鋭利な刃で切断し，鉗子を用いて前部と同じガラス板に移した。 その後、それらを１％（ｖ／ｖ）皿洗浄洗剤に浸漬して、表面アーチファクトおよび／または豚の肝臓組織を除去した。 清算方法として、前部および後部を10％（w/v）水酸化カリウム溶液を含む試験管に放置し、試験管を80℃の温度に設定した水浴に1時間移した。 その後、幼虫期について記載したものに従って標本処理を行った。 前部および後部の重要な特徴を観察し、デジタルカメラに接続された光学顕微鏡下で撮影した。 30の前部の各後部のspiracleの乳頭の数は数えられ、その範囲のために計算されました。 さらに，ノギスを用いて幅と長さを測定した。 その幅と長さの平均と標準偏差は、Excelプログラムを使用して分析しました。 着色変化の観察のために、飼育ボックス内のパパリアの色を表す一つのパパリアのみを選択し、で撮影しました0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, そしてデジタルカメラの使用による24のh。 写真を撮る前に、pupariumは表面の人工物を除去するために蒸留水で洗浄された。
大人
若い大人、5–7日古い、試験管を使用してケージ飼育から得られました。 それらを冷蔵庫（-4℃）に2時間置いて犠牲にした。 同定のための重要な特性を調べ，デジタルカメラに接続したステレオ顕微鏡下で撮影した。 さらに，バーニアキャリパーを用いて体幅と長さを測定した。 本研究では、体の幅は第2胸部セグメントの幅を意味し、体の長さは、中複眼から腹部の最後のセグメントに至るまでの体の全長である。 体幅と長さの平均と標準偏差をExcelプログラムを用いて分析した。 2.3.
発達速度評価
発達速度の評価のために、実験は、タイ北部のピサヌローク州の自然周囲温度下でオープンシステム飼育室で行われました。 温度および相対湿度を、温度計および湿度計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｈｙｇｒｏ ＴＭ８ ７ ０、Ｃｈｉｎａ）を使用して毎日記録した。 このハエの発生率を決定するために使用される記録された温度および相対湿度の範囲（平均±SD）は、それぞれ26.7±0.61℃および74±3％であった。 各実験では、新たに孵化した幼虫（または第1齢）の発見から発達速度が始まり、prepupal段階はエンドポイントを意味した。 新たにふ化した幼虫は0時間の古い幼虫として認識された。 本研究における発達速度評価は、同じ成体フライコロニーから新たに孵化した幼虫を3つのグループに分離することによって研究された。 各グループは150-200の新しく孵化した幼虫から成っていた。 それらはぬれたペイントブラシ（数4）の使用によって飼育箱から新しいものに穏やかに移された。 新鮮な豚の肝臓（≧50g）は、各飼育箱の幼虫の食料源として毎日提供された。 それらは、幼虫の収縮を防ぐために温水（≧80℃）に30秒間置くことによって犠牲にされ、70％のエタノールを含む小さなガラス瓶に保存された。 保存されたすべての幼虫は、その大きさに応じて、解剖顕微鏡下で較正された顕微鏡またはバーニアキャリパーを使用して体長を測定した。 Ｅｘｃｅｌプログラムを用いて幼虫の体長と発育時間の関係を解析した。 さらに、他の段階の寿命はExcelプログラムを使用して記録され、分析された。
3. 結果
3.1. 形態
卵
H.ligurriensの卵は、前端と後端の両方で伸長し、先細りになっていた（図1(a)）。 それは長さが1.44±0.11mmおよび幅が0.47±0.04mmを測定した（表1）。 幼虫期に脱皮する前に、この段階で10.3±0.30時間の時間を要した（表1）。 染色されていない卵はクリーミーな白色であったが、1％過マンガン酸カリウムで染色した後の卵は淡褐色であった。 中央領域は背側に位置し、前端からほぼ後端まで伸びたY字状に位置していた（図1(b)）。 孵化線は直立していたため、中央領域に沿って暗い肥厚を示していました（図1（a））。 絨毛膜の彫刻は六角形の模様として現れ、網状の境界は網のようにわずかに隆起していました（図1(c)）。
