il disegno Sperimentale e raccolta di campioni

L’esperimento è stato istituito nel 1982 a Mengcheng contea, provincia di Anhui, Cina (33° 13′ N, 116° 35′ E, di 42 m di altitudine) con la tipica calce concrezione terra nera. La temperatura annuale è di 14,8 °C e la precipitazione annuale è di 872 mm. Cinque trattamenti fitoiatrici con frumento-soia rotazione delle colture, sono stati confrontati in una completamente randomizzato design a blocchi, con quattro repliche (ogni lotto è di 70 m2) : (1) controllo, camere non-fecondazione; (2) NPK, NP fertilizzanti chimici, composto urea (180 kg N ha−1 anno−1), perfosfato (90 kg di P2O5 ha−1 anno−1) e di cloruro di potassio (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK fertilizzanti chimici plus 7500 kg di paglia di frumento ha−1 anno−1; (4) NPK + PM, NPK fertilizzanti chimici più di 15.000 kg suino fresco letame ha−1 anno−1; (5) NPK + CM, fertilizzanti chimici NPK più 30.000 kg di letame fresco di mucca ha−1 anno−1. Nel trattamento NPK + WS, tutta la paglia di grano è stata restituita al campo, il letame di maiale nel trattamento NPK + PM e il letame di mucca nel NPK + CM avevano la stessa quantità di carbonio organico con la paglia di grano aggiunta. Inoltre, questi tipi contrastanti di fertilizzanti inclusi nei nostri trattamenti di fertilizzazione hanno diversi livelli di disponibilità per piante e microbi, ad esempio, da più labili (letame di maiale) a più recalcitranti (paglia di grano e letame di mucca). Abbiamo utilizzato una vasta gamma di trattamenti di fertilizzazione con l’obiettivo di rendere i nostri risultati rappresentativi e applicabili a pratiche di gestione contrastanti.

Abbiamo scavato intorno al gruppo di grano (contenente da 30 a 40 piante di grano durante la fase di riempimento del grano il 20 aprile 2017) per mantenere il sistema radicale il più intatto possibile. Il terreno della rizosfera che è stato strettamente aderito alle radici è stato quindi spazzolato. Allo stesso tempo, il terriccio (0-15 cm di profondità) è stato raccolto come terreno sfuso utilizzando un carotatore a coclea (a circa 20 cm di distanza dalle piante). Il terreno raccolto è stato setacciato attraverso una rete di 2 mm per rimuovere le impurità come radici e pietre. Parte del terreno è stato conservato a 4 °C per le analisi chimiche, e il resto è stato conservato a − 40 °C per l’estrazione del DNA.

Analisi fisico-chimica del suolo

Un phmetro (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Germania) è stato utilizzato per misurare il pH del suolo in un rapporto suolo / acqua distillata di 1:5 (peso / volume). L’umidità del terreno è stata determinata gravimetricamente asciugando 5 g di terreno fresco a circa 105-108 °C per raggiungere un peso costante e quindi calcolando il rapporto peso (acqua evaporata a terreno essiccato). Il contenuto totale di carbonio (TC) e azoto totale (TN) del terreno è stato determinato dalla combustione di terreno essiccato all’aria utilizzando un analizzatore CNS-2000 (LECO, St. Joseph, MI, USA), dopo aver setacciato il terreno attraverso una maglia di 0,15 mm. Il contenuto totale di fosforo (TP) e potassio totale (TK) del terreno sono stati estratti dopo la digestione HF-HClO4 e misurati utilizzando il metodo molibdeno blu e il metodo spettrofotometria di fiamma (FP640, INASA, Cina), rispettivamente. Il carbonio organico disciolto (DOC) è stato estratto aggiungendo 50 mL di acqua distillata a 5 g di terreno fresco, agitando per 1 h e filtrando sotto vuoto attraverso un filtro in fibra di vetro G4 con uno spazio dei pori di 1,2 µm (Fisher), quindi il contenuto di carbonio negli estratti è stato determinato da un analizzatore di carbonio organico totale (multi N/C 3000, Analytik Jena, Germania). Nitrato (NO3 N N), ammonio (NH4+-N) e azoto totale disciolto (DTN) sono stati estratti in un rapporto di 5 g di terreno fresco a 50 mL 2 M KCl. Dopo lo shacking per 1 h, gli estratti sono stati filtrati attraverso un filtro in fibra di vetro G4 con uno spazio dei pori di 1,2 µm (Fisher), quindi è stato utilizzato un sistema analitico a flusso continuo (San++ system, Skalar, Holland) per analizzare il contenuto di NO3 N N, NH4+-N e DTN. L’azoto organico disciolto (DON) è stato calcolato utilizzando la seguente formula: DON = DTN − NH4+-N − NO3 N N. Il fosforo disponibile (AP) nel terreno è stato estratto da 0.5 M NaHCO3 e determinato utilizzando il metodo blu molibdeno. Il potassio disponibile (AK) è stato estratto da 1 M di acetato di ammonio e determinato dal fotometro a fiamma (FP640, INASA, Cina) (file aggiuntivo 3: Appendice 1).