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過マンガン酸カリウム1％で染色されたHemipyrellia ligurriensの卵。 (a)全卵;MA:中央値の領域. (b)分岐したplastronおよびmicropyleを示す卵の前端;M:micropyle。 (c)網状境界が網のようにわずかに上昇している六角形のパターンを示す外部絨毛性彫刻。 棒はすべての図のための100≤mである。
幼虫
実体顕微鏡で観察すると、H.ligurriensのすべての幼虫は、前方に尖った典型的な筋状の虫状の幼虫を示し、後方に鈍くなった。 尾側セグメントは単一の対の後部螺旋を有していた。 最初の初期は比較的小さく、長さは2.62±0.70mm、幅は0.75±0.35mmであり、この段階での発達時間は12±0.1時間であった（表1）。 頭咽頭骨格は十分に発達していなかった（図2（a））が、後尖頭は腹側に合流する2つの尖頭スリットを有していた（図2（e））。 第二の瞬間は、長さが6.24±1.67mm、幅が1.37±0.19mmであり、この段階では12±3時間の持続時間であった（表1）。 頭咽頭骨格はほぼ完全であった（図2（b））が、後尖頭は弱く色素沈着した不完全な腹膜を有する2つの分離された尖頭スリットを有していた（図2（f））。 3番目の大きさは、長さが12.18±1.31mm、幅が2.32±0.19mmで、最大であった。 発達時間もこの段階で最も長く、84±3hであった（表1）。 初期および後期の第3齢の頭咽頭骨格は類似していた（図2（c）および2（d）、resp。). 初期（図2（g））と後期第3instar（図2（h））の後部螺旋は類似しており、3つの分離された螺旋スリットとスリット間投影を有する完全な螺旋を有していたが、後者は高度に色素化された螺旋を示すことを除いて（図2（h））。 三つのinstarの特徴を表2にまとめた。
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Hemipyrellia ligurriens幼虫の頭咽頭骨格と後螺旋。 （A）第1齢、（b）第2齢、（c）第3齢初期の頭咽頭骨格。 そして、（d）後半3番目のinstar。 （E）第1instar、（f）第2instar、（g）第3instarの初期、および（h）第3instarの後期の後部のspiracles。 棒はすべての図のための100≤mである。
Pupa
H.ligurriensのpupariumは典型的なcoarctate形態であり（図3）、6.82±0を測定した。長さは27mm、幅は2.76±0.11mm(表1)。 観察された色の変化は、初期の蛹は色がクリーム状の白色（0時間）であり、後端はまだ切り捨てられていることを明らかにした（図3（a））。 しかし、蛹の色は蛹化後3時間以内に徐々に淡黄色の茶色に変化し（図3（b））、15時間前後後に茶色に変化した（図3（f））。 蛹の色は約18時間の観察の後に暗褐色に変化した（図3(g))。 24時間では、蛹は最も暗い茶色を示した（図3（i））。 蛹期全体の持続時間は152.5±30.7時間であった（表1）。
(a)
(b)
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Color changes in puparia of Hemipyrellia ligurriens up to 24 h after pupariation. Puparium (a)–(i) at 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, and 24 h, respectively. Bars = 100 𝜇m for all figures.
パリアの前部および後部の観察は、10％水酸化カリウムで処理した後、淡黄褐色の色として現れた。 カバースリップで押された前板は台形状であり、両端に2つの前螺旋が位置していた（図4（a））。 それぞれの前棘突起は5-7個の乳頭からなっていた（図4(b)）。 第三のセグメントで観察された背骨は、単一の尖った先端の行を表示しました(図4(c))。 それぞれの後部の螺旋は、高度に着色された暗褐色の螺旋状のスリットを三つ出現させ、高度に着色されたボタンと弱い着色されたペリトリームを
(a)
(b)
(c)
(d)
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(b)
(c)
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Puparium of Hemipyrellia ligurriens after treating with 10% KOH. (a) Anterior plate with trapezoid shape. (b) Anterior spiracle with 6 papillae. (c)単一ポイント先端を示す第3区分の脊柱パターン。 (d)後部のspiracles。 棒はすべての図のための100≤mである。
大人
大人のH.ligurriensは、長さが12.23±0.61mm、幅が2.85±0.25mm（表1）であり、外観は金属銅緑色で、胸部の前部に灰色がかった白色の花粉症があった（図5（a）および5（b））。 雌の頭部は二光性であったが、雄の頭部は亜光性であった（図5（c）および5（d））。 灰色がかった顔の花粉症は、男女ともに発見された（図5（c）と5（d））、全体の第三の触角セグメントは、腹側に暗褐色またはオレンジ色であった（図5（c）と5（d））。 スクワマは白っぽかった（図5（e））。 Genaは黒い毛で覆われていた（図5(f)）。 茎静脈は節状を有さなかった（図５（ｇ））。 胸郭上に二つの胸膜後突起節が発見された（図5（h））。 上凸性はピローズ毛を発見した（図5(i))。 上記のすべての特性は、このハエの成虫の同定に重要であった。
(a)
(b)
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(d)
(e)
(f)
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(i)
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Adults and important characteristics for identification of Hemipyrellialigurrien. (a) Dorsal view of the female. (b) Dorsal view of the male. (c) Frons of the female showing dichoptic eyes. (d) Frons of the male showing subholoptic eyes. （e）白っぽいsquamae（矢印）を示す大人の側面図。 （f）gena（矢印）に黒い毛を示す頭部のより高い倍率。 （g）茎の静脈を示す翼節（矢印）なし。 （h）背側胸郭。 （i）上凸性（矢印）に毛をピローズ。 棒はすべての図のための200≤mである。
3.2. 発生率の評価
H.ligurriensの発生率の評価は、ピサヌロク州の自然な周囲条件に基づいて、調査期間中に決定されました。 幼虫期の成長曲線はs状結腸型を示した（図6）。 飼育の発達速度に関するデータは、新たに孵化した幼虫から蛹化の開始までの発達時間が108hの総期間で急速に成長することを明らかにした。
自然な周囲条件（26.7±0.61℃）下でのHemipyrellia ligurriensの発生時間と幼虫の長さとの関係; タイ北部のピサヌロク県の74±3％RH）。
4. 議論
研究室での迅速かつ信頼性の高い同定と開発のための重要な昆虫の特性に関連するデータは、法医学調査における適切なアプリケーションの H.ligurriensは、マレーシアとタイの法医学的ケースで記録されている法医学的に重要なブローフライ種です。 本研究では，Ｈのすべての段階を同定するための重要な特性に焦点を当てた。 ligurriens、光学顕微鏡下での観察と平均温度と相対湿度、それぞれ26.7±0.61℃と74±3％であった自然な周囲条件で各段階の発達時間に基づいて。 H.ligurriensのいくつかの段階での形態は、以前に走査型電子顕微鏡と光学顕微鏡を用いて研究されてきたが、本研究は、将来的に法医学的適用の精度と精度を高めるために、簡単な技術を用いて、特徴的な特徴と同定のための新しい手がかりに関するより詳細な情報を提供した。 さらに，本研究はＨ．ｌｉｇｕｒｒｉｅｎｓの発生データを提供し，このフライ種が植民地化した死体のＰＭＩを推定するのに使用することができる。