Determinazione dei tassi di fissazione dell’azoto

Il metodo di etichettatura 15N2 è uno dei metodi più comuni e ampiamente applicati utilizzati per misurare i tassi di fissazione N. Cinque grammi di terreno sono stati collocati in tubi di Balch 18 × 150 mm e lo spazio di testa è stato sostituito con aria sintetica contenente 80% 15N2 e 20% O2. I controlli sono stati riempiti con gas N2 senza etichetta ed elaborati in parallelo. I tubi sono stati incubati orizzontalmente al buio a temperatura ambiente per 22 giorni. L’atomo % 15N dei campioni di terreno è stato determinato utilizzando uno spettrometro di massa con rapporto isotopico stabile (Flash 2000 HT / Conflo IV / Delta V, Thermo Fisher Scientific, Germania). Quindi, abbiamo calcolato il tasso di fissazione N potenziale netto confrontando la differenza di 15N totale nei terreni che ricevono 15N2 rispetto al controllo.

High-throughput sequencing e analisi bioinformatica

Per l’estrazione del DNA, 0.5 g di terreno fresco sono stati utilizzati con il kit Fast DNA SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). I geni nifH sono stati amplificati utilizzando coppie di primer nifH-F/nifH-R (5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′) / (5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′) . Le reazioni di PCR sono state eseguite in una reazione di 20 µL contenente 4 µL di tampone 5 × FastPfu, 2 µL di DNTP 2,5 mm, 0,8 µL di primer avanti 5 µM, 0,8 µL di primer inverso 5 µM, 0,4 µL di polimerasi fastPfu, 10 ng di DNA modello e acqua distillata doppia (ddH2O). L’amplificazione è stata eseguita a 95 ° C per 3 min, con 35 cicli di 95 ° C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 45 s e l’estensione a 72 °C per 10 min. Gli ampliconi della PCR sono stati purificati dal corredo di purificazione del DNA del gel dell’agarosio (TaKaRa Bio) e le amplificazioni triplicate della PCR per ogni campione sono state condotte e messe in comune come prodotto della PCR e poi sequenziate sulla piattaforma di Illumina MiSeq PE300 (società di Majorbio a Shanghai, Cina). Dopo il sequenziamento, le sequenze nucleotidiche nifH sono state analizzate utilizzando la pipeline QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/) . In primo luogo, le sequenze di bassa qualità (quelle con un punteggio di qualità < 20, contenenti nucleotidi ambigui, o non corrispondenti al primer e al codice a barre) sono state rimosse e le sequenze rimanenti sono state ulteriormente convertite in sequenze di amminoacidi utilizzando la pipeline FunGene del progetto Ribosomal Database . Le sequenze che codificano le proteine che non corrispondevano alla sequenza proteica nifH o che contenevano codoni di terminazione sono state scartate. Le sequenze rimanenti sono state allineate contro il database dei geni nifH, rimuovendo sia le sequenze fallite che quelle chimeriche. Le restanti sequenze di alta qualità sono state raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) al 95% di somiglianza con UCLUST in esecuzione in modalità de novo, e tutti gli OTU singleton sono stati cancellati.

Analisi della rete di co-occorrenza

Abbiamo costruito una rete di co-occorrenza con tutti i campioni (rizosfera e terreno sfuso) e identificato i principali cluster ecologici di OTU fortemente associati. Sono stati scelti i migliori OTU, che rappresentano oltre l ‘ 80% dell’abbondanza relativa nella comunità totale . Sono state calcolate tutte le correlazioni di Spearman accoppiate tra OTU e sono state rimosse le correlazioni con un coefficiente di Spearman inferiore a 0,65 e un valore P superiore a 0,01. Questo ci ha permesso di concentrarci solo sugli OTU che fortemente co-si sono verificati e hanno maggiori probabilità di interagire tra loro. I moduli principali (cluster ecologici) della rete sono stati visualizzati utilizzando Gephi (https://gephi.org/). L’abbondanza relativa di ciascun ammasso ecologico è stata calcolata facendo una media delle abbondanze relative standardizzate (punteggio z) delle specie che gli appartenevano (file aggiuntivo 3: Appendice 3).