絨毛膜彫刻だけでなく、中央領域の幅と長さは、フライ卵を識別する上で重要な特性として以前に報告されました。 本研究で観察されたh.ligurriens卵の形態は、1％過マンガン酸カリウムで染色し、光学顕微鏡下で観察することによって観察され、走査型電子顕微鏡を用いて調 したがって、この研究からの結果は、Sukontasonらによって開始された染色法の有効性を確認した。 、はえの卵の同一証明の為に。 染色された卵は光学顕微鏡下ではっきりと観察できた。 これまでの研究とデータを比較すると、本研究のH.ligurriens卵の大きさは、Lucilia cuprina、Ceylonomyia（=Chrysomya）nigripes、Aldrichina grahamiなどの他のブローバエの大きさよりも大きかったが、その大きさはChrysomya megacephalaおよびAchoetandrus（=Chrysomya）rufifaciesの大きさと異ならなかった。 それにもかかわらず、ハエの卵の大きさは、ハエの卵の大きさが食事レベルに依存していることを報告したErzincliogluからの情報によると、同定のための主な特 したがって，フライ卵の同定は，プラストロンの幅の特性，マイクロパイル周辺のプラストロン領域の形態を主な基準として使用し，卵の同定のための補足的な特徴としてサイズを使用すべきである。
私たちの参考文献に基づいて、本研究は、光学顕微鏡下で観察することにより、すべての齢幼虫における頭咽頭骨格および後部スピラクルの形態を示 幼虫の頭咽頭骨格と後棘はそれぞれの齢で明らかに異なっていた。 この研究の結果は以前の報告と一致した。 さらに，各齢におけるペリトームの色素沈着の程度を示した。 これは幼虫の年齢を区別するための新しい手がかりとなる可能性がある。 各発生時期と色素沈着の程度は間違いなく異なるため，本研究のデータは上記のようにこのブローフライの幼虫の幼虫期と年齢を詳細に同定するのに有用であると考えられる。
さなぎ段階の形態に関する研究は、以前の報告と同様の結果を提供した。 Ｈ．ｌｉｇｕｒｒｉｅｎｓｐｕｐａｒｉａの時間による着色変化の観察からの結果は，まず本研究で報告され，ＰＭＩ値の精度を高めるために少なくともｐｕｐａｒｉａのおおよその年齢を決定するための別の新しい支持証拠となる可能性がある。
本研究では、成体H.ligurriensの同定に使用するための特徴的な特徴のいくつかの写真を実証しました。 この研究からの特異な特性のこれらの写真は、分類学的キーの用語に精通していない人々のために有用である可能性があります。 タイにおけるブローフライ種の同定のための現在の分類学的キーは、倉橋とBunchuによって与えられた。 Nonentomologistの肉眼によって、大人H.ligurriensは出現のA.rufifaciesに類似しているようである。 したがって、誤認の可能性は、Aので、特にタイでは、両方の種で発生する可能性があります。 rufifaciesはタイの二番目に優勢なブローフライ種であり、この国のいくつかの州では両方の種の偶然が発見された。
この研究は、すべての段階でH.ligurriensの発達時間を提供した最初の報告でした。 その結果、本研究における自然条件下でのH.ligurriensの発生時間（平均温度26.7±0.61℃、相対湿度74±3％）は、平均温度27.4℃で研究されたc.megacephalaおよびA.rufifaciesの発生時間よりも速 さらに，Ｈ．ｌｉｇｕｒｒｉｅｎｓの各段階の発達時間は，Ｃ．ｍｅｇａｃｅｐｈａｌａおよびＡ．ｒｕｆｉｆａｃｉｅｓのそれとは異なっていた。 それらは同じまたは関連する条件で成長したが、それぞれの種の発達速度が指定された。 さらに，ブローフライ種内の発生時間の変化は地理的に異なる集団で発見された。 Pmiを決定するために幼虫の年齢を推定するためには、地元の人口固有の発達データが必要です。 したがって、この研究からのデータは、特にピサヌロク州でのさらなる適用のために非常に重要です。
形態学的特性と発達時間の両方から得られたデータは、以前の情報を満たし、特にH.ligurriensが人間の死体に存在する場合、このブローフライ種の同定と法医学調査への応用のための新しい支持的証拠を提供する。 さらに、それらは将来の生物学研究におけるベースラインデータとして有用である可能性がある。
謝辞
この研究は、主にNに提供された助成金によってサポートされていました。 ナレスアン大学医学部の文中、タイ研究基金（MRG5280194）の別の人。 著者らはまた、医療バイオテクノロジーの卓越性のセンター、医学学部、ナレスアン大学、および研究管理部門、ナレスアン大学に感謝し、出版コストをサポートし、