Analisi statistica

I test ANOVA e t a coppie sono stati utilizzati per confrontare le variabili del suolo, i taxa microbici dominanti e la diversità alfa microbica tra diversi trattamenti di fertilizzazione (File aggiuntivo 3: Appendice 1). Questi test sono stati implementati utilizzando SPSS 21. Il test Mantel è stato utilizzato per analizzare le correlazioni tra la comunità diazotrofica e le proprietà fisico-chimiche (file aggiuntivo 3: Appendice 2). Questo è stato eseguito utilizzando il pacchetto “vegan” in R × 32 (3.2.2). Un’analisi delle coordinate principali (PCoA) è stata utilizzata per trovare differenze significative nelle comunità diazotrofiche tra i gruppi di campionamento (File aggiuntivo 3: Appendice 2). Il PCoA è stato eseguito utilizzando il pacchetto” labdsv”R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

Analisi filogenetiche

Il gene nifH fornisce una risoluzione filogenetica sufficiente negli studi ecologici. L’albero filogenetico per i 481 filotipi diazotrofi dominanti nei cluster ecologici è stato costruito usando FastTree e visualizzato usando GraPhlAn . La teoria del campionamento filogenetico può essere utilizzata analiticamente (assumendo il campionamento casuale dall’albero filogenetico come la diversità filogenetica prevista in una comunità locale e quindi confrontando la diversità filogenetica osservata con quelle previsioni) per determinare il grado in cui la comunità diazotrofica appare casuale (tra − 2 e + 2), dispersa eccessivamente (sopra + 2) o raggruppata (sotto-2). La teoria del campionamento filogenetico è stata eseguita utilizzando il pacchetto R “picante”. Un vantaggio del campionamento casuale dell’albero filogenetico regionale è che può essere utilizzato per confrontare campioni di dimensioni disuguali in base al modello di campionamento binomiale . Le differenze tra diversità filogenetica osservata e attesa sono state determinate calcolando e confrontando i punteggi z per ciascun cluster ecologico. Quando la diversità filogenetica osservata è inferiore alla diversità prevista (inferiore a − 2), la comunità microbica nel cluster ecologico è considerata raggruppata filogeneticamente, il che significa che i taxa strettamente correlati hanno maggiori probabilità di essere campionati e selezionati attivamente dall’ambiente .

Structural equation modeling analysis

Il SEM è stato condotto utilizzando IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). È stato utilizzato per valutare gli effetti diretti e indiretti delle proprietà fisico-chimiche del suolo e l’abbondanza relativa dei principali cluster ecologici sui tassi di fissazione N. Le proprietà fisiochimiche del suolo includevano pH del suolo, carbonio totale, azoto totale e fosforo totale. Nel modello, i trattamenti (controllo, NPK , NPK + WS, NPK + PM e NPK + CM) erano variabili categoriali con due livelli: 1 (un particolare trattamento) e 0 (rimanenti trattamenti considerati). Inoltre, il bootstrap è stato utilizzato per testare la probabilità che i coefficienti di percorso differissero da zero, poiché alcune delle variabili non erano normalmente distribuite. Abbiamo anche calcolato gli effetti totali standardizzati (STE) delle proprietà del suolo, dei trattamenti di fertilizzazione e dell’effetto della rizosfera sul tasso di fissazione N per aiutare l’interpretazione del SEM.

Random Forest modeling analysis

Random Forest regression (pacchetto R “randomForest”) è stato utilizzato per regredire gli OTU normalizzati in diversi trattamenti. Il metodo di convalida incrociata di 10 volte è stato utilizzato per determinare l’insieme ottimale di OTU correlato ai tassi di fissazione N. Gli elenchi ordinati di OTU in ordine di foreste casuali hanno riportato punteggi di importanza delle caratteristiche sono stati raggiunti in base all’aumento dell’errore medio-quadrato dei tassi di fissazione dell’azoto previsti su 100 iterazioni dell’algoritmo. I 50 marker OTU sono stati scelti in base agli errori medi al quadrato medio di validazione incrociata minimi, ottenuti da cinque prove della validazione incrociata di 10 volte.